ಪ್ರಸ್ತುತ†ಪ್ರಸ್ತುತ ವಿಳಾಸ: OX11 0DE, UK, ಡೈಮಂಡ್ ಬಿಲ್ಡಿಂಗ್, ಹಾರ್ವೆಲ್ ಸೈನ್ಸ್ ಅಂಡ್ ಇನ್ನೋವೇಶನ್ ಪಾರ್ಕ್, ಡಯಟ್‌ಕೋಟ್, ಆಕ್ಸ್‌ಫರ್ಡ್‌ಶೈರ್, UK, ಡೈಮಂಡ್ ಲೈಟ್ ಸೋರ್ಸ್ ಕಂ., ಲಿಮಿಟೆಡ್, ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನಿಕ್ ಬಯೋಲಾಜಿಕಲ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಸೆಂಟರ್.
ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾ ಕೇಂದ್ರ ಬೆಳಕು-ಕೊಯ್ಲು ಸಂಕೀರ್ಣ 1 (RC-LH1) ನೇರಳೆ ಫೋಟೊಟ್ರೋಫಿಕ್ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಪ್ರಮುಖ ದ್ಯುತಿಸಂಶ್ಲೇಷಕ ಅಂಶವಾಗಿದೆ. ನಾವು ರೋಡೋಪ್ಸುಡೋಮೊನಾಸ್ ಪ್ಯಾಲುಸ್ಟ್ರಿಸ್‌ನಿಂದ RC-LH1 ಸಂಕೀರ್ಣದ ಎರಡು ಕ್ರಯೋ-ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕ ರಚನೆಗಳನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸಿದ್ದೇವೆ. RC-LH114-W ಸಂಕೀರ್ಣದ 2.65-Å ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ರಚನೆಯು RC ಸುತ್ತಮುತ್ತಲಿನ 14 ಉಪಘಟಕ LH1 ಲೂಪ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ, ಇದು ಪ್ರೋಟೀನ್ W ನಿಂದ ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ, ಆದರೆ ಪ್ರೋಟೀನ್-W ಇಲ್ಲದ ಸಂಕೀರ್ಣವು RC ಯಿಂದ ಸುತ್ತುವರೆದಿರುವ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ RC ಸಂಯೋಜನೆಯಾಗಿದೆ. ಮುಚ್ಚಿದ 16 ಉಪಘಟಕ LH1 ಲೂಪ್. ಈ ರಚನೆಗಳ ಹೋಲಿಕೆಯು RC-LH1 ಸಂಕೀರ್ಣದಲ್ಲಿ ಕ್ವಿನೋನ್‌ನ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್‌ನ ಒಳನೋಟಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ, ಇದರಲ್ಲಿ RC QB ಸೈಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಕ್ವಿನೋನ್ ಅನ್ನು ಬಂಧಿಸುವಾಗ ಹಿಂದೆ ನಿರ್ಧರಿಸದ ರೂಪಾಂತರ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಮತ್ತು ಸಹಾಯಕ ಕ್ವಿನೋನ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳ ಸ್ಥಳ ಸೇರಿವೆ, ಇದು ಅವುಗಳನ್ನು RC ಗೆ ರವಾನಿಸಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ. W ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ವಿಶಿಷ್ಟ ರಚನೆಯು LH1 ಲೂಪ್ ಮುಚ್ಚುವಿಕೆಯನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಕ್ವಿನೋನ್/ಕ್ವಿನೋಲೋನ್ ವಿನಿಮಯವನ್ನು ವೇಗಗೊಳಿಸಲು ಒಂದು ಚಾನಲ್ ಅನ್ನು ರಚಿಸುತ್ತದೆ.
ದ್ಯುತಿಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ಒದಗಿಸಲಾದ ಶಕ್ತಿಯು ಭೂಮಿಯ ಮೇಲಿನ ಬಹುತೇಕ ಎಲ್ಲಾ ಜೀವಗಳನ್ನು ಉಳಿಸಿಕೊಳ್ಳಬಲ್ಲದು ಮತ್ತು ಇದು ಸೌರ ಜೈವಿಕ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನಕ್ಕೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ. ಜಾಗತಿಕ ದ್ಯುತಿಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುವಾಗ, ನೇರಳೆ ಫೋಟೊಟ್ರೋಫಿಕ್ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾಗಳು ವಿವಿಧ ಶಕ್ತಿ ವಿಧಾನಗಳು ಮತ್ತು ಚಯಾಪಚಯ ಸಾಮರ್ಥ್ಯಗಳನ್ನು ಸಹ ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತವೆ. ಅವು ದ್ಯುತಿಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ ಹೆಟೆರೊಟ್ರೋಫಿಕ್ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾಗಳಾಗಿ ಬೆಳೆಯಬಹುದು, ಸಾರಜನಕ ಮತ್ತು ಇಂಗಾಲದ ಡೈಆಕ್ಸೈಡ್ ಅನ್ನು ಸರಿಪಡಿಸಬಹುದು, ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಆರೊಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಸಂಯುಕ್ತಗಳನ್ನು ಕೆಡಿಸಬಹುದು (1-3). ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳಿಗೆ ಶಕ್ತಿಯನ್ನು ಒದಗಿಸಲು, ಬೆಳಕನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ರಾಸಾಯನಿಕ ಶಕ್ತಿಯನ್ನಾಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಬೇಕು. ಬೆಳಕು-ಬಲೆಗೆ ಬೀಳಿಸುವ ಆಂಟೆನಾ ಸಂಕೀರ್ಣವು ಬೆಳಕನ್ನು ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಿಕ್ಕಿಬಿದ್ದ ಶಕ್ತಿಯನ್ನು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾ ಕೇಂದ್ರಕ್ಕೆ (RC) ವರ್ಗಾಯಿಸಿದಾಗ ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಚಾರ್ಜ್ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುತ್ತದೆ (4 - 7). ನೇರಳೆ ಫೋಟೊಟ್ರೋಫಿಕ್ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದಲ್ಲಿನ ದ್ಯುತಿಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಮೂಲ ಘಟಕವು ಟೈಪ್ 2 RC ಯಿಂದ ಕೂಡಿದ್ದು, ಬೆಳಕು-ಕೊಯ್ಲು ಸಂಕೀರ್ಣ 1 (LH1) ನಿಂದ ಸುತ್ತುವರೆದಿದೆ, ಇದು RC-LH1 ಕೋರ್ ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ. LH1 ಬಾಗಿದ αβ ಹೆಟೆರೊಡೈಮರ್‌ಗಳ ಒಂದು ಶ್ರೇಣಿಯಿಂದ ರೂಪುಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ, ಪ್ರತಿಯೊಂದೂ ಎರಡು ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಕ್ಲೋರೊಫಿಲ್ (BChl) ಮತ್ತು ಒಂದು ಅಥವಾ ಎರಡು ಕ್ಯಾರೊಟಿನಾಯ್ಡ್‌ಗಳನ್ನು (8-12) ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ. ಸರಳವಾದ LH1 ಆಂಟೆನಾವು RC (9-13) ಅನ್ನು ಮುಚ್ಚಿದ ಲೂಪ್‌ನಲ್ಲಿ ಸುತ್ತುವರೆದಿರುವ 16 ಅಥವಾ 17 αβ ಹೆಟೆರೊಡೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ, ಆದರೆ ಇತರ ಕೋರ್ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳಲ್ಲಿ, ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಸುತ್ತಮುತ್ತಲಿನ LH1 ನ ನಿರಂತರತೆಯನ್ನು ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸುತ್ತವೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ RC ಮತ್ತು ಸೈಟೋಕ್ರೋಮ್ bc1 ಸಂಕೀರ್ಣದ ನಡುವಿನ ಕ್ವಿನಾಲ್/ಕ್ವಿನೋನ್ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ (11, 13-15). ನೇರಳೆ ಫೋಟೊಟ್ರೋಫಿಕ್ ಸಸ್ಯ ರೋಡೋಪ್ಸುಡೋಮೊನಾಸ್ (Rps.) ದ್ಯುತಿಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸುವ ಶಕ್ತಿ ಮತ್ತು ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್ ವರ್ಗಾವಣೆಯನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಬಲ್ಲ ಒಂದು ಮಾದರಿ ಜೀವಿಯಾಗಿದೆ. Rps ನ ಮೊದಲ ಸ್ಫಟಿಕ ರಚನೆ. ಪ್ಯಾಲುಸ್ಟ್ರಿಸ್ RC-LH1 ಸಂಕೀರ್ಣದ ಮಾದರಿಯು RC ಆಗಿದೆ, ಇದು 15 ಹೆಟೆರೊಡೈಮೆರಿಕ್ LH1 ಲೂಪ್‌ಗಳಿಂದ ಆವೃತವಾಗಿದೆ, ಇವುಗಳನ್ನು "ಪ್ರೋಟೀನ್ W" (14) ಎಂಬ ಅಜ್ಞಾತ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನಿಂದ ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪ್ರೋಟೀನ್-W ಅನ್ನು ನಂತರ RPA4402 ಎಂದು ಗುರುತಿಸಲಾಯಿತು, ಇದು ಮೂರು ಊಹಿಸಲಾದ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಹೆಲಿಕ್ಸ್‌ಗಳನ್ನು (TMH) ಹೊಂದಿರುವ ಗುಣಲಕ್ಷಣವಿಲ್ಲದ 10.5kDa ಪ್ರೋಟೀನ್ ಆಗಿದೆ (16). RC-L, M (pufL, pufM) ಮತ್ತು LH1α, β (pufA, pufB) ಉಪಘಟಕಗಳನ್ನು ಎನ್ಕೋಡಿಂಗ್ ಮಾಡುವ ಜೀನ್‌ಗಳಿಗೆ ಬಳಸುವ ನಾಮಕರಣಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ rpa4402 ಜೀನ್ ಎನ್‌ಕೋಡಿಂಗ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ W ಅನ್ನು pufW ಎಂದು ಮರುನಾಮಕರಣ ಮಾಡಲು ನಾವು ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸುತ್ತೇವೆ. ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ಪ್ರೋಟೀನ್-W RC-LH1 ನ ಸುಮಾರು 10% ರಷ್ಟು ಮಾತ್ರ ಇರುತ್ತದೆ, ಇದು Rps. ಪ್ಯಾಲುಸ್ಟ್ರಿಸ್ ಎರಡು ವಿಭಿನ್ನ RC-LH1 ಸಂಕೀರ್ಣಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸುತ್ತದೆ. ಇಲ್ಲಿ, ನಾವು ಎರಡು ಕೋರ್ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳ ಹೆಚ್ಚಿನ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ಕ್ರಯೋ-EM (ಕ್ರಯೋ-EM) ರಚನೆಗಳನ್ನು ವರದಿ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ, ಒಂದು ಪ್ರೋಟೀನ್ W ಮತ್ತು 14 αβ ಹೆಟೆರೊಡೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಇನ್ನೊಂದು ಪ್ರೋಟೀನ್ W ಮತ್ತು ಮುಚ್ಚಿದ 16 ಹೆಟೆರೊಡೈಮರ್ LH1 ಲೂಪ್ ಇಲ್ಲದೆ. ನಮ್ಮ ರಚನೆಯು Rps. ಪ್ಯಾಲುಸ್ಟ್ರಿಸ್‌ನ RC-LH1 ಸಂಕೀರ್ಣದ ತಿಳುವಳಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಒಂದು ಹಂತದ ಬದಲಾವಣೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ, ಏಕೆಂದರೆ ನಾವು ಪ್ರತಿಯೊಂದು ರೂಪಾಂತರದ ಏಕರೂಪದ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮತ್ತು ಬೌಂಡ್ ವರ್ಣದ್ರವ್ಯಗಳು ಮತ್ತು ಸಂಬಂಧಿತ ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಕ್ವಿನೋನ್‌ಗಳನ್ನು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿ ನಿಯೋಜಿಸಲು ಸಾಕಷ್ಟು ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದೇವೆ. ಈ ರಚನೆಗಳ ಹೋಲಿಕೆಯು ಇಲ್ಲಿಯವರೆಗೆ ಯಾವುದೇ ಇತರ RC-LH1 ಸಂಕೀರ್ಣದಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರದ ಮೂರು TMH ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು-W ಕ್ವಿನೋನ್/ಕ್ವಿನೋನ್ ವಿನಿಮಯವನ್ನು ವೇಗಗೊಳಿಸಲು ಕ್ವಿನೋನ್ ಚಾನಲ್ ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಹಲವಾರು ಸಂರಕ್ಷಿತ ಲಿಪಿಡ್ ಮತ್ತು ಕ್ವಿನೋನ್ ಬಂಧಿಸುವ ತಾಣಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಕ್ವಿನೋನ್ ಮತ್ತು RC ಸಂಯೋಜನೆಯ ನಂತರ ನಾವು ಹೊಸ ರೂಪಾಂತರ ಬದಲಾವಣೆಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಆಮ್ಲಜನಕಯುಕ್ತ ಫೋಟೋಟ್ರೋಫಿಕ್ ಜೀವಿಗಳ ಫೋಟೋಸಿಸ್ಟಮ್ II (PSII) RC ಗೆ ಸೂಕ್ತವಾಗಿರಬಹುದು. ನಮ್ಮ ಸಂಶೋಧನೆಗಳು ನೇರಳೆ ಫೋಟೋಟ್ರೋಫಿಕ್ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ RC-LH1 ಕೋರ್ ಸಂಕೀರ್ಣದಲ್ಲಿ ಕ್ವಿನೋನ್/ಕ್ವಿನೋನ್ ಬಂಧಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ವಿನಿಮಯದ ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರದ ಬಗ್ಗೆ ಹೊಸ ಒಳನೋಟಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತವೆ.
Rps. palustris ನಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಎರಡು ಸಂಕೀರ್ಣಗಳ ವಿವರವಾದ ಅಧ್ಯಯನವನ್ನು ಸುಗಮಗೊಳಿಸುವ ಸಲುವಾಗಿ, ನಾವು ಪ್ರತಿ RC-LH1 ಅನ್ನು ಜೀವರಾಸಾಯನಿಕ ವಿಧಾನಗಳ ಮೂಲಕ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸುತ್ತೇವೆ. ಪ್ರೋಟೀನ್ W-ಕೊರತೆಯ ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು (ಇನ್ನು ಮುಂದೆ ΔpufW ಎಂದು ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ) pufW ಜೀನ್ ಇಲ್ಲದ ತಳಿಯಿಂದ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ (16), ಮತ್ತು ಕೇವಲ ಒಂದು RC-LH1 ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಬಹುದು. ಪ್ರೋಟೀನ್ W-ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ಒಂದು ತಳಿಯಿಂದ ಉತ್ಪಾದಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಈ ತಳಿಯ ಪ್ರೋಟೀನ್ W ಅನ್ನು ಅದರ C-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ 10x ಹಿಸ್ ಟ್ಯಾಗ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಮಾರ್ಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ W-ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ಲೋಹವನ್ನು ನಿಶ್ಚಲಗೊಳಿಸುವ ಮೂಲಕ ಹೆಚ್ಚಿನ ಕೊರತೆಯಿರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್ W ನೊಂದಿಗೆ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಸಂಯೋಜಿಸಬಹುದು. ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (16) ಅಫಿನಿಟಿ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿ (IMAC).
ಚಿತ್ರ 1 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ, ಎರಡೂ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳು LH1 ಆಂಟೆನಾದಿಂದ ಸುತ್ತುವರೆದಿರುವ ಮೂರು ಉಪ-ಘಟಕ RC (RC-L, RC-M ಮತ್ತು RC-H) ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತವೆ. ಪ್ರೋಟೀನ್-W ಕೊರತೆಯಿರುವ ಸಂಕೀರ್ಣದ 2.80-A ರಚನೆಯು 16 αβ ಹೆಟೆರೊಡೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು RC ಅನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಸುತ್ತುವರೆದಿರುವ ಮುಚ್ಚಿದ LH1 ಲೂಪ್ ಅನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ, ಇನ್ನು ಮುಂದೆ RC-LH116 ಸಂಕೀರ್ಣ ಎಂದು ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪ್ರೋಟೀನ್-W-ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಸಂಕೀರ್ಣದ 2.65Å ರಚನೆಯು ಪ್ರೋಟೀನ್-W ನಿಂದ ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸಲ್ಪಟ್ಟ 14-ಹೆಟೆರೊಡೈಮರ್ LH1 ಅನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಇನ್ನು ಮುಂದೆ RC-LH114-W ಎಂದು ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.
(A ಮತ್ತು B) ಸಂಯುಕ್ತದ ಮೇಲ್ಮೈ ಪ್ರಾತಿನಿಧ್ಯ. (C ಮತ್ತು D) ರಾಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾದ ಬಂಧಿತ ವರ್ಣದ್ರವ್ಯಗಳು. (E ಮತ್ತು F) ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ಮೇಲ್ಮೈಯಿಂದ ಗಮನಿಸಿದ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳು ಕಾರ್ಟೂನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುವ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು LH1 ಉಪಘಟಕಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್-W ಅಂತರದಿಂದ ಪ್ರದಕ್ಷಿಣಾಕಾರವಾಗಿ ಸಂಖ್ಯೆಗಳನ್ನು ನೀಡಲಾಗುತ್ತದೆ [Rba ಸಂಖ್ಯೆಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತದೆ. ಸ್ಫೇರಾಯ್ಡ್ಸ್ ಸಂಕೀರ್ಣ (13)]. LH1-α ಗೆ, ಪ್ರೋಟೀನ್ ಉಪಘಟಕದ ಬಣ್ಣ ಹಳದಿ; LH1-β ಗೆ, ಪ್ರೋಟೀನ್ ಉಪಘಟಕದ ಬಣ್ಣ ನೀಲಿ; ಪ್ರೋಟೀನ್-W ಗೆ, ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕೆಂಪು; RC-H ಗೆ, ಇದು ಸಯಾನ್; RC-L ಗೆ, ಇದು ಕಿತ್ತಳೆ; RC-M ಗೆ, ಮೆಜೆಂಟಾ. ಸಹಅಂಶಗಳನ್ನು ರಾಡ್‌ಗಳಿಂದ ಪ್ರತಿನಿಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಹಸಿರು BChl ಮತ್ತು BPh a ಅಣುಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ, ನೇರಳೆ ಕ್ಯಾರೊಟಿನಾಯ್ಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಹಳದಿ UQ10 ಅಣುಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. (G ಮತ್ತು H) RC-LH114-W ಸಂಕೀರ್ಣ (G) ಮತ್ತು RC-LH116 ಸಂಕೀರ್ಣ (H) ನ ಸಮಾನ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್-W ಅಂತರದ ವರ್ಧಿತ ನೋಟ. ಸಹಅಂಶಗಳನ್ನು ಜಾಗ ತುಂಬುವಿಕೆಯ ರೂಪದಲ್ಲಿ ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಚೆಲೇಟೆಡ್ ಕ್ವಿನೋನ್ ಅನ್ನು ನೀಲಿ ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪ್ರೋಟೀನ್-W ಅಂತರವನ್ನು (G) ನಲ್ಲಿ ನೀಲಿ ಡ್ಯಾಶ್ ಮಾಡಿದ ರೇಖೆಯಿಂದ ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು LH116 ಉಂಗುರದ ಮೇಲೆ ಕ್ವಿನೋನ್/ಕ್ವಿನೋಲೋಲ್ ಹರಡುವ ಸಣ್ಣ ರಂಧ್ರಗಳನ್ನು (H) ನಲ್ಲಿ ಕಪ್ಪು ಡ್ಯಾಶ್ ಮಾಡಿದ ರೇಖೆಯಿಂದ ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಚಿತ್ರ 1 (A ಮತ್ತು B) LH1αβ ಹೆಟೆರೊಡೈಮರ್‌ಗಳ ತೆರೆದ ಅಥವಾ ಮುಚ್ಚಿದ ಶ್ರೇಣಿಗಳಿಂದ ಸುತ್ತುವರೆದಿರುವ RC ಅನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಪ್ರತಿಯೊಂದೂ ಎರಡು BChl ಮತ್ತು ಒಂದು ಕ್ಯಾರೊಟಿನಾಯ್ಡ್ ಅನ್ನು ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 1, C ಮತ್ತು D). ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳು Rps LH1 ಸಂಕೀರ್ಣವಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿವೆ. ಸ್ಪಿರುಲಿನಾ ಕ್ಸಾಂಥಿನ್‌ನ ಜೈವಿಕ ಸಂಶ್ಲೇಷಣಾ ಮಾರ್ಗದಲ್ಲಿ, ಈ ಪ್ರಭೇದಗಳು ಕ್ಯಾರೊಟಿನಾಯ್ಡ್‌ಗಳ ಮಿಶ್ರ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ (17). ಆದಾಗ್ಯೂ, ಸ್ಪಿರೊಪಿರೊಕ್ಸಾಂಥಿನ್ ಪ್ರಬಲವಾದ ಕ್ಯಾರೊಟಿನಾಯ್ಡ್ ಆಗಿದೆ ಮತ್ತು ಅದರ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ತೃಪ್ತಿಕರವಾಗಿದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ನಾವು ಎಲ್ಲಾ LH1 ಬಂಧಿಸುವ ತಾಣಗಳಲ್ಲಿ ಸ್ಪಿರೊಕ್ಸಾಂಥಿನ್ ಅನ್ನು ಮಾದರಿ ಮಾಡಲು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ. ಆಲ್ಫಾ ಮತ್ತು ಬೀಟಾ ಪಾಲಿಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಸಣ್ಣ ಪೊರೆಯ ಹೊರ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಏಕ TMH ಗಳಾಗಿವೆ (ಚಿತ್ರ 1, A, B, E, ಮತ್ತು F). C-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ 17 ಅವಶೇಷಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಗಮನಿಸದಿದ್ದರೂ, ಆಲ್ಫಾ ಪಾಲಿಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನ್ನು Met1 ರಿಂದ Ala46 ಗೆ ಎರಡೂ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳಲ್ಲಿ ಸೀಳಲಾಯಿತು. RC-LH116 ನಲ್ಲಿ β ಪಾಲಿಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನ್ನು Gly4 ನಿಂದ Tyr52 ಗೆ ಮತ್ತು RC-LH114-W ನಲ್ಲಿ Ser5 ನಿಂದ Tyr52 ಗೆ ಇಳಿಸಲಾಯಿತು. 3 ಅಥವಾ 4 N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಅಥವಾ 13 C-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಅವಶೇಷಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ S1). ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಸ್ಟ್ರೈನ್‌ನಿಂದ ತಯಾರಿಸಲಾದ ಮಿಶ್ರ RC-LH1 ಸಂಕೀರ್ಣದ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಕಾಣೆಯಾದ ಪ್ರದೇಶವು ಈ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಹೆಟೆರೊಲಾಜಸ್ ಸೀಳುವಿಕೆಯ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ S1 ಮತ್ತು S2). α-Met1 ನ N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಫಾರ್ಮೈಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ಸಹ ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ (f). α-ಪೆಪ್ಟೈಡ್ fMet1 ನಿಂದ Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 ಗೆ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ ಎಂದು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ತೋರಿಸಿದೆ ಮತ್ತು β-ಪೆಪ್ಟೈಡ್ Ser2 ನಿಂದ Ala53 ಗೆ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ, ಇದು ಕಡಿಮೆ-ತಾಪಮಾನದ EM ಸಾಂದ್ರತೆಯ ನಕ್ಷೆಯೊಂದಿಗೆ ಉತ್ತಮ ಒಪ್ಪಂದದಲ್ಲಿದೆ.
α-His29 ಮತ್ತು β-His36 ನ ಸಮನ್ವಯವು BChls ಅನ್ನು ಮುಖಾಮುಖಿಯಾಗಿ ಮಾಡುತ್ತದೆ; ಪ್ರತಿ αβ ಹೆಟೆರೊಡೈಮರ್ ತನ್ನ ನೆರೆಹೊರೆಯವರೊಂದಿಗೆ ಒಟ್ಟುಗೂಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು RC ಸುತ್ತಲೂ ತೆರೆದ ಲೂಪ್ (RC-LH114-W) ಅಥವಾ ಮುಚ್ಚಿದ ಲೂಪ್ (RC-LH116) ಅನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ. ಎಕ್ಸಿಟಾನ್ ಕಪಲ್ಡ್ ಪಿಗ್ಮೆಂಟ್ ಅರೇ (ಚಿತ್ರ 1, C ಮತ್ತು D). RC-LH114-W ನ 877 nm ಬ್ಯಾಂಡ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, RC-LH116 ನ 880 nm ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಕೆಂಪು ಶಿಫ್ಟ್ 3 nm ಆಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 2A). ಆದಾಗ್ಯೂ, ವೃತ್ತಾಕಾರದ ಡೈಕ್ರೊಯಿಸಂ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್ ಬಹುತೇಕ ಒಂದೇ ಆಗಿರುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 2B), ಇದು ತೆರೆದ ಮತ್ತು ಮುಚ್ಚಿದ ಲೂಪ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ಸ್ಪಷ್ಟ ವ್ಯತ್ಯಾಸವಿದ್ದರೂ, BChls ನ ಸ್ಥಳೀಯ ಪರಿಸರವು ತುಂಬಾ ಹೋಲುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಕೆಂಪು ಶಿಫ್ಟ್ ಕಡಿಮೆಯಾದ ಉಷ್ಣ ಚಲನೆ ಮತ್ತು ಮುಚ್ಚಿದ ಲೂಪ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿದ ಸ್ಥಿರತೆಯ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿರಬಹುದು (18, 19), ಮುಚ್ಚಿದ ಲೂಪ್‌ನಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ವರ್ಣದ್ರವ್ಯ ಜೋಡಣೆಯಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆ (20, 21), ಅಥವಾ ಈ ಎರಡು ಪರಿಣಾಮಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿರಬಹುದು (11).
(ಎ) ನೇರಳಾತೀತ/ಗೋಚರ/ಸಮೀಪ-ಅತಿಗೆಂಪು ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ವರ್ಣಪಟಲ, ಇವುಗಳ ಶಿಖರಗಳನ್ನು ಅವುಗಳ ಅನುಗುಣವಾದ ವರ್ಣದ್ರವ್ಯಗಳಿಂದ ಗುರುತಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 775 nm ನಲ್ಲಿ BPh ಗರಿಷ್ಠಕ್ಕೆ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. (ಬಿ) ವೃತ್ತಾಕಾರದ ಡೈಕ್ರೊಯಿಸಂ ವರ್ಣಪಟಲವನ್ನು 805 nm ನಲ್ಲಿ BChl ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಗೆ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. (ಸಿ ಮತ್ತು ಡಿ) RC-LH114-W ಸಂಕೀರ್ಣ (C) ಮತ್ತು RC-LH116 ಸಂಕೀರ್ಣ (D) ದ ಸಮಯ-ಪರಿಹರಿಸಿದ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ವರ್ಣಪಟಲದಿಂದ ΔA ವರ್ಣಪಟಲವನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಉತ್ತಮ ಹೋಲಿಕೆಗಾಗಿ, ಎಲ್ಲಾ ವರ್ಣಪಟಲಗಳನ್ನು 0.2 ps ನಲ್ಲಿ −A ನ ∆A ಗೆ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. (ಇ) UQ2 ನ ವಿವಿಧ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ವಿಕಿರಣದ ನಂತರ ಸೈಟೋಕ್ರೋಮ್ c2 ಆಕ್ಸಿಡೀಕರಣದ ದರ (ಕಚ್ಚಾ ದತ್ತಾಂಶಕ್ಕಾಗಿ ಚಿತ್ರ S8 ನೋಡಿ). (ಎಫ್) ಕಡಿಮೆ, ಮಧ್ಯಮ ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ ತೀವ್ರತೆಯ ಬೆಳಕಿನಲ್ಲಿ ಬೆಳೆದ ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ (ಕ್ರಮವಾಗಿ 10, 30 ಅಥವಾ 300μMm-2 s-1), ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಸಂಕೀರ್ಣ ಮತ್ತು ಬೇರ್ಪಡಿಸಿದ ಪೊರೆಯ ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ W ಮತ್ತು RC-L ಉಪಘಟಕಗಳು. SDS-ಪಾಲಿಅಕ್ರಿಲಮೈಡ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಮತ್ತು ಇಮ್ಯುನೊಅಸ್ಸೇ ಮೂಲಕ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮಟ್ಟವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಿ (ಕಚ್ಚಾ ದತ್ತಾಂಶಕ್ಕಾಗಿ ಚಿತ್ರ S9 ನೋಡಿ). ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ RC-LH114-W ಸಂಕೀರ್ಣಕ್ಕೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಅನುಪಾತವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಿ. ಸಂಕೀರ್ಣದ RC-L ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್-W ನಡುವಿನ ಸ್ಟೊಚಿಯೊಮೆಟ್ರಿಕ್ ಅನುಪಾತವು 1:1 ಆಗಿದೆ.
RC-LH114-W ನ ವಿರೂಪಗೊಂಡ αβ14 ಲೂಪ್‌ನಲ್ಲಿ 1 ನೇ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿರುವ BChls (ಚಿತ್ರ 1, A, C, ಮತ್ತು E) RC ಪ್ರಾಥಮಿಕ ದಾನಿ (P) ಗೆ RC-LH116 ನಲ್ಲಿನ ಸಮಾನವಾದ BChls ಗಿಂತ 6.8Å ಹತ್ತಿರದಲ್ಲಿದೆ (ಚಿತ್ರ 1, B, D, ಮತ್ತು F, ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ S3); ಆದಾಗ್ಯೂ, ಎರಡು ಸಂಕೀರ್ಣಗಳ ಅಸ್ಥಿರ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರವು RC-LH114-W ಮತ್ತು RC-LH116 ಗಾಗಿ, LH1 ನಿಂದ RC ವರೆಗಿನ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ಶಕ್ತಿ ವರ್ಗಾವಣೆ ಸಮಯ ಸ್ಥಿರಾಂಕಗಳು 40 ±4 ಮತ್ತು 44±3 ps ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 2). , C ಮತ್ತು D, ಚಿತ್ರ S4 ಮತ್ತು ಕೋಷ್ಟಕ S2). RC ಒಳಗೆ ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನಿಕ್ ವರ್ಗಾವಣೆಯಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಗಮನಾರ್ಹ ವ್ಯತ್ಯಾಸವಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ S5 ಮತ್ತು ಸಂಬಂಧಿತ ಪೂರಕ ಪಠ್ಯ). LH1 ಮತ್ತು RC-P ನಡುವಿನ ಶಕ್ತಿ ವರ್ಗಾವಣೆ ಸಮಯದ ನಿಕಟ ಪತ್ರವ್ಯವಹಾರವು ಎರಡು LH1 ಲೂಪ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ BChl ನ ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ದೂರ, ಕೋನ ಮತ್ತು ಸಂಭಾವ್ಯ ಶಕ್ತಿಯ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿರುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಅನುಮಾನಿಸುತ್ತೇವೆ. ಕನಿಷ್ಠ ದೂರವನ್ನು ತಲುಪಲು LH1 ಶಕ್ತಿಯ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಅನ್ವೇಷಿಸುವುದು ಸಬ್‌ಆಪ್ಟಿಮಲ್ ಸೈಟ್‌ಗಳಿಂದ RC ಗೆ ನೇರ ಶಕ್ತಿ ವರ್ಗಾವಣೆಗಿಂತ ವೇಗವಾಗಿಲ್ಲ ಎಂದು ತೋರುತ್ತದೆ. RC-LH114-W ನಲ್ಲಿರುವ ಓಪನ್-ಲೂಪ್ LH1 ಲೂಪ್ ರಚನಾತ್ಮಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಅತ್ಯಲ್ಪ ಉಷ್ಣ ಚಲನೆಗೆ ಒಳಗಾಗಬಹುದು ಮತ್ತು RC 1 ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ βBChls ನ ವರ್ಣದ್ರವ್ಯದ ದೂರದಿಂದ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಉದ್ದವಾದ αβ14 ರಿಂಗ್ ರಚನೆ ಇರುತ್ತದೆ.
RC-LH116 ಸಂಕೀರ್ಣವು 32 BChls ಮತ್ತು 16 ಕ್ಯಾರೊಟಿನಾಯ್ಡ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಮತ್ತು ಅದರ ಒಟ್ಟಾರೆ ಜೋಡಣೆಯು ಥರ್ಮೋಕ್ರೊಮೇಟಿಯಮ್ (Tch.) ಪಿಡ್‌ಪಿಡಮ್ [ಪ್ರೋಟೀನ್ ಡೇಟಾ ಬ್ಯಾಂಕ್ (PDB) ID 5Y5S] (9), ಥಿಯೋರ್ಹೋಡೋವಿಬ್ರಿಯೊ (Trv.) 970 ಸ್ಟ್ರೈನ್ (PDB ID 7C9R) (12) ಮತ್ತು ಹಸಿರು ಪಾಚಿ (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) ನಿಂದ ಪಡೆದಂತೆಯೇ ಇರುತ್ತದೆ. ಜೋಡಣೆಯ ನಂತರ, αβ ಹೆಟೆರೊಡೈಮರ್‌ಗಳ ಸ್ಥಾನಗಳಲ್ಲಿ ಸಣ್ಣ ವಿಚಲನಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಗಮನಿಸಲಾಯಿತು, ವಿಶೇಷವಾಗಿ 1-5, 15, ಮತ್ತು 16 (ಚಿತ್ರ S6). ಪ್ರೋಟೀನ್-W ಇರುವಿಕೆಯು LH1 ನ ರಚನೆಯ ಮೇಲೆ ಗಮನಾರ್ಹ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ. ಇದರ ಮೂರು TMH ಗಳು ಸಣ್ಣ ಲೂಪ್‌ಗಳಿಂದ ಸಂಪರ್ಕ ಹೊಂದಿವೆ, ಸಂಕೀರ್ಣದ ಲುಮೆನ್ ಬದಿಯಲ್ಲಿ N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಮತ್ತು ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ಬದಿಯಲ್ಲಿ C-ಟರ್ಮಿನಲ್ (ಚಿತ್ರಗಳು 1A ಮತ್ತು 3, A ನಿಂದ D). ಪ್ರೋಟೀನ್-W ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಹೈಡ್ರೋಫೋಬಿಕ್ ಆಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3B), ಮತ್ತು TMH2 ಮತ್ತು TMH3 LH1αβ-14 ನೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸಿ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಮೇಲ್ಮೈಯನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತವೆ (ಚಿತ್ರ 3, B ಮತ್ತು E ನಿಂದ G). ಇಂಟರ್ಫೇಸ್ ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ Phe, Leu ಮತ್ತು Val ಅವಶೇಷಗಳಿಂದ ಕೂಡಿದೆ. ಈ ಅವಶೇಷಗಳು ಹೈಡ್ರೋಫೋಬಿಕ್ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳು ಮತ್ತು αβ-14 ವರ್ಣದ್ರವ್ಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಜೋಡಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿರುತ್ತವೆ. ಕೆಲವು ಧ್ರುವೀಯ ಅವಶೇಷಗಳು ಸಂಕೀರ್ಣ ಕುಹರದ ಮೇಲ್ಮೈಯಲ್ಲಿ W-Thr68 ಮತ್ತು β-Trp42 ನಡುವಿನ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಬಂಧವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಂತೆ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗೆ ಕೊಡುಗೆ ನೀಡುತ್ತವೆ (ಚಿತ್ರ 3, F ಮತ್ತು G). ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸಂನ ಮೇಲ್ಮೈಯಲ್ಲಿ, Gln34 αβ-14 ಕ್ಯಾರೊಟಿನಾಯ್ಡ್‌ಗಳ ಕೀಟೋ ಗುಂಪಿನ ಪಕ್ಕದಲ್ಲಿದೆ. ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, n-ಡೋಡೆಸಿಲ್ β-d-ಮಾಲ್ಟೋಸೈಡ್ (β-DDM) ಅಣುವನ್ನು ಪರಿಹರಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಅದರ ಹೈಡ್ರೋಫೋಬಿಕ್ ಬಾಲವು ಪ್ರೋಟೀನ್-W ಮತ್ತು αβ-14 ನಡುವಿನ ಇಂಟರ್ಫೇಸ್‌ಗೆ ವಿಸ್ತರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿತು ಮತ್ತು ಲಿಪಿಡ್ ಬಾಲವು ದೇಹದಲ್ಲಿ ನೆಲೆಗೊಂಡಿರಬಹುದು. ಪ್ರೋಟೀನ್ W ಮತ್ತು RCH ನ C-ಟರ್ಮಿನಲ್ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ಪ್ರದೇಶಗಳು ತುಂಬಾ ಹತ್ತಿರದಲ್ಲಿವೆ, ಆದರೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಸಂವಹನಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುವ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿಲ್ಲ ಎಂದು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 1, A ಮತ್ತು E). ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ಎರಡು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಪರಿಹರಿಸದ C-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳಲ್ಲಿ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳು ಇರಬಹುದು, ಇದು RC-LH114-W ಸಂಕೀರ್ಣದ ಜೋಡಣೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್-W ನ ನೇಮಕಾತಿಗೆ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಒದಗಿಸಬಹುದು.
(A) ಕಾರ್ಟೂನ್ ರೂಪದಲ್ಲಿ LH1αβ14 ಜೊತೆ ಇಂಟರ್ಫೇಸ್ ಅನ್ನು ಎದುರಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್-W, ರಾಡ್-ಆಕಾರದ ಸೈಡ್ ಚೈನ್ (ಕೆಂಪು) ಅನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದು, ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಸಂಭಾವ್ಯ ರೇಖಾಚಿತ್ರದ ಒಂದು ಭಾಗದಲ್ಲಿ ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (0.13 ರ ಬಾಹ್ಯರೇಖೆಯ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಪಾರದರ್ಶಕ ಬೂದು ಮೇಲ್ಮೈ). (B) ಹೈಡ್ರೋಫೋಬಿಕ್ ಬಣ್ಣದ ಮೇಲ್ಮೈಯಿಂದ ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್-W. ಧ್ರುವೀಯ ಮತ್ತು ಚಾರ್ಜ್ಡ್ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ಸಯಾನ್ ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಹೈಡ್ರೋಫೋಬಿಕ್ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ಬಿಳಿ ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಬಲವಾಗಿ ಹೈಡ್ರೋಫೋಬಿಕ್ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ಕಿತ್ತಳೆ ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. (C ಮತ್ತು D) ಕಾರ್ಟೂನ್‌ನಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್-W, ಅದರ ದೃಷ್ಟಿಕೋನವು (A) (C) ನಲ್ಲಿರುವಂತೆಯೇ ಇರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 180° (D) ನಿಂದ ತಿರುಗುತ್ತದೆ. ಅನುಕ್ರಮದಲ್ಲಿನ ಸ್ಥಾನದ ಪ್ರಕಾರ, ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಬಹುದಾದ ಅವಶೇಷಗಳು ಮಳೆಬಿಲ್ಲಿನ ಬಣ್ಣದ ಯೋಜನೆಯನ್ನು ಅಳವಡಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ, ಅಲ್ಲಿ N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ನೀಲಿ ಬಣ್ಣದ್ದಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು C-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣದ್ದಾಗಿರುತ್ತದೆ. (E) (A) ನಲ್ಲಿರುವಂತೆಯೇ ಅದೇ ನೋಟದಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್-W, ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್-W:LH1 ನ ಇಂಟರ್ಫೇಸ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಲಗತ್ತಿಸಲಾದ ಗುರುತುಗಳೊಂದಿಗೆ ರಾಡ್‌ಗಳಿಂದ ಪ್ರತಿನಿಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. (F) ಕಾರ್ಟೂನ್ ಪ್ರಾತಿನಿಧ್ಯದಲ್ಲಿ (E) ಮತ್ತು LH1αβ14 ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಮತ್ತು ಬಾರ್ ಪ್ರಾತಿನಿಧ್ಯದಲ್ಲಿ ಇಂಟರ್ಫೇಸ್ ಅವಶೇಷಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಪ್ರೋಟೀನ್-W ಅನ್ನು 90° ತಿರುಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಬೀಟಾ ಪಾಲಿಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನಿಂದ ಮೇಲಕ್ಕೆ ನೇತಾಡುವ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಚಿತ್ರ 1 ರ ಬಣ್ಣಕ್ಕೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುವ ಬಾರ್ ಆಗಿ ಕೊಫ್ಯಾಕ್ಟರ್ ಅನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ, ಕೊಳೆತ β-DDM ಅನ್ನು ಬೂದು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಆಮ್ಲಜನಕವನ್ನು ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. (G) (F) ನಲ್ಲಿರುವ ನೋಟವನ್ನು 180° ತಿರುಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಆಲ್ಫಾ ಪಾಲಿಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ ಪ್ರಮುಖ ಅವಶೇಷಗಳೊಂದಿಗೆ.
ಪ್ರೋಟೀನ್-W αβ ಹೆಟೆರೊಡೈಮರ್ ಅನ್ನು (ಚಿತ್ರ 1F ನಲ್ಲಿ 15 ನೇ) ಬದಲಾಯಿಸುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಲೂಪ್ ಮುಚ್ಚುವಿಕೆಯನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮೊದಲ ಮೂರು αβ ಹೆಟೆರೊಡೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಓರೆಯಾಗಿಸುತ್ತದೆ. ಫಿಲ್ಮ್ ನಾರ್ಮಲ್‌ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಮೊದಲ αβ-1 ಹೆಟೆರೊಡೈಮರ್‌ನ ಗರಿಷ್ಠ ಇಳಿಜಾರಿನ ಕೋನವು 25° ರಿಂದ 29° (ಚಿತ್ರ 1, A ಮತ್ತು E) ಎಂದು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದು RC A ತೀಕ್ಷ್ಣವಾದ ಕಾಂಟ್ರಾಸ್ಟ್-LH116 ನಲ್ಲಿ αβ-1 ನ 2° ರಿಂದ 8° ಇಳಿಜಾರಿನಿಂದ ರೂಪುಗೊಂಡಿದೆ (ಚಿತ್ರ 1, B ಮತ್ತು F). ಎರಡನೇ ಮತ್ತು ಮೂರನೇ ಹೆಟೆರೊಡೈಮರ್‌ಗಳು ಕ್ರಮವಾಗಿ 12° ರಿಂದ 22° ಮತ್ತು 5° ರಿಂದ 10° ವರೆಗೆ ಇಳಿಜಾರಾಗಿರುತ್ತವೆ. RC ಯ ಸ್ಟೀರಿಕ್ ಅಡಚಣೆಯಿಂದಾಗಿ, αβ-1 ನ ಓರೆಯು αβ ನ ಎರಡನೇ ಜೋಡಿಯನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವುದಿಲ್ಲ (ಇದು ಚಿತ್ರ 1F ನಲ್ಲಿ 16 ನೇ αβ ಗೆ ಅನುರೂಪವಾಗಿದೆ), ಹೀಗಾಗಿ LH1 ರಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಸ್ಪಷ್ಟ ಅಂತರವನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 1, A ಮತ್ತು E). ಎರಡು αβ ಹೆಟೆರೊಡೈಮರ್‌ಗಳ ಕೊರತೆಯಿಂದಾಗಿ, ನಾಲ್ಕು BChl ಮತ್ತು ಎರಡು ಕ್ಯಾರೊಟಿನಾಯ್ಡ್‌ಗಳ ನಷ್ಟದೊಂದಿಗೆ, ಯಾವುದೇ ಕ್ಯಾರೊಟಿನಾಯ್ಡ್‌ಗಳು ತಿರುಚಿದ αβ-1 ಉಪಘಟಕಕ್ಕೆ ಬಂಧಿಸುವುದಿಲ್ಲ, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ 13 ಕ್ಯಾರೊಟಿನಾಯ್ಡ್‌ಗಳು ಸಸ್ಯಾಹಾರಿ ಮತ್ತು 28 BChls ಹೊಂದಿರುವ LH114-W ಉಂಗುರವಾಗುತ್ತದೆ. αβ1 ರಿಂದ 7 ಪ್ರದೇಶಗಳಲ್ಲಿನ ಎರಡು ಸಂಕೀರ್ಣಗಳ ಸ್ಥಳೀಯ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ಅಂದಾಜುಗಳು LH1 ಲೂಪ್‌ನ ಉಳಿದ ಭಾಗಗಳಿಗಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿರುತ್ತವೆ, ಇದು RC QB ಸೈಟ್‌ಗೆ ಪಕ್ಕದಲ್ಲಿರುವ LH1 ಉಪಘಟಕದ ಅಂತರ್ಗತ ಪ್ಲಾಸ್ಟಿಟಿಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸಬಹುದು (ಚಿತ್ರ 4).
RC-LH114-W (A ಮತ್ತು B) ಮತ್ತು RC-LH116 (C ಮತ್ತು D) ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಚಿತ್ರ 1 (B ಮತ್ತು D) ನ ಅದೇ ಮೇಲಿನ ನೋಟ/ಪಾರ್ಶ್ವ ನೋಟ (A ಮತ್ತು B) (A ಮತ್ತು C) ಮತ್ತು ಕುಹರದ ಮೇಲ್ಮೈಯಿಂದ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಬಣ್ಣದ ಕೀಲಿಗಳನ್ನು ಬಲಭಾಗದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.
1:14 ರ ಸ್ಟೊಯಿಕಿಯೊಮೆಟ್ರಿಕ್ ಅನುಪಾತವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಏಕೈಕ ವಿಶಿಷ್ಟ ಕೋರ್ ಸಂಕೀರ್ಣವೆಂದರೆ ರೋಡೋಕೊಕಸ್ ಸ್ಫೇರಾಯ್ಡ್ಸ್ (Rba.) RC-LH1-PufX ಡೈಮರ್ (13). ಆದಾಗ್ಯೂ, ಪ್ರೋಟೀನ್ W ಮತ್ತು PufX ಯಾವುದೇ ಸ್ಪಷ್ಟ ಹೋಮೋಲಜಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಅವುಗಳ LH1 ರಚನೆಗಳ ಮೇಲೆ ಗಮನಾರ್ಹ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತವೆ. PufX ಎಂಬುದು N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ಡೊಮೇನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಒಂದೇ TMH ಆಗಿದ್ದು ಅದು Rps. palustris LH116αβ-16 ಗೆ ಅನುಗುಣವಾದ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ RC-H ಉಪಘಟಕದ (13) ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ಬದಿಯೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸುತ್ತದೆ. PufX RC-LH1 ಮತ್ತು ಸೈಟೋಕ್ರೋಮ್ bcl ಸಂಕೀರ್ಣದ ನಡುವೆ ಕ್ವಿನೋನ್/ಕ್ವಿನೋಲೋನ್ ವಿನಿಮಯಕ್ಕಾಗಿ ಒಂದು ಚಾನಲ್ ಅನ್ನು ರಚಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಾ Rba. ಸ್ಫೇರಾಯ್ಡ್ಸ್ ಕೋರ್ ಸಂಕೀರ್ಣದಲ್ಲಿ (13) ಇರುತ್ತದೆ. ಮಾನೋಮರ್-ಮಾನೋಮರ್ ಇಂಟರ್ಫೇಸ್ Rba ನಲ್ಲಿದೆ. RC-LH114-W ನಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ W ನ ಬಂಧಕ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಸ್ಫೇರಾಯ್ಡ್ಸ್ RC-LH1-PufX ಡೈಮರ್ ಇದೆ, ಮತ್ತು PufX ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್-W ನಿಂದ ಪ್ರೇರಿತವಾದ ಅಂತರವು ಸಮಾನ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿದೆ (ಚಿತ್ರ S7A). RC-LH114-W ನಲ್ಲಿನ ಅಂತರವು ಸ್ಯೂಡೋಮೊನಾಸ್ ರೋಸಿಯಾ LH1 ನ ಕಾಲ್ಪನಿಕ ಕ್ವಿನೋನ್ ಚಾನಲ್ (8) ನೊಂದಿಗೆ ಸಹ ಜೋಡಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ, ಇದು ಪ್ರೋಟೀನ್ W ಅಥವಾ PufX ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳಿಂದ ರೂಪುಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ S7B). ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, Blc ಯಲ್ಲಿ ಕ್ವಿನೋನ್ ಚಾನಲ್. ಒಂದು γ ಉಪಘಟಕವನ್ನು (7) ಹೊರತುಪಡಿಸಿ ರೂಪುಗೊಂಡ ಪಚ್ಚೆ ಹಸಿರು LH1 ಇದೇ ರೀತಿಯ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿದೆ (ಚಿತ್ರ S7C). ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಂದ ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ವಹಿಸಿದ್ದರೂ, RC-LH1 ಸಂಕೀರ್ಣದಲ್ಲಿ ಸಾಮಾನ್ಯ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಈ ಕ್ವಿನೋನ್/ಕ್ವಿನೋಲೋಲ್ ಚಾನಲ್‌ಗಳ ನೋಟವು ಒಮ್ಮುಖ ವಿಕಾಸದ ಉದಾಹರಣೆಯಾಗಿ ತೋರುತ್ತದೆ, ಇದು ಪ್ರೋಟೀನ್ W ನಿಂದ ರಚಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಅಂತರವು ಕ್ವಿನೋನ್ ಚಾನಲ್ ಆಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
LH114-W ಲೂಪ್‌ನಲ್ಲಿನ ಅಂತರವು RC-LH114-W ಸಂಕೀರ್ಣದ ಆಂತರಿಕ ಸ್ಥಳ ಮತ್ತು ಬೃಹತ್ ಪೊರೆಯ ನಡುವೆ ನಿರಂತರ ಪೊರೆಯ ಪ್ರದೇಶದ ರಚನೆಗೆ ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 1G), ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಲ್ಲಿರುವಂತೆ ಪ್ರೋಟೀನ್ ರಂಧ್ರದ ಮೂಲಕ ಎರಡು ಡೊಮೇನ್‌ಗಳನ್ನು ಸಂಪರ್ಕಿಸುವ ಬದಲು. RC-LH116 ಸಂಕೀರ್ಣವು ಮುಚ್ಚಿದ Tch ಅನ್ನು ಹೋಲುತ್ತದೆ. ಸೂಜಿಯಂತಹ ಸಂಕೀರ್ಣ (22) (ಚಿತ್ರ 1H). ಪೊರೆಯ ಮೂಲಕ ಕ್ವಿನೋನ್‌ನ ಪ್ರಸರಣವು ಕಿರಿದಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಚಾನಲ್ ಮೂಲಕ ಪ್ರಸರಣಕ್ಕಿಂತ ವೇಗವಾಗಿರುವುದರಿಂದ, ತೆರೆದ LH114-W ಲೂಪ್ ಮುಚ್ಚಿದ LH116 ಲೂಪ್‌ಗಿಂತ ವೇಗವಾಗಿ RC ವಹಿವಾಟನ್ನು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು RC ಗೆ ಕ್ವಿನೋನ್‌ನ ಪ್ರಸರಣವು ಹೆಚ್ಚು ನಿರ್ಬಂಧಿತವಾಗಿರಬಹುದು. ಪ್ರೋಟೀನ್ W RC ಮೂಲಕ ಕ್ವಿನೋನ್‌ಗಳ ಪರಿವರ್ತನೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆಯೇ ಎಂದು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, ನಾವು ಯುಬಿಕ್ವಿನೋನ್ 2 (UQ2) ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಮೇಲೆ ಸೈಟೋಕ್ರೋಮ್ ಆಕ್ಸಿಡೀಕರಣ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ (ಕಡಿಮೆ ಐಸೊಪ್ರೀನ್ ಬಾಲವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ನೈಸರ್ಗಿಕ UQ10 ನ ಅನಲಾಗ್) (ಚಿತ್ರ 2E). ಚೆಲೇಟೆಡ್ ಕ್ವಿನೋನ್‌ನ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯು ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ಮೈಕೆಲಿಸ್ ಸ್ಥಿರಾಂಕದ ನಿಖರವಾದ ನಿರ್ಣಯಕ್ಕೆ ಅಡ್ಡಿಯಾಗುತ್ತದೆ (RC-LH114-W ಮತ್ತು RC-LH116 ಕ್ರಮವಾಗಿ 0.2±0.1μM ಮತ್ತು 0.5±0.2μM ಗೆ ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ), RC-LH114-W ನ ಗರಿಷ್ಠ ದರ (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) ಗಿಂತ 28±5% ದೊಡ್ಡದಾಗಿದೆ.
ಕೋರ್ ಸಂಕೀರ್ಣದ ಸುಮಾರು 10% ರಷ್ಟು ಪ್ರೋಟೀನ್-W ಇದೆ ಎಂದು ನಾವು ಆರಂಭದಲ್ಲಿ ಅಂದಾಜಿಸಿದ್ದೇವೆ (16); ಇಲ್ಲಿ, ಕಡಿಮೆ-ಬೆಳಕಿನ, ಮಧ್ಯಮ-ಬೆಳಕಿನ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ-ಬೆಳಕಿನ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಕೋಶಗಳ ಆಕ್ಯುಪೆನ್ಸಿ ದರಗಳು ಕ್ರಮವಾಗಿ 15±0.6%, 11±1% ಮತ್ತು 0.9±0.5 ಆಗಿವೆ (ಚಿತ್ರ 2F). ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿಯ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಹೋಲಿಕೆಯು ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್ ಟ್ಯಾಗ್‌ನ ಸೇರ್ಪಡೆಯು ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ತಳಿಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಪ್ರೋಟೀನ್-W ನ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಸಮೃದ್ಧಿಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲಿಲ್ಲ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (P = 0.59), ಆದ್ದರಿಂದ ಈ ಮಟ್ಟಗಳು ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್-W ನ ಕಲಾಕೃತಿಯಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ S10). ಆದಾಗ್ಯೂ, RC-LH1 ಸಂಕೀರ್ಣದಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್-W ನ ಈ ಕಡಿಮೆ ಆಕ್ಯುಪೆನ್ಸಿ ಕೆಲವು RC ಗಳು ವೇಗವರ್ಧಿತ ದರದಲ್ಲಿ ತಿರುಗಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ RC-LH116 ಸಂಕೀರ್ಣದಲ್ಲಿ ನಿಧಾನವಾದ ಕ್ವಿನೋನ್/ಕ್ವಿನೋಲೋನ್ ವಿನಿಮಯವನ್ನು ತಗ್ಗಿಸುತ್ತದೆ. ಇತ್ತೀಚಿನ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೋಮಿಕ್ಸ್ ಡೇಟಾದೊಂದಿಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಬೆಳಕಿನ ಆಕ್ಯುಪೆನ್ಸಿ ದರವು ಅಸಮಂಜಸವಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಬಲವಾದ ಬೆಳಕಿನಲ್ಲಿ pufW ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ S11) (23). RC-LH1 ಸಂಕೀರ್ಣದಲ್ಲಿ pufW ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್-W ಸಂಯೋಜನೆಯ ನಡುವಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸವು ಗೊಂದಲಮಯವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಸಂಕೀರ್ಣ ನಿಯಂತ್ರಣವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸಬಹುದು.
RC-LH114-W ನಲ್ಲಿ, 6 ಕಾರ್ಡಿಯೋಲಿಪಿನ್ (CDL), 7 ಫಾಸ್ಫಾಟಿಡಿಲ್ಕೋಲಿನ್ (POPC), 1 ಫಾಸ್ಫಾಟಿಡಿಲ್ಗ್ಲಿಸೆರಾಲ್ (POPG) ಮತ್ತು 29 β-DDM ಅಣುಗಳನ್ನು ಹಂಚಿಕೆ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಅದರಲ್ಲಿ ಮಾದರಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ 6 CDL ಗಳು, 24 POPC ಗಳು, 2 POPG ಗಳು ಮತ್ತು 12 βDDM ಗಳು. RC-LH116 (ಚಿತ್ರ 5, A ಮತ್ತು B). ಈ ಎರಡು ರಚನೆಗಳಲ್ಲಿ, CDL ಬಹುತೇಕ ಸಂಕೀರ್ಣದ ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ಬದಿಯಲ್ಲಿದೆ, ಆದರೆ POPC, POPG ಮತ್ತು β-DDM ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಲುಮಿನಲ್ ಬದಿಯಲ್ಲಿವೆ. RC-LH114-W ಸಂಕೀರ್ಣದ αβ-1 ರಿಂದ αβ-6 ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಎರಡು ಲಿಪಿಡ್ ಮತ್ತು ಡಿಟರ್ಜೆಂಟ್ ಅಣುಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 5A), ಮತ್ತು ಐದು RC-LH116 ನ ಸಮಾನ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 5B). ಸಂಕೀರ್ಣದ ಇನ್ನೊಂದು ಬದಿಯಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳು ಕಂಡುಬಂದಿವೆ, ಮುಖ್ಯವಾಗಿ CDL, RC ಮತ್ತು αβ-7 ರಿಂದ αβ-13 ರ ನಡುವೆ ಸಂಗ್ರಹವಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 5, A ಮತ್ತು B). ಇತರ ರಚನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಪರಿಹರಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಮಾರ್ಜಕಗಳು LH1 ಉಂಗುರದ ಹೊರಗೆ ನೆಲೆಗೊಂಡಿವೆ ಮತ್ತು ಉತ್ತಮವಾಗಿ ಪರಿಹರಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಅಸಿಲ್ ಸರಪಳಿಗಳು LH1 ಉಪಘಟಕಗಳ ನಡುವೆ ವಿಸ್ತರಿಸುತ್ತವೆ, ತಾತ್ಕಾಲಿಕವಾಗಿ RC-LH114-W ನಲ್ಲಿ β-DDM ಎಂದು ಗೊತ್ತುಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು RC ನಲ್ಲಿ β-DDM ಎಂದು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲಾಗಿದೆ β-DDM ಮತ್ತು POPC-LH116 ನ ಮಿಶ್ರಣ. ನಮ್ಮ ರಚನೆಯಲ್ಲಿ ಚೆಲೇಟಿಂಗ್ ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಡಿಟರ್ಜೆಂಟ್‌ಗಳ ಇದೇ ರೀತಿಯ ಸ್ಥಾನಗಳು ಅವು ಶಾರೀರಿಕವಾಗಿ ಸಂಬಂಧಿತ ಬಂಧಕ ತಾಣಗಳಾಗಿವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ (ಚಿತ್ರ S12A). Tch ನಲ್ಲಿನ ಸಮಾನ ಅಣುಗಳ ಸ್ಥಾನಗಳು ಸಹ ಉತ್ತಮ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ. ಸೌಮ್ಯ ಮತ್ತು Trv. ಸ್ಟ್ರೈನ್ 970 RC-LH1s (ಚಿತ್ರ S12, B ನಿಂದ E) (9, 12) ಮತ್ತು ಲಿಪಿಡ್ ಹೆಡ್ ಗುಂಪಿನ ಹೈಡ್ರೋಜನ್-ಬಂಧದ ಅವಶೇಷಗಳು ಅನುಕ್ರಮ ಜೋಡಣೆಯಲ್ಲಿ (ಚಿತ್ರ S13) ಸಾಕಷ್ಟು ಉತ್ತಮ ಸಂರಕ್ಷಣೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಿವೆ, ಇದು RC (24) ಗೆ ಬಂಧಿಸುವ ಸಂರಕ್ಷಿತ CDL ಅನ್ನು RC-LH1 ಸಂಕೀರ್ಣದಲ್ಲಿ ಸಂರಕ್ಷಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
(A ಮತ್ತು B) RC-LH114-W (A) ಮತ್ತು RC-LH116 (B) ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಕಾರ್ಟೂನ್‌ಗಳಿಂದ ಪ್ರತಿನಿಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ವರ್ಣದ್ರವ್ಯಗಳನ್ನು ರಾಡ್‌ಗಳಿಂದ ಪ್ರತಿನಿಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಚಿತ್ರ 1 ರಲ್ಲಿನ ಬಣ್ಣ ಪದ್ಧತಿಯನ್ನು ಬಳಸಿ. ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳನ್ನು ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಡಿಟರ್ಜೆಂಟ್‌ಗಳನ್ನು ಬೂದು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. RC QA ಮತ್ತು QB ಸೈಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಬದ್ಧವಾಗಿರುವ UQ ಹಳದಿ ಬಣ್ಣದ್ದಾಗಿರುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾದ UQ ನೀಲಿ ಬಣ್ಣದ್ದಾಗಿರುತ್ತದೆ. (C ಮತ್ತು D) ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳನ್ನು ಬಿಟ್ಟುಬಿಡುವುದರೊಂದಿಗೆ (A) ಮತ್ತು (B) ನಂತಹ ಅದೇ ನೋಟಗಳು. (E ನಿಂದ G) RC-LH116 ನಿಂದ Q1(E), Q2(F) ಮತ್ತು Q3(G) ನ ವಿಸ್ತೃತ ನೋಟ, ಪರಸ್ಪರ ಪ್ರಭಾವ ಬೀರುವ ಅಡ್ಡ ಸರಪಳಿಗಳೊಂದಿಗೆ. ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಬಂಧಗಳನ್ನು ಕಪ್ಪು ಡ್ಯಾಶ್ ಮಾಡಿದ ರೇಖೆಗಳಾಗಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.
RC-LH116 ರಲ್ಲಿ, ಚಾರ್ಜ್ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್ ವರ್ಗಾವಣೆಯಲ್ಲಿ ಭಾಗವಹಿಸುವ RC QA ಮತ್ತು QB UQ ಎರಡೂ ಅವುಗಳ ಬಂಧಕ ತಾಣಗಳಲ್ಲಿ ವಿಭಜನೆಯಾಗುತ್ತವೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, RC-LH114-W ನಲ್ಲಿ, QB ಕ್ವಿನೋನ್ ಅನ್ನು ಪರಿಹರಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಕೆಳಗೆ ವಿವರವಾಗಿ ಚರ್ಚಿಸಲಾಗುವುದು. QA ಮತ್ತು QB ಕ್ವಿನೋನ್‌ಗಳ ಜೊತೆಗೆ, ಎರಡು ಚೆಲೇಟೆಡ್ UQ ಅಣುಗಳನ್ನು (RC ಮತ್ತು LH1 ಉಂಗುರಗಳ ನಡುವೆ ಇದೆ) RC-LH114-W ರಚನೆಯಲ್ಲಿ ಅವುಗಳ ಉತ್ತಮವಾಗಿ ಪರಿಹರಿಸಲಾದ ಮುಖ್ಯ ಗುಂಪುಗಳ ಪ್ರಕಾರ (ಕ್ರಮವಾಗಿ Q1 ಮತ್ತು Q2 ನಲ್ಲಿ ಇದೆ) ಹಂಚಿಕೆ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸ್ಥಳ). ಚಿತ್ರ 5C). ಎರಡು ಐಸೊಪ್ರೀನ್ ಘಟಕಗಳನ್ನು Q1 ಗೆ ನಿಗದಿಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಸಾಂದ್ರತೆಯ ನಕ್ಷೆಯು Q2 ನ ಸಂಪೂರ್ಣ 10 ಐಸೊಪ್ರೀನ್ ಬಾಲಗಳನ್ನು ಪರಿಹರಿಸುತ್ತದೆ. RC-LH116 ರ ರಚನೆಯಲ್ಲಿ, ಮೂರು ಚೆಲೇಟೆಡ್ UQ10 ಅಣುಗಳನ್ನು (Q1 ರಿಂದ Q3, ಚಿತ್ರ 5D) ಪರಿಹರಿಸಲಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಾ ಅಣುಗಳು ಬಾಲದಾದ್ಯಂತ ಸ್ಪಷ್ಟ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ (ಚಿತ್ರ 5, D ನಿಂದ G). ಎರಡು ರಚನೆಗಳಲ್ಲಿ, Q1 ಮತ್ತು Q2 ನ ಕ್ವಿನೋನ್ ಹೆಡ್ ಗುಂಪುಗಳ ಸ್ಥಾನಗಳು ಅತ್ಯುತ್ತಮ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ (ಚಿತ್ರ S12F), ಮತ್ತು ಅವು RC ಯೊಂದಿಗೆ ಮಾತ್ರ ಸಂವಹನ ನಡೆಸುತ್ತವೆ. Q1 RC-LH114-W ನ W ಅಂತರದ ಪ್ರವೇಶದ್ವಾರದಲ್ಲಿದೆ (ಚಿತ್ರ 1G ಮತ್ತು 5, C, D ಮತ್ತು E), ಮತ್ತು Q2 QB ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್ ಬಳಿ ಇದೆ (ಚಿತ್ರ 5, C, D) ಮತ್ತು F). ಸಂರಕ್ಷಿತ L-Trp143 ಮತ್ತು L-Trp269 ಅವಶೇಷಗಳು Q1 ಮತ್ತು Q2 ಗೆ ಬಹಳ ಹತ್ತಿರದಲ್ಲಿವೆ ಮತ್ತು ಸಂಭಾವ್ಯ π-ಸ್ಟ್ಯಾಕಿಂಗ್ ಸಂವಹನಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತವೆ (ಚಿತ್ರ 5, E ಮತ್ತು F, ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ S12). Q1 ನ ದೂರದ ಆಮ್ಲಜನಕದಿಂದ L-Gln88, 3.0 Å, ಬಲವಾದ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಬಂಧವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 5E); ಅತ್ಯಂತ ದೂರದ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸಿ ಎಲ್ಲಾ RC ಗಳಲ್ಲಿ ಈ ಶೇಷವನ್ನು ಸಂರಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ S13). ಹೆಚ್ಚಿನ ಇತರ RC ಗಳಲ್ಲಿ L-Ser91 ಅನ್ನು ಸಂಪ್ರದಾಯಬದ್ಧವಾಗಿ Thr ಗೆ ಬದಲಿಯಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ S13), Q1 ನ ಮೀಥೈಲ್ ಆಮ್ಲಜನಕದಿಂದ 3.8 ಆಂಗ್‌ಸ್ಟ್ರೋಮ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ದುರ್ಬಲ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಬಂಧಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸಬಹುದು (ಚಿತ್ರ 5E). Q3 ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿಲ್ಲ, ಆದರೆ RC-M ಉಪಘಟಕ ಮತ್ತು LH1-α ಉಪಘಟಕ 5 ರಿಂದ 6 ರ ನಡುವಿನ ಹೈಡ್ರೋಫೋಬಿಕ್ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿದೆ (ಚಿತ್ರ 5, D ಮತ್ತು G). Q1, Q2 ಮತ್ತು Q3 ಅಥವಾ ಹತ್ತಿರದ ಚೆಲೇಟೆಡ್ ಕ್ವಿನೋನ್‌ಗಳನ್ನು Tch ನಲ್ಲಿಯೂ ಪರಿಹರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಜೆಂಟಲ್, Trv. ಸ್ಟ್ರೈನ್ 970 ಮತ್ತು Blc. ಐರಿಸ್ ರಚನೆ (9, 10, 12) RC-LH1 ಸಂಕೀರ್ಣದಲ್ಲಿ ಸಂರಕ್ಷಿತ ಸಹಾಯಕ ಕ್ವಿನೋನ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್ ಅನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ S12G). RC-LH116 ನಲ್ಲಿರುವ ಐದು ಕೊಳೆತ UQ ಗಳು ಹೆಚ್ಚಿನ ಕಾರ್ಯಕ್ಷಮತೆಯ ದ್ರವ ವರ್ಣರೇಖನ (HPLC) ದಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಪ್ರತಿ ಸಂಕೀರ್ಣದ 5.8±0.7 ನೊಂದಿಗೆ ಉತ್ತಮ ಒಪ್ಪಂದದಲ್ಲಿವೆ, ಆದರೆ RC-LH114-W ನಲ್ಲಿರುವ ಮೂರು ಕೊಳೆತ UQ ಗಳು 6.2±0.3 (ಚಿತ್ರ S14) ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿವೆ, ಇದು ರಚನೆಯಲ್ಲಿ ಪರಿಹರಿಸಲಾಗದ UQ ಅಣುಗಳಿವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಹುಸಿ-ಸಮ್ಮಿತೀಯ L ಮತ್ತು M ಪಾಲಿಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಪ್ರತಿಯೊಂದೂ ಐದು TMH ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಒಂದು BChl ಡೈಮರ್, ಎರಡು BChl ಮಾನೋಮರ್‌ಗಳು, ಎರಡು ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯೊಫೇಜ್ (BPh) ಮಾನೋಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಒಂದು ಹೀಮ್ ಅಲ್ಲದ ಕಬ್ಬಿಣ ಮತ್ತು ಒಂದು ಅಥವಾ ಎರಡು UQ10 ಅಣುಗಳನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸುವ ಹೆಟೆರೊಡೈಮರ್ ಅನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತವೆ. ಟರ್ಮಿನಲ್ ಕೀಟೋನ್ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಬಂಧಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿ ಮತ್ತು Rps ನಲ್ಲಿ ಅದರ ತಿಳಿದಿರುವ ಶೇಖರಣೆಯ ಮೂಲಕ, ಕ್ಯಾರೊಟಿನಾಯ್ಡ್‌ಗಳನ್ನು M-ಉಪಘಟಕದಲ್ಲಿ ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದನ್ನು ಸಿಸ್-3,4-ಡಿಹೈಡ್ರೊರ್ಹೋಡೋಪಿನ್ ಎಂದು ಹೆಸರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಪ್ರಭೇದಗಳು (25). RC-H ನ ಹೊರ ಪೊರೆಯ ಡೊಮೇನ್ ಅನ್ನು ಒಂದೇ TMH ಮೂಲಕ ಪೊರೆಗೆ ಲಂಗರು ಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ. ಒಟ್ಟಾರೆ RC ರಚನೆಯು ಸಂಬಂಧಿತ ಜಾತಿಗಳ (Rba) ಮೂರು ಉಪಘಟಕ RC ಗೆ ಹೋಲುತ್ತದೆ. ಸ್ಫೇರಾಯ್ಡ್ಸ್ (PDB ID: 3I4D). BChl ಮತ್ತು BPh ನ ಮ್ಯಾಕ್ರೋಸೈಕಲ್‌ಗಳು, ಕ್ಯಾರೊಟಿನಾಯ್ಡ್ ಬೆನ್ನೆಲುಬು ಮತ್ತು ಹೀಮ್ ಅಲ್ಲದ ಕಬ್ಬಿಣವು ಈ ರಚನೆಗಳ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿ ಅತಿಕ್ರಮಿಸುತ್ತವೆ, ಹಾಗೆಯೇ QA ಸೈಟ್‌ನಲ್ಲಿ UQ10 ಹೆಡ್ ಗ್ರೂಪ್ ಮತ್ತು RC-LH116 ನಲ್ಲಿ QB ಕ್ವಿನೋನ್ (ಚಿತ್ರ S15).
ವಿಭಿನ್ನ QB ಸೈಟ್ ಆಕ್ಯುಪೆನ್ಸಿ ದರಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಎರಡು RC ರಚನೆಗಳ ಲಭ್ಯತೆಯು QB ಕ್ವಿನೋನ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾದ ರೂಪಾಂತರ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ಹೊಸ ಅವಕಾಶವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ. RC-LH116 ಸಂಕೀರ್ಣದಲ್ಲಿ, QB ಕ್ವಿನೋನ್ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಬಂಧಿತ "ಪ್ರಾಕ್ಸಿಮಲ್" ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿದೆ (26), ಆದರೆ RC-LH114-W ನ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯು QB ಕ್ವಿನೋನ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿಲ್ಲ. RC-LH114-W ನಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ QB ಕ್ವಿನೋನ್ ಇಲ್ಲ, ಇದು ಆಶ್ಚರ್ಯಕರವಾಗಿದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಸಂಕೀರ್ಣವು ಸಕ್ರಿಯವಾಗಿದೆ, ರಚನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಪರಿಹರಿಸಲಾದ QB ಕ್ವಿನೋನ್‌ನೊಂದಿಗೆ RC-LH116 ಸಂಕೀರ್ಣಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು. ಎರಡು LH1 ಉಂಗುರಗಳು ಸುಮಾರು ಆರು ಕ್ವಿನೋನ್‌ಗಳನ್ನು ಚೆಲೇಟ್ ಮಾಡಿದರೂ, ಐದು ಮುಚ್ಚಿದ RC-LH116 ಉಂಗುರದಲ್ಲಿ ರಚನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಪರಿಹರಿಸಲ್ಪಡುತ್ತವೆ, ಆದರೆ ಕೇವಲ ಮೂರು ತೆರೆದ RC-LH114-W ಉಂಗುರದಲ್ಲಿ ರಚನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಸೀಮಿತವಾಗಿವೆ. ಈ ಹೆಚ್ಚಿದ ರಚನಾತ್ಮಕ ಅಸ್ವಸ್ಥತೆಯು RC-LH114-W QB ಸೈಟ್‌ಗಳ ವೇಗವಾದ ಬದಲಿ, ಸಂಕೀರ್ಣದಲ್ಲಿ ವೇಗವಾದ ಕ್ವಿನೋನ್ ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರ ಮತ್ತು LH1 ಲೂಪ್ ಅನ್ನು ದಾಟುವ ಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸಬಹುದು. RC-LH114-W ನ RC QB ಸೈಟ್‌ನಲ್ಲಿ UQ ಕೊರತೆಯು ಹೆಚ್ಚು ಸಂಕೀರ್ಣ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚು ಸಕ್ರಿಯ ಸಂಕೀರ್ಣದ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿರಬಹುದು ಎಂದು ನಾವು ಸೂಚಿಸುತ್ತೇವೆ ಮತ್ತು RC-LH114-W ನ QB ಸೈಟ್ ಅನ್ನು ತಕ್ಷಣವೇ UQ ವಹಿವಾಟಿನಲ್ಲಿ ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಹಂತ (QB ಸೈಟ್‌ಗೆ ಪ್ರವೇಶವನ್ನು ಮುಚ್ಚಲಾಗಿದೆ) ಈ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ರಚನೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆ.
QB ಇಲ್ಲದೆ, L-Phe217 ಅನ್ನು UQ10 ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ಗೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗದ ಸ್ಥಾನಕ್ಕೆ ತಿರುಗಿಸುವುದು, ಏಕೆಂದರೆ ಇದು ಬಾಲದ ಮೊದಲ ಐಸೊಪ್ರೀನ್ ಘಟಕದೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಾದೇಶಿಕ ಘರ್ಷಣೆಯನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 6A). ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ಮುಖ್ಯ ರೂಪಾಂತರ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿವೆ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಹೆಲಿಕ್ಸ್ ಡಿ (TMH D ಮತ್ತು E ನಡುವಿನ ಲೂಪ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಸಣ್ಣ ಹೆಲಿಕ್ಸ್) ಅಲ್ಲಿ L-Phe217 ಅನ್ನು QB ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಪಾಕೆಟ್‌ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು L-Tyr223 ನ ತಿರುಗುವಿಕೆ (ಚಿತ್ರ 6A ) M-Asp45 ಫ್ರೇಮ್‌ವರ್ಕ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಬಂಧವನ್ನು ಮುರಿಯಲು ಮತ್ತು QB ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ನ ಪ್ರವೇಶದ್ವಾರವನ್ನು ಮುಚ್ಚಲು (ಚಿತ್ರ 6B). ಹೆಲಿಕ್ಸ್ ಡಿ ಪಿವೋಟ್‌ಗಳು ಅದರ ತಳದಲ್ಲಿ, L-Ser209 ನ Cα ಅನ್ನು 0.33Å ನಿಂದ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಆದರೆ L-Val221Cα ಅನ್ನು 3.52Å ನಿಂದ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. TMH D ಮತ್ತು E ನಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಗಮನಿಸಬಹುದಾದ ಬದಲಾವಣೆಗಳಿಲ್ಲ, ಅವು ಎರಡೂ ರಚನೆಗಳಲ್ಲಿ ಅತಿಶಯೋಕ್ತಿಯಾಗಿರುತ್ತವೆ (ಚಿತ್ರ 6A). ನಮಗೆ ತಿಳಿದಿರುವಂತೆ, ನೈಸರ್ಗಿಕ RC ಯಲ್ಲಿ QB ಸೈಟ್ ಅನ್ನು ಮುಚ್ಚುವ ಮೊದಲ ರಚನೆ ಇದಾಗಿದೆ. ಸಂಪೂರ್ಣ (QB-ಬೌಂಡ್) ರಚನೆಯೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಕೆ ಮಾಡಿದರೆ, ಕ್ವಿನೋನ್ ಕಡಿಮೆಯಾಗುವ ಮೊದಲು, ಅದನ್ನು ಕ್ವಿನೋನ್‌ಗೆ ಪ್ರವೇಶಿಸಲು ಒಂದು ರೂಪಾಂತರ ಬದಲಾವಣೆಯ ಅಗತ್ಯವಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. L-Phe217 ಕ್ವಿನೋನ್ ಹೆಡ್ ಗುಂಪಿನೊಂದಿಗೆ π-ಸ್ಟ್ಯಾಕಿಂಗ್ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ತಿರುಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಹೆಲಿಕ್ಸ್ ಹೊರಕ್ಕೆ ಬದಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು L-Gly222 ನ ಅಸ್ಥಿಪಂಜರ ಮತ್ತು L-Tyr223 ನ ಸೈಡ್ ಚೈನ್ ಸ್ಥಿರವಾದ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಬಾಂಡ್ ರಚನೆಯೊಂದಿಗೆ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಬಾಂಡ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್ ಅನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 6, A ಮತ್ತು C).
(ಎ) ಹೊಲೊಗ್ರಾಮ್ (ಎಲ್ ಸರಪಳಿ, ಕಿತ್ತಳೆ/ಎಂ ಸರಪಳಿ, ಮೆಜೆಂಟಾ) ಮತ್ತು ಅಪೋ (ಬೂದು) ರಚನೆಯ ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ ಕಾರ್ಟೂನ್, ಇದರಲ್ಲಿ ಕೀ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ರಾಡ್ ತರಹದ ಪ್ರಾತಿನಿಧ್ಯದ ರೂಪದಲ್ಲಿ ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. UQ10 ಅನ್ನು ಹಳದಿ ಪಟ್ಟಿಯಿಂದ ಪ್ರತಿನಿಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಚುಕ್ಕೆಗಳ ರೇಖೆಯು ಸಂಪೂರ್ಣ ರಚನೆಯಲ್ಲಿ ರೂಪುಗೊಂಡ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಬಂಧಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. (ಬಿ ಮತ್ತು ಸಿ) ಅಪೋಲಿಪೋಪ್ರೋಟೀನ್ ಮತ್ತು ಸಂಪೂರ್ಣ ಉಂಗುರ ರಚನೆಯ ಮೇಲ್ಮೈ ಪ್ರಾತಿನಿಧ್ಯ, L-Phe217 ನ ನೀಲಿ ಮತ್ತು L-Tyr223 ನ ಸೈಡ್ ಚೈನ್ ಆಮ್ಲಜನಕವನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ. L ಉಪಘಟಕವು ಕಿತ್ತಳೆ ಬಣ್ಣದ್ದಾಗಿದೆ; M ಮತ್ತು H ಉಪಘಟಕಗಳು ಬಣ್ಣ ಹೊಂದಿಲ್ಲ. (ಡಿ ಮತ್ತು ಇ) ಅಪೋಲಿಪೋಪ್ರೋಟೀನ್ (ಡಿ) ಮತ್ತು ಸಂಪೂರ್ಣ (ಇ) ಆರ್‌ಸಿ ಕ್ಯೂಬಿ ಸೈಟ್‌ಗಳು [ಕ್ರಮವಾಗಿ (ಎ) ಬಣ್ಣದಿಂದ] ಮತ್ತು ಥರ್ಮೋಫಿಲಸ್ ಥರ್ಮೋಫಿಲಸ್ ಪಿಎಸ್‌ಐಐ (ಪ್ಲಾಸ್ಟಿಕ್ ಕ್ವಿನೋನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಹಸಿರು, ನೀಲಿ; ಪಿಡಿಬಿ ಐಡಿ: 3WU2) ಜೋಡಿಸಿ (58).
ಅನಿರೀಕ್ಷಿತವಾಗಿ, LH1 ಇಲ್ಲದ QB-ಕೊರತೆಯ RC ಗಳ ಹಲವಾರು ರಚನೆಗಳು ಲಭ್ಯವಿದ್ದರೂ, ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ರಚನೆಯ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಈ ಹಿಂದೆ ವರದಿ ಮಾಡಲಾಗಿಲ್ಲ. ಇವುಗಳಲ್ಲಿ Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) ಮತ್ತು Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) ನಿಂದ QB ಸವಕಳಿ ರಚನೆ ಸೇರಿವೆ, ಇವೆಲ್ಲವೂ ಅವುಗಳ ಒಟ್ಟಾರೆ QB ರಚನೆಯಂತೆಯೇ ಇರುತ್ತವೆ. 3PRC ಯ ನಿಕಟ ಪರಿಶೀಲನೆಯು LDAO (ಲೌರಿಲ್ ಡೈಮಿಥೈಲ್ ಅಮೈನ್ ಆಕ್ಸೈಡ್) ಡಿಟರ್ಜೆಂಟ್ ಅಣುಗಳು QB ಸ್ಥಾನದ ಪ್ರವೇಶದ್ವಾರದಲ್ಲಿ ಬಂಧಿಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು, ಇದು ಮುಚ್ಚಿದ ರಚನೆಗೆ ಮರುಜೋಡಣೆಯನ್ನು ತಡೆಯಬಹುದು. 1EYS ಅಥವಾ 1OGV ನಲ್ಲಿ ಅದೇ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ LDAO ಕೊಳೆಯುವುದಿಲ್ಲವಾದರೂ, ಈ RC ಗಳನ್ನು ಒಂದೇ ಮಾರ್ಜಕವನ್ನು ಬಳಸಿ ತಯಾರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆದ್ದರಿಂದ ಅದೇ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡಬಹುದು. Rba ಯ ಸ್ಫಟಿಕ ರಚನೆ. ಸೈಟೋಕ್ರೋಮ್ c2 (PDB ID: 1L9B) ನೊಂದಿಗೆ ಸಹ-ಸ್ಫಟಿಕೀಕರಿಸಲಾದ ಸ್ಫೇರಾಯ್ಡ್ಸ್ RC ಕೂಡ ಮುಚ್ಚಿದ QB ಸೈಟ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುವಂತೆ ತೋರುತ್ತದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, RC-M ಪಾಲಿಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪ್ರದೇಶವು (Q ಹೆಲಿಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಟೈರ್ ಅವಶೇಷದ H ಬಂಧದ ಮೂಲಕ QB ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸುತ್ತದೆ) ಅಸ್ವಾಭಾವಿಕ ರಚನೆಯನ್ನು ಅಳವಡಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ ಮತ್ತು QB ರಚನೆಯ ಬದಲಾವಣೆಯನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಅನ್ವೇಷಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ (30). RC-LH114-W ರಚನೆಯಲ್ಲಿ M ಪಾಲಿಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ ಈ ರೀತಿಯ ವಿರೂಪತೆಯನ್ನು ನಾವು ನೋಡಿಲ್ಲ ಎಂಬುದು ಸಮಾಧಾನಕರ ಸಂಗತಿಯಾಗಿದೆ, ಇದು RC-LH116 RC ಯ N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪ್ರದೇಶದಂತೆಯೇ ಇರುತ್ತದೆ. ಡಿಟರ್ಜೆಂಟ್-ಆಧಾರಿತ LH1 ಆಂಟೆನಾವನ್ನು ನಿರ್ಮೂಲನೆ ಮಾಡಿದ ನಂತರ, PDB ಯಲ್ಲಿನ ಅಪೋಲಿಪೋಪ್ರೋಟೀನ್ RC ಗಳನ್ನು ಪರಿಹರಿಸಲಾಯಿತು, ಇದು RC ಮತ್ತು ಸುತ್ತಮುತ್ತಲಿನ LH1 ರಿಂಗ್‌ನ ಒಳ ಮೇಲ್ಮೈ ನಡುವಿನ ಅಂತರದಲ್ಲಿ ಆಂತರಿಕ ಕ್ವಿನೋನ್ ಪೂಲ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿತು ಎಂಬುದನ್ನು ಸಹ ಗಮನಿಸಬೇಕು (31, 32). ಕೊಳೆಯಬಹುದಾದ QB ಕ್ವಿನೋನ್ ಹೊರತುಪಡಿಸಿ, ಎಲ್ಲಾ ಸಹ-ಅಂಶಗಳನ್ನು ಉಳಿಸಿಕೊಂಡಿರುವುದರಿಂದ RC ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಉಳಿದಿದೆ, ಇದು ಕಡಿಮೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ತಯಾರಿಕೆಯ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಕಳೆದುಹೋಗುತ್ತದೆ (33). ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, RC ಯಿಂದ LH1 ಮತ್ತು ನೈಸರ್ಗಿಕ ಆವರ್ತಕ ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುವುದು ಚಾರ್ಜ್-ಬೇರ್ಪಡಿಸಿದ P+QB-ಸ್ಥಿತಿಯ ಕಡಿಮೆ ಜೀವಿತಾವಧಿಯಂತಹ ಕಾರ್ಯಗಳ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ ಎಂದು ತಿಳಿದಿದೆ (31, 34, 35). ಆದ್ದರಿಂದ, RC ಸುತ್ತಲಿನ ಸ್ಥಳೀಯ LH1 ಉಂಗುರದ ಅಸ್ತಿತ್ವವು "ಮುಚ್ಚಿದ" QB ಸೈಟ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಆ ಮೂಲಕ QB ಬಳಿ ಸ್ಥಳೀಯ ಪರಿಸರವನ್ನು ಸಂರಕ್ಷಿಸಬಹುದು ಎಂದು ನಾವು ಊಹಿಸುತ್ತೇವೆ.
ಅಪೋಲಿಪೋಪ್ರೋಟೀನ್ (QB ಕ್ವಿನೋನ್ ಇಲ್ಲದೆ) ಮತ್ತು ಸಂಪೂರ್ಣ ರಚನೆಯು QB ಸೈಟ್‌ನ ವಹಿವಾಟಿನ ಕೇವಲ ಎರಡು ಸ್ನ್ಯಾಪ್‌ಶಾಟ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ, ಘಟನೆಗಳ ಸರಣಿಯ ಬದಲು, ಸಬ್‌ಸ್ಟ್ರೇಟ್ ಪ್ರತಿಬಂಧವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಲು ಹೈಡ್ರೋಕ್ವಿನೋನ್‌ನಿಂದ ಮರುಬಂಧಿಸುವುದನ್ನು ತಡೆಯಲು ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಗೇಟ್ ಮಾಡಬಹುದು ಎಂಬ ಸೂಚನೆಗಳಿವೆ. ಅಪೋಲಿಪೋಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ QB ಸೈಟ್ ಬಳಿ ಕ್ವಿನೋಲ್ ಮತ್ತು ಕ್ವಿನೋನ್‌ನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯು ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿರಬಹುದು, ಇದು RC ಯಿಂದ ಅದರ ನಿರಾಕರಣೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. ಕ್ವಿನೋನ್‌ಗಳ ಬಂಧನ ಮತ್ತು ಕಡಿತದಲ್ಲಿ ಕನ್ಫಾರ್ಮೇಷನಲ್ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಪಾತ್ರವಹಿಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ಬಹಳ ಹಿಂದಿನಿಂದಲೂ ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸಲಾಗಿದೆ. ಡಾರ್ಕ್ ರೂಪಾಂತರದ ನಂತರ ಕ್ವಿನೋನ್‌ಗಳನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಹೆಪ್ಪುಗಟ್ಟಿದ RC ಗಳ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವು ದುರ್ಬಲಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ (36); ಎಕ್ಸ್-ರೇ ಸ್ಫಟಿಕಶಾಸ್ತ್ರವು ಈ ಹಾನಿಯು QB ಕ್ವಿನೋನ್‌ಗಳು ಸಕ್ರಿಯ ಪ್ರಾಕ್ಸಿಮಲ್ ಸ್ಥಾನದಿಂದ ಸುಮಾರು 4.5 Å "ದೂರ" ಕನ್ಫಾರ್ಮೇಶನ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಿಕ್ಕಿಹಾಕಿಕೊಳ್ಳುವುದರಿಂದ ಉಂಟಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ (26), 37). ಈ ಡಿಸ್ಟಲ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಕನ್ಫಾರ್ಮೇಶನ್ ಅಪೋಲಿಪೋಪ್ರೋಟೀನ್ ಮತ್ತು ಪೂರ್ಣ ರಿಂಗ್ ರಚನೆಯ ನಡುವಿನ ಮಧ್ಯಂತರ ಸ್ಥಿತಿಯ ಸ್ನ್ಯಾಪ್‌ಶಾಟ್ ಆಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಸೂಚಿಸುತ್ತೇವೆ, ಇದು ಕ್ವಿನೋನ್‌ನೊಂದಿಗಿನ ಆರಂಭಿಕ ಸಂವಹನ ಮತ್ತು QB ಸೈಟ್ ತೆರೆಯುವಿಕೆಯನ್ನು ಅನುಸರಿಸುತ್ತದೆ.
ಕೆಲವು ಫೋಟೊಟ್ರೋಫಿಕ್ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾ ಮತ್ತು ಸೈನೋಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾ, ಪಾಚಿ ಮತ್ತು ಸಸ್ಯಗಳ PSII ಸಂಕೀರ್ಣದಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ II ವಿಧದ RC ರಚನಾತ್ಮಕ ಮತ್ತು ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಸಂರಕ್ಷಣೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ (38). ಚಿತ್ರ 6 (D ಮತ್ತು E) ನಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವ ರಚನಾತ್ಮಕ ಜೋಡಣೆಯು PSII RC ಗಳು ಮತ್ತು ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ RC ಸಂಕೀರ್ಣದ QB ಸೈಟ್ ನಡುವಿನ ಹೋಲಿಕೆಯನ್ನು ಒತ್ತಿಹೇಳುತ್ತದೆ. ಕ್ವಿನೋನ್ ಬಂಧನ ಮತ್ತು ಕಡಿತದ ನಿಕಟ ಸಂಬಂಧಿತ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಈ ಹೋಲಿಕೆ ಬಹಳ ಹಿಂದಿನಿಂದಲೂ ಒಂದು ಮಾದರಿಯಾಗಿದೆ. ಹಿಂದಿನ ಪ್ರಕಟಣೆಗಳು ಅನುರೂಪ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಕ್ವಿನೋನ್‌ಗಳ PSII ಕಡಿತದೊಂದಿಗೆ ಇರುತ್ತವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸಿವೆ (39, 40). ಆದ್ದರಿಂದ, RC ಯ ವಿಕಸನೀಯ ಸಂರಕ್ಷಣೆಯನ್ನು ಪರಿಗಣಿಸಿ, ಆಮ್ಲಜನಕಯುಕ್ತ ಫೋಟೊಟ್ರೋಫಿಕ್ ಸಸ್ಯಗಳಲ್ಲಿ PSII RC ಯ QB ಸೈಟ್‌ಗೆ ಈ ಹಿಂದೆ ಗಮನಿಸದ ಬಂಧಿಸುವ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವು ಅನ್ವಯಿಸಬಹುದು.
Rps ΔpufW (ಲೇಬಲ್ ಮಾಡದ pufW ಅಳಿಸುವಿಕೆ) ಮತ್ತು PufW-His (C-ಟರ್ಮಿನಲ್ 10x His-ಟ್ಯಾಗ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್-W ಅನ್ನು ನೈಸರ್ಗಿಕ pufW ಲೋಕಸ್) ತಳಿಗಳಿಂದ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ. palustris CGA009 ಅನ್ನು ನಮ್ಮ ಹಿಂದಿನ ಕೆಲಸದಲ್ಲಿ (16) ವಿವರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಈ ತಳಿಗಳು ಮತ್ತು ಐಸೋಜೆನಿಕ್ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಪೇರೆಂಟ್ ಅನ್ನು ಫ್ರೀಜರ್‌ನಿಂದ PYE (ಪ್ರತಿಯೊಂದೂ 5 ಗ್ರಾಂ ಲೀಟರ್ -1) (LB ನಲ್ಲಿ -80 °C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ, 50% (w/v) ಗ್ಲಿಸರಾಲ್) ಪ್ರೋಟೀನ್, ಯೀಸ್ಟ್ ಸಾರ ಮತ್ತು ಸಕ್ಸಿನೇಟ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ) ಅಗರ್ [1.5% (w/v)] ಪ್ಲೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಣ್ಣ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸ್ಟ್ರೀಕ್ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಮರುಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ. ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಆಮ್ಲಜನಕರಹಿತ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ ಇಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ OSRAM 116-W ಹ್ಯಾಲೊಜೆನ್ ಬಲ್ಬ್‌ಗಳು (RS ಕಾಂಪೊನೆಂಟ್ಸ್, UK) ಒದಗಿಸಿದ ಬಿಳಿ ಬೆಳಕಿನಿಂದ (~50 μmolm-2 s-1) 3 ರಿಂದ 5 ದಿನಗಳವರೆಗೆ ಒಂದೇ ವಸಾಹತು ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳುವವರೆಗೆ ಪ್ರಕಾಶಿಸಲಾಯಿತು. ಒಂದೇ ವಸಾಹತುವಿನಲ್ಲಿ 10 ಮಿಲಿ M22+ ಮಧ್ಯಮ (41) ಅನ್ನು 0.1% (w/v) ಕ್ಯಾಸಮಿನೋ ಆಮ್ಲಗಳೊಂದಿಗೆ (ಇನ್ನು ಮುಂದೆ M22 ಎಂದು ಉಲ್ಲೇಖಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ) ಪೂರಕವಾಗಿ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದು ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಕಡಿಮೆ ಆಮ್ಲಜನಕದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ 34°C ನಲ್ಲಿ 180 rpm ನಲ್ಲಿ 48 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಅಲುಗಾಡುವಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯನ್ನು ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ 70 ಮಿಲಿ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯನ್ನು ಅದೇ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದು ಮಾಡಲಾಯಿತು. 1 ಮಿಲಿ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಅರೆ-ಏರೋಬಿಕ್ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯನ್ನು 30 ಮಿಲಿ ಸಾರ್ವತ್ರಿಕ ಸ್ಕ್ರೂ-ಟಾಪ್ ಪಾರದರ್ಶಕ ಗಾಜಿನ ಬಾಟಲಿಯಲ್ಲಿ 30 ಮಿಲಿ M22 ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಚುಚ್ಚುಮದ್ದು ಮಾಡಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ಕಾಂತೀಯ ಬಲ ಸ್ಟಿರಿಂಗ್ ರಾಡ್ ಮೂಲಕ 48 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಆಂದೋಲನದಿಂದ (~50μmolm-2 s-1) ವಿಕಿರಣಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ನಂತರ 30 ಮಿಲಿ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯನ್ನು ಅದೇ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಸುಮಾರು 1 ಲೀಟರ್ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯೊಂದಿಗೆ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದು ಮಾಡಲಾಯಿತು, ನಂತರ ಇದನ್ನು 72 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ~200 μmolm-2 s-1 ನಲ್ಲಿ ಪ್ರಕಾಶಿಸಲಾದ ಸುಮಾರು 9 ಲೀಟರ್ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯನ್ನು ಚುಚ್ಚುಮದ್ದು ಮಾಡಲು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು 7132 RCF ನಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮೂಲಕ ಕೊಯ್ಲು ಮಾಡಲಾಯಿತು, 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ನ ~10 ಮಿಲಿಯಲ್ಲಿ ಮತ್ತೆ ಅದ್ದಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಅಗತ್ಯವಿರುವವರೆಗೆ -20°C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು.
ಕರಗಿದ ನಂತರ, ಮರುಹೊಂದಿಸಿದ ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಡಿಯೋಕ್ಸಿರೈಬೊನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ I (ಮೆರ್ಕ್, ಯುಕೆ), ಲೈಸೋಜೈಮ್ (ಮೆರ್ಕ್, ಯುಕೆ) ಮತ್ತು ಎರಡು ರೋಚೆ ಹೋಲೋಎಂಜೈಮ್ ಪ್ರೋಟಿಯೇಸ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್ ಮಾತ್ರೆಗಳು (ಮೆರ್ಕ್, ಯುಕೆ) ನ ಕೆಲವು ಹರಳುಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಿ. 20,000 psi ಫ್ರೆಂಚ್ ಒತ್ತಡ ಕೋಶದಲ್ಲಿ (ಅಮಿಂಕೊ, ಯುಎಸ್ಎ), ಜೀವಕೋಶಗಳು 8 ರಿಂದ 12 ಬಾರಿ ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸಲ್ಪಟ್ಟವು. 4 ° C ನಲ್ಲಿ 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 18,500 RCF ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮೂಲಕ ಮುರಿಯದ ಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು ಕರಗದ ಶಿಲಾಖಂಡರಾಶಿಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿದ ನಂತರ, ಪೊರೆಯನ್ನು 43,000 ° C ನಲ್ಲಿ 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ 113,000 RCF ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮೂಲಕ ವರ್ಣದ್ರವ್ಯದ ಲೈಸೇಟ್‌ನಿಂದ ಅವಕ್ಷೇಪಿಸಲಾಯಿತು. ಕರಗುವ ಭಾಗವನ್ನು ತ್ಯಜಿಸಿ ಮತ್ತು 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ನ 100 ರಿಂದ 200 ಮಿಲಿಯಲ್ಲಿ ಬಣ್ಣದ ಪೊರೆಯನ್ನು ಮತ್ತೆ ಹದಗೊಳಿಸಿ ಮತ್ತು ಯಾವುದೇ ಗೋಚರ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳು ಇಲ್ಲದವರೆಗೆ ಏಕರೂಪಗೊಳಿಸಿ. ಅಮಾನತುಗೊಂಡ ಪೊರೆಯನ್ನು 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (ಅನಾಟ್ರೇಸ್, USA) ನಲ್ಲಿ 2% (w/v) β-DDM ಹೊಂದಿರುವ ಸ್ಥಳದಲ್ಲಿ 4°C ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ ನಿಧಾನವಾಗಿ ಕಲಕುತ್ತಾ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ನಂತರ 70°C ನಲ್ಲಿ ಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಜ್ ಮಾಡಿ 150,000 RCF ಅನ್ನು 4°C ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ ಕರಗಿಸಿ ಉಳಿದ ಕರಗದ ವಸ್ತುಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು.
ΔpufW ಸ್ಟ್ರೈನ್‌ನಿಂದ ಕರಗಿಸುವ ಪೊರೆಯನ್ನು 0.03% (w / v) β-DDM ಹೊಂದಿರುವ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಬಫರ್‌ನ ಮೂರು ಕಾಲಮ್ ವಾಲ್ಯೂಮ್‌ಗಳು (CV) ಹೊಂದಿರುವ 50 ml DEAE ಸೆಫರೋಸ್ ಅಯಾನು ವಿನಿಮಯ ಕಾಲಮ್‌ಗೆ ಅನ್ವಯಿಸಲಾಯಿತು [20 mM tris-HCl (pH 8.0)]. ಎರಡು CV ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಬಫರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಕಾಲಮ್ ಅನ್ನು ತೊಳೆಯಿರಿ, ಮತ್ತು ನಂತರ 50 mM NaCl ಹೊಂದಿರುವ ಎರಡು ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಬಫರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಕಾಲಮ್ ಅನ್ನು ತೊಳೆಯಿರಿ. RC-LH116 ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು 1.75 CV ನಲ್ಲಿ 150 ರಿಂದ 300 mM NaCl (ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ) ರೇಖೀಯ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಎಲ್ಯುಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಉಳಿದ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು 0.5 CV ನಲ್ಲಿ 300 mM NaCl ಹೊಂದಿರುವ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಎಲ್ಯುಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. 250 ಮತ್ತು 1000 nm ನಡುವಿನ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ವರ್ಣಪಟಲವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ, ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಅನುಪಾತ (A880/A280) 1 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿರುವ ಭಾಗವನ್ನು 880 ರಿಂದ 280 nm ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಿ, ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಎರಡು ಬಾರಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿ ಮತ್ತು DEAE ಕಾಲಮ್‌ನಲ್ಲಿ ಮತ್ತೆ ಅದೇ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿ ಶುದ್ಧೀಕರಣವನ್ನು ಆನ್ ಮಾಡಿ. 1.7 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ A880/A280 ಅನುಪಾತಗಳು ಮತ್ತು 3.0 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ A880/A805 ಅನುಪಾತಗಳೊಂದಿಗೆ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳನ್ನು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿ, ಮೂರನೇ ಸುತ್ತಿನ ಅಯಾನು ವಿನಿಮಯವನ್ನು ಮಾಡಿ ಮತ್ತು 2.2 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ A880/A280 ಅನುಪಾತಗಳು ಮತ್ತು 5.0 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ A880/A805 ಅನುಪಾತಗಳೊಂದಿಗೆ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳನ್ನು ಉಳಿಸಿಕೊಳ್ಳಿ. ಭಾಗಶಃ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ಅಮಿಕಾನ್ 100,000 ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕದ ಕಟ್-ಆಫ್ (MWCO) ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಫಿಲ್ಟರ್ (ಮೆರ್ಕ್, ಯುಕೆ) ನಲ್ಲಿ ~2 ಮಿಲಿಗೆ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 200 mM NaCl ಬಫರ್ ಹೊಂದಿರುವ ಸೂಪರ್‌ಡೆಕ್ಸ್ 200 16/600 ಗಾತ್ರದ ಹೊರಗಿಡುವ ಕಾಲಮ್ (GE ಹೆಲ್ತ್‌ಕೇರ್, US) ನಲ್ಲಿ ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಅದೇ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ 1.5 CV ನಲ್ಲಿ ಹೊರಗಿಡಲಾಯಿತು. ಗಾತ್ರದ ಹೊರಗಿಡುವ ಭಾಗದ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ವರ್ಣಪಟಲವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ, ಮತ್ತು ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ವರ್ಣಪಟಲವನ್ನು 2.4 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ A880/A280 ಅನುಪಾತಗಳು ಮತ್ತು 5.8 ರಿಂದ 100 A880 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ A880/A805 ಅನುಪಾತಗಳೊಂದಿಗೆ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಿ, ಮತ್ತು ತಕ್ಷಣವೇ ಅವುಗಳನ್ನು ಕ್ರಯೋ-TEM ಗ್ರಿಡ್ ತಯಾರಿಕೆ ಅಥವಾ ಸಂಗ್ರಹಣೆಗಾಗಿ ಬಳಸಿ ಅಗತ್ಯವಿರುವವರೆಗೆ -80°C ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಿ.
PufW-His ತಳಿಯಿಂದ ಕರಗಿಸುವ ಪೊರೆಯನ್ನು IMAC ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ (GE ಹೆಲ್ತ್‌ಕೇರ್) 200 mM NaCl ಮತ್ತು 0.03% (w/w) ಹೊಂದಿರುವ 20 mM tris-HCl (pH 8.0) 200 mM) ಹೊಂದಿರುವ 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) β-DDM]. ಕಾಲಮ್ ಅನ್ನು ಐದು CV ಗಳ IMAC ಬಫರ್‌ನಿಂದ ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ 10 mM ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್ ಹೊಂದಿರುವ ಐದು CV ಗಳ IMAC ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು. 100 mM ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್ ಹೊಂದಿರುವ ಐದು IMAC ಬಫರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಕೋರ್ ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ಕಾಲಮ್‌ನಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಯಿತು. RC-LH114-W ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಭಾಗವನ್ನು ಅಮಿಕಾನ್ 100,000 MWCO ಫಿಲ್ಟರ್ (ಮೆರ್ಕ್, ಯುಕೆ) ಹೊಂದಿದ ಕಲಕಿ ಟ್ಯಾಂಕ್‌ನಲ್ಲಿ ~10 ಮಿಲಿಗೆ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ 20 ಬಾರಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ 25 ಮಿಲಿಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. DEAE ಸೆಫರೋಸ್ ಕಾಲಮ್‌ನಲ್ಲಿ, ಬಫರ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸಲಾದ ನಾಲ್ಕು CV ಗಳನ್ನು ಮುಂಚಿತವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ನಾಲ್ಕು CV ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಬಫರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಕಾಲಮ್ ಅನ್ನು ತೊಳೆಯಿರಿ, ನಂತರ 0 ರಿಂದ 100 mM NaCl (ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ) ರೇಖೀಯ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಎಂಟು CV ಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ಎಲ್ಯೂಟ್ ಮಾಡಿ ಮತ್ತು 100 mM ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಬಫರ್ ಹೊಂದಿರುವ ಉಳಿದ ನಾಲ್ಕು CV ಗಳು. ಸೋಡಿಯಂ ಕ್ಲೋರೈಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಎಲ್ಯೂಟ್ ಮಾಡಲಾದ ಉಳಿದ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳನ್ನು 2.4 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ A880/A280 ಅನುಪಾತ ಮತ್ತು 4.6 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ A880/A805 ಅನುಪಾತದೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಗಿದೆ. ಅಮಿಕಾನ್ 100,000 MWCO ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಫಿಲ್ಟರ್‌ನಲ್ಲಿ ~2 ಮಿಲಿಗೆ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮುಂಚಿತವಾಗಿ 1.5 CV IMAC ನೊಂದಿಗೆ ತುಂಬಿಸಲಾಯಿತು. ಬಫರ್ ಸೂಪರ್‌ಡೆಕ್ಸ್ 200 16/600 ಗಾತ್ರದ ಹೊರಗಿಡುವ ಕಾಲಮ್ ಅನ್ನು ಸಮತೋಲನಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ 1.5 CV ಗಿಂತ ಅದೇ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಎಲ್ಯೂಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಗಾತ್ರ-ಹೊರಗಿಡುವ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ವರ್ಣಪಟಲವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ ಮತ್ತು ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ವರ್ಣಪಟಲವನ್ನು 2.1 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ A880/A280 ಅನುಪಾತಗಳು ಮತ್ತು 4.6 ರಿಂದ 100 A880 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ A880/A805 ಅನುಪಾತಗಳೊಂದಿಗೆ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಿ, ಇವುಗಳನ್ನು ತಕ್ಷಣವೇ ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಿದ TEM ಗ್ರಿಡ್ ತಯಾರಿಕೆಗೆ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಅಥವಾ ಅಗತ್ಯವಿರುವವರೆಗೆ -80°C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನದ TEM ಗ್ರಿಡ್‌ಗಳನ್ನು ತಯಾರಿಸಲು ಲೈಕಾ EM GP ಇಮ್ಮರ್ಶನ್ ಫ್ರೀಜರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು IMAC ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ 50 ರ A880 ಗೆ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ 5μl ಅನ್ನು ಹೊಸದಾಗಿ ಗ್ಲೋ-ಡಿಸ್ಚಾರ್ಜ್ ಮಾಡಿದ QUANTIFOIL 1.2/1.3 ಕಾರ್ಬನ್-ಲೇಪಿತ ತಾಮ್ರದ ಜಾಲರಿಯ ಮೇಲೆ ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು (ಅಗರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, UK). ಗ್ರಿಡ್ ಅನ್ನು 20°C ಮತ್ತು 60% ಸಾಪೇಕ್ಷ ಆರ್ದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ 30 ಸೆಕೆಂಡುಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು, ನಂತರ ಅದನ್ನು 3 ಸೆಕೆಂಡುಗಳ ಕಾಲ ಒಣಗಿಸಿ, ನಂತರ -176°C ನಲ್ಲಿ ದ್ರವ ಈಥೇನ್‌ನಲ್ಲಿ ತಣಿಸಲಾಯಿತು.
RC-LH114-W ಸಂಕೀರ್ಣದ ಡೇಟಾವನ್ನು eBIC (ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನಿಕ್ ಬಯೋಇಮೇಜಿಂಗ್ ಸೆಂಟರ್) (ಬ್ರಿಟಿಷ್ ಡೈಮಂಡ್ ಲೈಟ್ ಸೋರ್ಸ್) ನಲ್ಲಿ ಟೈಟಾನ್ ಕ್ರಿಯೋಸ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್ ಬಳಸಿ ದಾಖಲಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದು 300kV ವೇಗವರ್ಧಕ ವೋಲ್ಟೇಜ್‌ನಲ್ಲಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ, 130,000× ನಾಮಮಾತ್ರ ವರ್ಧನೆ ಮತ್ತು 20 eV ಅಂತರವನ್ನು ಆರಿಸಿ. ಡೇಟಾವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲು ಎಣಿಕೆಯ ಕ್ರಮದಲ್ಲಿ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡಲು K2 ಪೀಕ್ ಡಿಟೆಕ್ಟರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಗ್ಯಾಟನ್ 968 GIF ಕ್ವಾಂಟಮ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಮಾಪನಾಂಕ ನಿರ್ಣಯಿಸಿದ ಪಿಕ್ಸೆಲ್ ಗಾತ್ರ 1.048Å, ಮತ್ತು ಡೋಸ್ ದರ 3.83 e-Å-2s-1. ಚಲನಚಿತ್ರವನ್ನು 11 ಸೆಕೆಂಡುಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ 40 ಭಾಗಗಳಾಗಿ ವಿಂಗಡಿಸಿದೆ. ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕವನ್ನು ಮರುಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಲು ಕಾರ್ಬನ್-ಲೇಪಿತ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಬಳಸಿ, ತದನಂತರ ಪ್ರತಿ ರಂಧ್ರಕ್ಕೆ ಮೂರು ಚಲನಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ. ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, 3130 ಚಲನಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ, ಡಿಫೋಕಸ್ ಮೌಲ್ಯಗಳು -1 ಮತ್ತು -3μm ನಡುವೆ.
RC-LH116 ಸಂಕೀರ್ಣದ ಡೇಟಾವನ್ನು ಆಸ್ಟರ್‌ಬರಿ ಬಯೋಸ್ಟ್ರಕ್ಚರ್ ಲ್ಯಾಬೋರೇಟರಿಯಲ್ಲಿ (ಯೂನಿವರ್ಸಿಟಿ ಆಫ್ ಲೀಡ್ಸ್, UK) ಅದೇ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕವನ್ನು ಬಳಸಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ. ಡೇಟಾವನ್ನು 130 k ವರ್ಧನೆಯೊಂದಿಗೆ ಎಣಿಕೆಯ ಕ್ರಮದಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪಿಕ್ಸೆಲ್ ಗಾತ್ರವನ್ನು 4.6 e-Å-2s-1 ಡೋಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ 1.065 Å ಗೆ ಮಾಪನಾಂಕ ನಿರ್ಣಯಿಸಲಾಗಿದೆ. ಚಲನಚಿತ್ರವನ್ನು 12 ಸೆಕೆಂಡುಗಳಲ್ಲಿ ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು 48 ಭಾಗಗಳಾಗಿ ವಿಂಗಡಿಸಲಾಗಿದೆ. ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, 3359 ಫಿಲ್ಮ್‌ಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ, -1 ಮತ್ತು -3μm ನಡುವಿನ ಡಿಫೋಕಸ್ ಮೌಲ್ಯಗಳೊಂದಿಗೆ.
ಎಲ್ಲಾ ಡೇಟಾ ಸಂಸ್ಕರಣೆಯನ್ನು Relion 3.0 ಪೈಪ್‌ಲೈನ್ (42) ನಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಡೋಸ್ ತೂಕದ ಮೂಲಕ ಕಿರಣದ ಚಲನೆಯನ್ನು ಸರಿಪಡಿಸಲು Motioncorr 2 (43) ಅನ್ನು ಬಳಸಿ, ಮತ್ತು ನಂತರ CTF (ಕಾಂಟ್ರಾಸ್ಟ್ ವರ್ಗಾವಣೆ ಕಾರ್ಯ) ನಿಯತಾಂಕವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು CTFFIND 4.1 (44) ಅನ್ನು ಬಳಸಿ. ಈ ಆರಂಭಿಕ ಸಂಸ್ಕರಣಾ ಹಂತಗಳ ನಂತರ ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ಫೋಟೊಮೈಕ್ರೋಗ್ರಾಫ್‌ಗಳನ್ನು ಚಿತ್ರ 2 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. S16. 250-ಪಿಕ್ಸೆಲ್ ಚೌಕಟ್ಟಿನಲ್ಲಿ 1000 ಕಣಗಳ ಸುಮಾರು 250 ಪಿಕ್ಸೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು ಯಾವುದೇ ಉಲ್ಲೇಖವಿಲ್ಲದ ಎರಡು ಆಯಾಮದ (2D) ವರ್ಗೀಕರಣದ ಮೂಲಕ ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಆಯ್ಕೆ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ರಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಮಾದರಿ ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ಪೂರೈಸುವ ಅಥವಾ ಯಾವುದೇ ಗ್ರಹಿಸಬಹುದಾದ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರದ ವರ್ಗೀಕರಣಗಳನ್ನು ತಿರಸ್ಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ನಂತರ, ಎಲ್ಲಾ ಮೈಕ್ರೋಫೋಟೋಗ್ರಾಫ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಆಯ್ಕೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು RC-LH114-W 849,359 ಕಣಗಳಾಗಿತ್ತು, ಮತ್ತು RC-LH116 ಸಂಕೀರ್ಣವು 476,547 ಕಣಗಳಾಗಿತ್ತು. ಎಲ್ಲಾ ಆಯ್ದ ಕಣಗಳು ಎರಡು ಸುತ್ತಿನ ಉಲ್ಲೇಖವಿಲ್ಲದ 2D ವರ್ಗೀಕರಣಕ್ಕೆ ಒಳಗಾಗಿವೆ, ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ರನ್ ನಂತರ, ಇಂಗಾಲದ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಪೂರೈಸುವ ಕಣಗಳು, ಮಾದರಿ ಮಾಲಿನ್ಯ, ಯಾವುದೇ ಸ್ಪಷ್ಟ ವೈಶಿಷ್ಟ್ಯಗಳಿಲ್ಲ ಅಥವಾ ಬಲವಾಗಿ ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ ಕಣಗಳನ್ನು ತಿರಸ್ಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ 772,033 (90.9%) ಮತ್ತು 359,678 (75.5%) ) ಕಣಗಳನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ RC-LH114-W ಮತ್ತು RC-LH116 ನ 3D ವರ್ಗೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಆರಂಭಿಕ 3D ಉಲ್ಲೇಖ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸ್ಟೋಕಾಸ್ಟಿಕ್ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಡಿಸೆಂಟ್ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಉತ್ಪಾದಿಸಲಾಗಿದೆ. ಆರಂಭಿಕ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಉಲ್ಲೇಖವಾಗಿ ಬಳಸಿಕೊಂಡು, ಆಯ್ದ ಕಣಗಳನ್ನು 3D ಯಲ್ಲಿ ನಾಲ್ಕು ವರ್ಗಗಳಾಗಿ ವರ್ಗೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಈ ವರ್ಗದಲ್ಲಿರುವ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಉಲ್ಲೇಖವಾಗಿ ಬಳಸಿಕೊಂಡು, ದೊಡ್ಡ ವರ್ಗದಲ್ಲಿರುವ ಕಣಗಳ ಮೇಲೆ 3D ಸಂಸ್ಕರಣೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿ, ನಂತರ ದ್ರಾವಕ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಆವರಿಸಲು ಆರಂಭಿಕ 15Å ಕಡಿಮೆ-ಪಾಸ್ ಫಿಲ್ಟರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ, ಮೃದುವಾದ ಅಂಚುಗಳ 6 ಪಿಕ್ಸೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಮೇಲಿನ ಡಿಟೆಕ್ಟರ್‌ನ Gatan K2 ಪೀಕ್ ಮಾಡ್ಯುಲೇಷನ್ ವರ್ಗಾವಣೆ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಸರಿಪಡಿಸಲು ಪಿಕ್ಸೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ನಂತರದ-ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗೊಳಿಸಿ. RC-LH114-W ಡೇಟಾಸೆಟ್‌ಗಾಗಿ, ಈ ಆರಂಭಿಕ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಮುಖವಾಡದ ಅಂಚುಗಳಲ್ಲಿನ ಬಲವಾದ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುವ ಮೂಲಕ ಮಾರ್ಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ (UCSF ಚಿಮೆರಾದಲ್ಲಿನ ಕೋರ್ ಸಂಕೀರ್ಣ ಸಾಂದ್ರತೆಯಿಂದ ಸಂಪರ್ಕ ಕಡಿತಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ). ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು (RC-LH114-W ಮತ್ತು RC-LH116 ನ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್‌ಗಳು ಕ್ರಮವಾಗಿ 3.91 ಮತ್ತು 4.16 Å) ಎರಡನೇ ಸುತ್ತಿನ 3D ವರ್ಗೀಕರಣಕ್ಕೆ ಉಲ್ಲೇಖವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಬಳಸಿದ ಕಣಗಳನ್ನು ಆರಂಭಿಕ 3D ವರ್ಗಕ್ಕೆ ವರ್ಗೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ನೆರೆಹೊರೆಯೊಂದಿಗೆ ಬಲವಾದ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವುದಿಲ್ಲ. ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ರಚನಾತ್ಮಕ ವೈಶಿಷ್ಟ್ಯಗಳ ಅತಿಕ್ರಮಣ ಅಥವಾ ಕೊರತೆ. 3D ವರ್ಗೀಕರಣದ ಎರಡನೇ ಸುತ್ತಿನ ನಂತರ, ಅತ್ಯಧಿಕ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ಹೊಂದಿರುವ ವರ್ಗವನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು [RC-LH114-W ಗಾಗಿ, ಒಂದು ವರ್ಗವು 377,703 ಕಣಗಳು (44.5%), RC-LH116 ಗಾಗಿ, ಎರಡು ವರ್ಗಗಳಿವೆ, ಒಟ್ಟು 260,752 ಕಣಗಳು (54.7%) , ಅಲ್ಲಿ ಅವು ಸಣ್ಣ ವ್ಯತ್ಯಾಸದೊಂದಿಗೆ ಆರಂಭಿಕ ತಿರುಗುವಿಕೆಯ ನಂತರ ಜೋಡಿಸಿದಾಗ ಮಾತ್ರ ಒಂದೇ ಆಗಿರುತ್ತವೆ]. ಆಯ್ದ ಕಣಗಳನ್ನು 400-ಪಿಕ್ಸೆಲ್ ಪೆಟ್ಟಿಗೆಯಲ್ಲಿ ಪುನಃ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 3D ಸಂಸ್ಕರಣೆಯ ಮೂಲಕ ಪರಿಷ್ಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಆರಂಭಿಕ 15Å ಕಡಿಮೆ-ಪಾಸ್ ಫಿಲ್ಟರ್, 3 ಪಿಕ್ಸೆಲ್ ನಕ್ಷೆ ವಿಸ್ತರಣೆ ಮತ್ತು 3 ಪಿಕ್ಸೆಲ್ ಸಾಫ್ಟ್ ಮಾಸ್ಕ್ ಬಳಸಿ ದ್ರಾವಕ ಮುಖವಾಡವನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪ್ರತಿ-ಕಣ CTF ಪರಿಷ್ಕರಣೆ, ಪ್ರತಿ-ಕಣ ಚಲನೆಯ ತಿದ್ದುಪಡಿ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ-ಕಣ CTF ಪರಿಷ್ಕರಣೆಯ ಎರಡನೇ ಸುತ್ತು, 3D ಪರಿಷ್ಕರಣೆ, ದ್ರಾವಕ ಮರೆಮಾಚುವಿಕೆ ಮತ್ತು ನಂತರದ ಸಂಸ್ಕರಣೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿ ಹಂತದ ನಂತರ ಫಲಿತಾಂಶದ ವಿನ್ಯಾಸವನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಪರಿಷ್ಕರಿಸಲು ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ. 0.143 ರ FSC (ಫೋರಿಯರ್ ಶೆಲ್ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಗುಣಾಂಕ) ಕಟ್-ಆಫ್ ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, RC-LH114-W ಮತ್ತು RC-LH116 ರ ಅಂತಿಮ ಮಾದರಿಗಳ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್‌ಗಳು ಕ್ರಮವಾಗಿ 2.65 ಮತ್ತು 2.80Å ಆಗಿರುತ್ತವೆ. ಅಂತಿಮ ಮಾದರಿಯ FSC ಕರ್ವ್ ಅನ್ನು ಚಿತ್ರ 2. S17 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಯುನಿಪ್ರೋಟ್ಕೆಬಿಯಿಂದ ಡೌನ್‌ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ: LH1-β (PufB; ಯುನಿಪ್ರೋಟ್ ಐಡಿ: Q6N9L5); LH1-α (PufA; ಯುನಿಪ್ರೋಟ್ ಐಡಿ: Q6N9L4); ಆರ್ಸಿ-ಎಲ್ (PufL; ಯುನಿಪ್ರೋಟ್ ಐಡಿ: O83005); ಆರ್ಸಿ-ಎಂ (PufM; ಯುನಿಪ್ರೋಟ್ ಐಡಿ: A0A4Z7); ಆರ್ಸಿ-ಎಚ್ (PuhA; ಯುನಿಪ್ರೋಟ್ ಐಡಿ: A0A4Z9); ಪ್ರೋಟೀನ್-ಡಬ್ಲ್ಯೂ (PufW; ಯುನಿಪ್ರೋಟ್ ಐಡಿ: Q6N1K3). RC ಯ ಹೋಮೋಲಜಿ ಮಾದರಿಯನ್ನು ನಿರ್ಮಿಸಲು SWISS-MODEL (45) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು, ಇದು RC-L, RC-M ಮತ್ತು RC-H ನ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಮತ್ತು Rba ನ ಸ್ಫಟಿಕ ರಚನೆಯನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ. ಸ್ಫೇರಾಯ್ಡ್ಸ್ ಆರ್ಸಿಯನ್ನು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಆಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು (PDB ಐಡಿ: 5LSE) (46). ಉತ್ಪಾದಿಸಿದ ಮಾದರಿಯನ್ನು ನಕ್ಷೆಗೆ ಹೊಂದಿಸಲು UCSF ಚಿಮೆರಾದಲ್ಲಿ “ಫಿಟ್ ಮ್ಯಾಪ್” ಪರಿಕರವನ್ನು ಬಳಸಿ (47), ಪ್ರೋಟೀನ್ ರಚನೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಿ ಮತ್ತು ಸಹ-ಅಂಶಕ [4×BChl a (ಮೊನೊಮರ್ ಲೈಬ್ರರಿ ಅವಶೇಷ ಹೆಸರು = BCL), 2×BPh a (BPH), ಒಂದು ಅಥವಾ ಎರಡು ರೀತಿಯ UQ10 (U10), ಒಂದು ಹೀಮ್ ಅಲ್ಲದ ಕಬ್ಬಿಣ (Fe) ಮತ್ತು ಒಂದು 3,4-ಡೈಹೈಡ್ರೋಹೆಕ್ಸಾಕಾರ್ಬೊನಿಲ್ಕೋಲಿನ್ (QAK)] ಸೇರಿಸಲು ಕೂಟ್ (48) ಅನ್ನು ಬಳಸಿ. ಮಾನೊಮರ್ ಲೈಬ್ರರಿಯಲ್ಲಿ QAK ಲಭ್ಯವಿಲ್ಲದ ಕಾರಣ, ಅದನ್ನು PHENIX (49) ನಲ್ಲಿ eLBOW ಪರಿಕರವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನಿಯತಾಂಕಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಮುಂದೆ, LH1 ಉಪಘಟಕವನ್ನು ನಿರ್ಮಿಸಲಾಯಿತು. ಆರಂಭದಲ್ಲಿ, PHENIX (49) ನಲ್ಲಿರುವ ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ನಿರ್ಮಾಣ ಸಾಧನವನ್ನು ನಕ್ಷೆ ಮತ್ತು LH1-α ಮತ್ತು LH1-β ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಇನ್‌ಪುಟ್ ಆಗಿ ಬಳಸಿಕೊಂಡು LH1 ಅನುಕ್ರಮದ ಭಾಗವನ್ನು ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತವಾಗಿ ನಿರ್ಮಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತಿತ್ತು. ಅತ್ಯಂತ ಸಂಪೂರ್ಣವಾದ LH1 ಉಪಘಟಕವನ್ನು ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿ, ಅದನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಿರಿ ಮತ್ತು ಅದನ್ನು ಕೂಟ್‌ಗೆ ಲೋಡ್ ಮಾಡಿ, ಅದರಲ್ಲಿ ಕಾಣೆಯಾದ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಎರಡು BCls a (BCL) ಮತ್ತು ಸ್ಪಿರಿಲೋಕ್ಸಾಂಥಿನ್ (CRT) ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೊದಲು ಸಂಪೂರ್ಣ ರಚನೆಯನ್ನು ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ಪರಿಷ್ಕರಿಸಿ [ಸಂಬಂಧಿತ Rps ಪ್ರಕಾರ LH1 ಸಂಕೀರ್ಣದ ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು ತಿಳಿದಿರುವ ಕ್ಯಾರೊಟಿನಾಯ್ಡ್ ವಿಷಯ. ಪ್ರಭೇದಗಳು (17)]. ಸಂಪೂರ್ಣ LH1 ಉಪಘಟಕವನ್ನು ನಕಲಿಸಿ, ಮತ್ತು LH1 ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಪಕ್ಕದ ಮಾದರಿಯಲ್ಲದ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಡಾಕ್ ಮಾಡಲು UCSF ಚಿಮೆರಾ “ಡಾಕಿಂಗ್ ಮ್ಯಾಪ್ ಟೂಲ್” ಅನ್ನು ಬಳಸಿ, ತದನಂತರ ಅದನ್ನು ಕೂಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಪರಿಷ್ಕರಿಸಿ; ಎಲ್ಲಾ LH1 ಉಪಘಟಕಗಳನ್ನು ಮಾದರಿ ಮಾಡುವವರೆಗೆ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಪುನರಾವರ್ತಿಸಿ. RC-LH114-W ರಚನೆಗಾಗಿ, ಕೂಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಹಂಚಿಕೆಯಾಗದ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಮೂಲಕ, USCF ಚಿಮೆರಾ ನಕ್ಷೆಯಲ್ಲಿ ಉಳಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಲ್ಲದ ಘಟಕಗಳಿಂದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ವಿಂಗಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಆರಂಭಿಕ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಲು ಮತ್ತು ಉಳಿದ ಉಪಘಟಕಗಳನ್ನು (ಪ್ರೋಟೀನ್-W) ಮಾಡೆಲಿಂಗ್ ಮಾಡಲು ಆಟೋಬಿಲ್ಡ್ ಉಪಕರಣವನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. PHENIX (49) ನಲ್ಲಿ. ಕೂಟ್ (48) ನಲ್ಲಿ ಫಲಿತಾಂಶದ ಮಾದರಿಗೆ ಯಾವುದೇ ಕಾಣೆಯಾದ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಿ, ಮತ್ತು ನಂತರ ಸಂಪೂರ್ಣ ಉಪಘಟಕವನ್ನು ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ಪರಿಷ್ಕರಿಸಿ. ಉಳಿದ ಹಂಚಿಕೆಯಾಗದ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಗೆ ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ (CDL = CDL, POPC = 6PL ಮತ್ತು POPG = PGT ನ PDB ಮಾನೋಮರ್ ಲೈಬ್ರರಿ ID), β-DDM ಡಿಟರ್ಜೆಂಟ್ (LMT) ಮತ್ತು UQ10 ಅಣುಗಳು (U10). ಮಾದರಿ ಅಂಕಿಅಂಶಗಳು ಮತ್ತು ಫಿಟ್‌ನ ದೃಶ್ಯ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಸುಧಾರಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗದವರೆಗೆ ಸಂಪೂರ್ಣ ಆರಂಭಿಕ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಪರಿಪೂರ್ಣಗೊಳಿಸಲು ಕೂಟ್ (48) ನಲ್ಲಿ PHENIX ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ (49) ಮತ್ತು ಹಸ್ತಚಾಲಿತ ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ. ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಸ್ಥಳೀಯ ನಕ್ಷೆಯನ್ನು ತೀಕ್ಷ್ಣಗೊಳಿಸಲು LocScale (50) ಅನ್ನು ಬಳಸಿ, ಮತ್ತು ನಂತರ ಹಂಚಿಕೆಯಾಗದ ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಮತ್ತು ಹಸ್ತಚಾಲಿತ ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ ಅನ್ನು ಮಾಡೆಲಿಂಗ್ ಮಾಡುವ ಹಲವಾರು ಇತರ ಚಕ್ರಗಳನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿ.
ಆಯಾ ಸಾಂದ್ರತೆಯೊಳಗೆ ಡಾಕ್ ಮಾಡಲಾದ ಆಯಾ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು, ಕೊಫ್ಯಾಕ್ಟರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಇತರ ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಕ್ವಿನೋನ್‌ಗಳನ್ನು ಚಿತ್ರ 1 ಮತ್ತು 2 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. S18 ರಿಂದ S23. ಅಂತಿಮ ಮಾದರಿಯ ಅಂಕಿಅಂಶಗಳ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಕೋಷ್ಟಕ S1 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಬೇರೆ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟಪಡಿಸದ ಹೊರತು, UV/Vis/NIR ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ವರ್ಣಪಟಲವನ್ನು ಕ್ಯಾರಿ60 ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೀಟರ್ (ಅಜಿಲೆಂಟ್, USA) ನಲ್ಲಿ 250 nm ನಿಂದ 1000 nm ವರೆಗಿನ 1 nm ಮಧ್ಯಂತರದಲ್ಲಿ ಮತ್ತು 0.1s ಏಕೀಕರಣ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು.
1 ರ A880 ಗೆ 2 mm ಮಾರ್ಗವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಕ್ವಾರ್ಟ್ಜ್ ಕುವೆಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಮಾದರಿಯನ್ನು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿ ಮತ್ತು 400 ಮತ್ತು 1000 nm ನಡುವೆ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ವರ್ಣಪಟಲವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ. ವೃತ್ತಾಕಾರದ ಡೈಕ್ರೊಯಿಕ್ ವರ್ಣಪಟಲವನ್ನು ಜಾಸ್ಕೋ 810 ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಪೋಲರಿಮೀಟರ್ (ಜಾಸ್ಕೋ, ಜಪಾನ್) ನಲ್ಲಿ 400 nm ಮತ್ತು 950 nm ನಡುವಿನ 1 nm ಮಧ್ಯಂತರದಲ್ಲಿ 20 nm ನಿಮಿಷ-1 ಸ್ಕ್ಯಾನ್ ದರದಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು.
ಮೋಲಾರ್ ಅಳಿವಿನ ಗುಣಾಂಕವನ್ನು ಕೋರ್ ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ಸರಿಸುಮಾರು 50 ರ A880 ಗೆ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. 10μl ಪರಿಮಾಣವನ್ನು 990μl ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಬಫರ್ ಅಥವಾ ಮೆಥನಾಲ್‌ನಲ್ಲಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿ ಮತ್ತು BChl ಅವನತಿಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ವರ್ಣಪಟಲವನ್ನು ತಕ್ಷಣವೇ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ. ಪ್ರತಿ ಮೆಥನಾಲ್ ಮಾದರಿಯ BChl ಅಂಶವನ್ನು 54.8 mM-1 cm-1 ರ 771 nm ನಲ್ಲಿ ಅಳಿವಿನ ಗುಣಾಂಕದಿಂದ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅಳಿವಿನ ಗುಣಾಂಕವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (51). ಕೋರ್ ಸಂಕೀರ್ಣ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಅಳತೆ ಮಾಡಲಾದ BChl ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು 32 (RC-LH114-W) ಅಥವಾ 36 (RC-LH116) ರಿಂದ ಭಾಗಿಸಿ, ನಂತರ ಬಫರ್ ಅಳಿವಿನ ಗುಣಾಂಕದಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾದ ಅದೇ ಮಾದರಿಯ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ವರ್ಣಪಟಲವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಇದನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸಮಾನಾಂತರ. ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಗೆ ಮೂರು ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಅಳತೆಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು BChl Qy ಗರಿಷ್ಠದ ಸರಾಸರಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರಕ್ಕಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ. 878 nm ನಲ್ಲಿ ಅಳೆಯಲಾದ RC-LH114-W ನ ಅಳಿವಿನ ಗುಣಾಂಕ 3280±140 mM-1 cm-1 ಆಗಿದ್ದರೆ, 880 nm ನಲ್ಲಿ ಅಳೆಯಲಾದ RC-LH116 ನ ಅಳಿವಿನ ಗುಣಾಂಕ 3800±30 mM-1 cm-1 ಆಗಿದೆ.
(52) ರಲ್ಲಿನ ವಿಧಾನದ ಪ್ರಕಾರ UQ10 ಅನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಅಜಿಲೆಂಟ್ 1200 HPLC ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಹಿಮ್ಮುಖ ಹಂತದ HPLC (RP-HPLC) ಅನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. 0.02% (w/v) ಫೆರಿಕ್ ಕ್ಲೋರೈಡ್ ಹೊಂದಿರುವ 50μl ನ 50:50 ಮೆಥನಾಲ್:ಕ್ಲೋರೋಫಾರ್ಮ್‌ನಲ್ಲಿ ಸುಮಾರು 0.02 nmol RC-LH116 ಅಥವಾ RC-LH114-W ಅನ್ನು ಕರಗಿಸಿ, ಮತ್ತು ಪೂರ್ವ-ಸಮತೋಲನಗೊಂಡ ಬೆಕ್‌ಮನ್ ಕೌಲ್ಟರ್ ಅಲ್ಟ್ರಾಸ್ಪಿಯರ್ ODS 4.6 mm ಅನ್ನು ಚುಚ್ಚಿ 40°C ನಲ್ಲಿ HPLC ದ್ರಾವಕದಲ್ಲಿ (80:20 ಮೆಥನಾಲ್:2-ಪ್ರೊಪನಾಲ್) ×25 ಸೆಂ.ಮೀ ಕಾಲಮ್‌ನಲ್ಲಿ 1 ಮಿಲಿ-1 ನಿಮಿಷ-1 ರಲ್ಲಿ ಕರಗಿಸಿ. 275 nm (UQ10), 450 nm (ಕ್ಯಾರೊಟಿನಾಯ್ಡ್‌ಗಳು) ಮತ್ತು 780 nm (BChl) ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡಲು HPLC ದ್ರಾವಕದಲ್ಲಿ ಐಸೋಕ್ರಟಿಕ್ ಎಲ್ಯೂಷನ್ ಮಾಡಿ. 25.5 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ 275 nm ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಾಮ್‌ನಲ್ಲಿನ ಗರಿಷ್ಠ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಯಿತು, ಇದು ಯಾವುದೇ ಇತರ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಬಹುದಾದ ಸಂಯುಕ್ತಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರಲಿಲ್ಲ. 0 ರಿಂದ 5.8 nmol ವರೆಗಿನ ಶುದ್ಧ ಮಾನದಂಡಗಳ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್‌ನಿಂದ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿದ ಮಾಪನಾಂಕ ನಿರ್ಣಯ ರೇಖೆಯನ್ನು ಉಲ್ಲೇಖಿಸಿ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ UQ10 ನ ಮೋಲಾರ್ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲು ಸಂಯೋಜಿತ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ S14). ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಮೂರು ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳಲ್ಲಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ವರದಿ ಮಾಡಲಾದ ದೋಷವು ಸರಾಸರಿಯ SD ಗೆ ಅನುರೂಪವಾಗಿದೆ.
0.1 ರ ಗರಿಷ್ಠ Qy ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ RC-LH1 ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ದ್ರಾವಣವನ್ನು 30 μM ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸಿದ ಹಾರ್ಸ್ ಹಾರ್ಟ್ ಸೈಟೋಕ್ರೋಮ್ c2 (ಮೆರ್ಕ್, ಯುಕೆ) ಮತ್ತು 0 ರಿಂದ 50 μMUQ2 (ಮೆರ್ಕ್, ಯುಕೆ) ನೊಂದಿಗೆ ತಯಾರಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿ UQ2 ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಮೂರು 1-ಮಿಲಿ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ತಯಾರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಅಳತೆ ಮಾಡುವ ಮೊದಲು ಕತ್ತಲೆಗೆ ಸಂಪೂರ್ಣ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು 4°C ನಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. ದ್ರಾವಣವನ್ನು 300 nm ಜ್ವಾಲೆ/500 ಲೈನ್ ಗ್ರ್ಯಾಟಿಂಗ್, 1.24 mm ಇನ್ಲೆಟ್, 0.12 mm ಮಧ್ಯ ಮತ್ತು 0.6 mm ಔಟ್ಲೆಟ್ ಸ್ಲಿಟ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ OLIS RSM1000 ಮಾಡ್ಯುಲರ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೀಟರ್‌ಗೆ ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಪ್ರಚೋದನಾ ಬೆಳಕನ್ನು ಹೊರಗಿಡಲು ಮಾದರಿ ಫೋಟೋಟ್ಯೂಬ್ ಮತ್ತು ಉಲ್ಲೇಖ ಫೋಟೋಮಲ್ಟಿಪ್ಲೈಯರ್ ಟ್ಯೂಬ್‌ನ ಪ್ರವೇಶದ್ವಾರದಲ್ಲಿ 600 nm ಉದ್ದದ ಪಾಸ್ ಫಿಲ್ಟರ್ ಅನ್ನು ಇರಿಸಲಾಗಿದೆ. 0.15 ಸೆಕೆಂಡುಗಳ ಏಕೀಕರಣ ಸಮಯದೊಂದಿಗೆ 550 nm ನಲ್ಲಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು. 880 nm M880F2 LED (ಬೆಳಕು ಹೊರಸೂಸುವ ಡಯೋಡ್) (ಥಾರ್ಲ್ಯಾಬ್ಸ್ ಲಿಮಿಟೆಡ್, UK) ನಿಂದ 90% ತೀವ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಫೈಬರ್ ಆಪ್ಟಿಕ್ ಕೇಬಲ್ ಮೂಲಕ DC2200 ನಿಯಂತ್ರಕ (ಥಾರ್ಲ್ಯಾಬ್ಸ್ ಲಿಮಿಟೆಡ್, UK) ಮೂಲಕ ಪ್ರಚೋದನಾ ಬೆಳಕನ್ನು ಹೊರಸೂಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 90° ಕೋನದಲ್ಲಿ ಬೆಳಕಿನ ಮೂಲಕ್ಕೆ ಹೊರಸೂಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮಾದರಿಯಿಂದ ಆರಂಭದಲ್ಲಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳದ ಯಾವುದೇ ಬೆಳಕನ್ನು ಹಿಂತಿರುಗಿಸಲು ಅಳತೆ ಕಿರಣವು ಕನ್ನಡಿಗೆ ವಿರುದ್ಧವಾಗಿರುತ್ತದೆ. 50 ಸೆಕೆಂಡುಗಳ ಪ್ರಕಾಶಕ್ಕೆ 10 ಸೆಕೆಂಡುಗಳ ಮೊದಲು ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡಿ. ನಂತರ ಕ್ವಿನೊಲೊಲ್ ಸೈಟೋಕ್ರೋಮ್ c23 + ಅನ್ನು ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವ ಮಟ್ಟವನ್ನು ನಿರ್ಣಯಿಸಲು 60 ಸೆಕೆಂಡುಗಳ ಕಾಲ ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು (ಕಚ್ಚಾ ದತ್ತಾಂಶಕ್ಕಾಗಿ ಚಿತ್ರ S8 ನೋಡಿ).
0.5 ರಿಂದ 10 ಸೆಕೆಂಡುಗಳ ಒಳಗೆ (UQ2 ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿ) ರೇಖೀಯ ಆರಂಭಿಕ ದರವನ್ನು ಅಳವಡಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ UQ2 ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಎಲ್ಲಾ ಮೂರು ಮಾದರಿಗಳ ದರಗಳನ್ನು ಸರಾಸರಿ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಡೇಟಾವನ್ನು ಸಂಸ್ಕರಿಸಲಾಯಿತು. ಆಯಾ ಅಳಿವಿನ ಗುಣಾಂಕದಿಂದ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾದ RC-LH1 ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ದರವನ್ನು ವೇಗವರ್ಧಕ ದಕ್ಷತೆಯಾಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಲು ಬಳಸಲಾಯಿತು, ಇದನ್ನು ಒರಿಜಿನ್ ಪ್ರೊ 2019 (OriginLab, USA) ನಲ್ಲಿ ರೂಪಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಸ್ಪಷ್ಟ Km ಮತ್ತು Kcat ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಮೈಕೆಲಿಸ್-ಮೆಂಟೆನ್ ಮಾದರಿಗೆ ಅಳವಡಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಅಸ್ಥಿರ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆ ಮಾಪನಗಳಿಗಾಗಿ, RC-LH1 ಮಾದರಿಯನ್ನು 50 mM ಸೋಡಿಯಂ ಆಸ್ಕೋರ್ಬೇಟ್ (ಮೆರ್ಕ್, USA) ಮತ್ತು 0.4 mM ಟೆರ್ಬುಟಿನ್ (ಮೆರ್ಕ್, USA) ಹೊಂದಿರುವ IMAC ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ~2μM ಗೆ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. ಆಸ್ಕೋರ್ಬಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು ತ್ಯಾಗದ ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್ ದಾನಿಯಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಟೆರ್ಟ್-ಬ್ಯುಟಾಕ್ಲೋಫೆನ್ ಅನ್ನು QB ಪ್ರತಿರೋಧಕವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಮುಖ್ಯ RC ದಾನಿಯು ಮಾಪನ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಉದ್ದಕ್ಕೂ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿರುವುದನ್ನು (ಅಂದರೆ, ಫೋಟೋಆಕ್ಸಿಡೀಕರಣಗೊಂಡಿಲ್ಲ) ಖಚಿತಪಡಿಸುತ್ತದೆ. ಲೇಸರ್ ಮಾರ್ಗದಲ್ಲಿನ ಮಾದರಿಯು ಉದ್ರೇಕ ಪಲ್ಸ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ಡಾರ್ಕ್ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಗೆ ಸಾಕಷ್ಟು ಸಮಯವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು 2 mm ಆಪ್ಟಿಕಲ್ ಮಾರ್ಗದ ಉದ್ದದೊಂದಿಗೆ ಕಸ್ಟಮ್ ತಿರುಗುವ ಕೋಶಕ್ಕೆ (ಸುಮಾರು 0.1 ಮೀ ವ್ಯಾಸ, 350 RPM) ಸರಿಸುಮಾರು 3 ಮಿಲಿ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. 1 kHz (NIR ಗೆ 20 nJ ಅಥವಾ Vis ಗೆ 100 nJ) ಪುನರಾವರ್ತನೆಯ ದರದಲ್ಲಿ 880 nm ನಲ್ಲಿ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸಲು Ti: ನೀಲಮಣಿ ಲೇಸರ್ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು (ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾ ಫಿಸಿಕ್ಸ್, USA) ವರ್ಧಿಸಲು ~100-fs ಲೇಸರ್ ಪಲ್ಸ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ. ಡೇಟಾವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸುವ ಮೊದಲು, ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸುಮಾರು 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ಬೆಳಕಿಗೆ ಒಡ್ಡಿರಿ. ಒಡ್ಡಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯು QA ನಿಷ್ಕ್ರಿಯತೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ (ಬಹುಶಃ ಒಮ್ಮೆ ಅಥವಾ ಎರಡು ಬಾರಿ QA ಅನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ). ಆದರೆ ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ಹಿಂತಿರುಗಿಸಬಹುದಾಗಿದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ದಯವಿಟ್ಟು ಗಮನಿಸಿ ಏಕೆಂದರೆ ದೀರ್ಘಾವಧಿಯ ಡಾರ್ಕ್ ರೂಪಾಂತರದ ನಂತರ, RC ನಿಧಾನವಾಗಿ QA ಚಟುವಟಿಕೆಗೆ ಮರಳುತ್ತದೆ. -10 ರಿಂದ 7000 ps ವಿಳಂಬ ಸಮಯದೊಂದಿಗೆ ಅಸ್ಥಿರ ವರ್ಣಪಟಲವನ್ನು ಅಳೆಯಲು ಹೆಲಿಯೊಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ (ಅಲ್ಟ್ರಾಫಾಸ್ಟ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್, USA) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಡೇಟಾ ಸೆಟ್‌ಗಳನ್ನು ಗುಂಪು ಮಾಡಲು, ನಂತರ ವಿಲೀನಗೊಳಿಸಲು ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲು ಸರ್ಫೇಸ್ ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ಲೋರರ್ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ (ಅಲ್ಟ್ರಾಫಾಸ್ಟ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್, USA) ಬಳಸಿ. ಕೊಳೆಯುವಿಕೆಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಡಿಫರೆನ್ಷಿಯಲ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾವನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಸಂಯೋಜಿತ ಡೇಟಾ ಸೆಟ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲು ಕಾರ್ಪೆಟ್‌ವ್ಯೂ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಪ್ಯಾಕೇಜ್ (ಲೈಟ್ ಕನ್ವರ್ಶನ್ ಲಿಮಿಟೆಡ್, ಲಿಥುವೇನಿಯಾ) ಅನ್ನು ಬಳಸಿ, ಅಥವಾ ಮೂಲದಲ್ಲಿ (OriginLab, USA) ಏಕ-ತರಂಗಾಂತರ ರೋಹಿತದ ವಿಕಸನಕ್ಕೆ ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳಲು ಉಪಕರಣ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯೊಂದಿಗೆ ಬಹು ಘಾತಾಂಕಗಳನ್ನು ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಬಳಸಿ.
ಮೇಲೆ ಹೇಳಿದಂತೆ (53), RC ಮತ್ತು ಬಾಹ್ಯ LH2 ಆಂಟೆನಾ ಎರಡನ್ನೂ ಹೊಂದಿರದ LH1 ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ದ್ಯುತಿಸಂಶ್ಲೇಷಕ ಫಿಲ್ಮ್ ಅನ್ನು ತಯಾರಿಸಲಾಯಿತು. ಪೊರೆಯನ್ನು 20 mM ಟ್ರಿಸ್ (pH 8.0) ನಲ್ಲಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ 2 mm ಆಪ್ಟಿಕಲ್ ಮಾರ್ಗದೊಂದಿಗೆ ಕ್ವಾರ್ಟ್ಜ್ ಕ್ಯೂವೆಟ್‌ಗೆ ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. -10 ರಿಂದ 7000 ps ವಿಳಂಬ ಸಮಯದೊಂದಿಗೆ 540 nm ನಲ್ಲಿ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸಲು 30nJ ಲೇಸರ್ ಪಲ್ಸ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. Rps. pal ಮಾದರಿಗಾಗಿ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಡೇಟಾ ಸೆಟ್ ಅನ್ನು ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗೊಳಿಸಿ.
4°C ನಲ್ಲಿ 150,000 RCF ನಲ್ಲಿ 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮೂಲಕ ಪೊರೆಯನ್ನು ಉಂಡೆಗಳನ್ನಾಗಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ 880 nm ನಲ್ಲಿ ಅದರ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ಮತ್ತು 200 mM NaCl ನಲ್ಲಿ ಮತ್ತೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. 4°C ನಲ್ಲಿ ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ 2% (w/v) β-DDM ನಲ್ಲಿ ನಿಧಾನವಾಗಿ ಬೆರೆಸಿ ಪೊರೆಯನ್ನು ಕರಗಿಸಿ. ಮಾದರಿಯನ್ನು 100 mM ಟ್ರೈಥೈಲಾಮೋನಿಯಮ್ ಕಾರ್ಬೋನೇಟ್ (pH 8.0) (TEAB; ಮೆರ್ಕ್, UK) ನಲ್ಲಿ 2.5 mg ml-1 ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗೆ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು (ಬಯೋ-ರಾಡ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ). ಈ ಹಿಂದೆ ಪ್ರಕಟವಾದ ವಿಧಾನದಿಂದ (54) ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಸ್ಕರಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು, ಇದು 50 μg ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು 1% (w/v) ಸೋಡಿಯಂ ಲಾರೇಟ್ (ಮೆರ್ಕ್, UK) ಹೊಂದಿರುವ ಒಟ್ಟು 50 μl TEAB ಗೆ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವುದರೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಾರಂಭವಾಯಿತು. 60 ಸೆಕೆಂಡುಗಳ ಕಾಲ ಸೋನಿಕೇಶನ್ ನಂತರ, ಅದನ್ನು 37°C ನಲ್ಲಿ 5 mM ಟ್ರಿಸ್(2-ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿಥೈಲ್)ಫಾಸ್ಫೈನ್ (ಮೆರ್ಕ್, ಯುಕೆ) ನೊಂದಿಗೆ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಎಸ್-ಆಲ್ಕೈಲೇಷನ್‌ಗಾಗಿ, ಮಾದರಿಯನ್ನು 10 mM ಮೀಥೈಲ್ ಎಸ್-ಮೀಥೈಲ್ಥಿಯೋಮೆಥೇನ್‌ಸಲ್ಫೋನೇಟ್ (ಮೆರ್ಕ್, ಯುಕೆ) ನೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಬೇಕು ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 200 mM ಐಸೊಪ್ರೊಪನಾಲ್ ಸ್ಟಾಕ್ ದ್ರಾವಣದಿಂದ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಸೇರಿಸಬೇಕು. 2 μg ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್/ಎಂಡೋಪ್ರೋಟೀನೇಸ್ ಲೈಸ್-ಸಿ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು (ಪ್ರೊಮೆಗಾ ಯುಕೆ) ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರೋಟಿಯೋಲೈಟಿಕ್ ಜೀರ್ಣಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 37°C ನಲ್ಲಿ 3 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಬೇಕು. 50 μl ಈಥೈಲ್ ಅಸಿಟೇಟ್ ಮತ್ತು 10 μl 10% (v/v) LC ದರ್ಜೆಯ ಟ್ರೈಫ್ಲೋರೋಅಸೆಟಿಕ್ ಆಮ್ಲ (TFA; ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, ಯುಕೆ) ಮತ್ತು 60 ಸೆಕೆಂಡುಗಳ ಕಾಲ ವೋರ್ಟೆಕ್ಸಿಂಗ್ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಲಾರೇಟ್ ಸರ್ಫ್ಯಾಕ್ಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಯಿತು. ಹಂತ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆಯನ್ನು 15,700 RCF ನಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮೂಲಕ ಉತ್ತೇಜಿಸಲಾಯಿತು. ತಯಾರಕರ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಪ್ರಕಾರ, ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಹೊಂದಿರುವ ಕೆಳಗಿನ ಹಂತವನ್ನು ಎಚ್ಚರಿಕೆಯಿಂದ ಆಸ್ಪಿರೇಟ್ ಮಾಡಲು ಮತ್ತು ಡಿಸಾಲ್ಟ್ ಮಾಡಲು C18 ಸ್ಪಿನ್ ಕಾಲಮ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, ಯುಕೆ) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ನಿರ್ವಾತ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮೂಲಕ ಒಣಗಿದ ನಂತರ, ಮಾದರಿಯನ್ನು 0.5% TFA ಮತ್ತು 3% ಅಸಿಟೋನಿಟ್ರೈಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಕರಗಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 500 ng ಅನ್ನು ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದ ಸಿಸ್ಟಮ್ ನಿಯತಾಂಕಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲಾದ ನ್ಯಾನೊಫ್ಲೋ RP ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿಯಿಂದ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು.
Rps. palustris ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್ ಡೇಟಾಬೇಸ್‌ಗಾಗಿ ಹುಡುಕಲು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ MaxQuant v.1.5.3.30 (56) ಬಳಸಿ (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ಸ್ ಡೇಟಾವನ್ನು PRIDE ಪಾಲುದಾರ ರೆಪೊಸಿಟರಿಯ ಮೂಲಕ (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ಡೇಟಾಸೆಟ್ ಐಡೆಂಟಿಫೈಯರ್ PXD020402 ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್‌ಎಕ್ಸ್‌ಚೇಂಜ್ ಅಲೈಯನ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಠೇವಣಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.
ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಪ್ರೇ ಅಯಾನೀಕರಣ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿಯೊಂದಿಗೆ RPLC ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, RC-LH1 ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ Rps ನಿಂದ ತಯಾರಿಸಲಾಯಿತು. ಹಿಂದೆ ಪ್ರಕಟಿಸಲಾದ ವಿಧಾನವನ್ನು (16) ಬಳಸಿಕೊಂಡು, ಪ್ಯಾಲುಸ್ಟ್ರಿಸ್ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯು 20 mM ಹೆಪ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ 2 mg ml-1 (pH 7.8), 100 mM NaCl ಮತ್ತು 0.03% (w/v) β- (ಬಯೋ-ರಾಡ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ) ) DDM ಆಗಿತ್ತು. ತಯಾರಕರ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಪ್ರಕಾರ, ಅವಕ್ಷೇಪನ ವಿಧಾನದ ಮೂಲಕ 10 μg ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲು 2D ಶುದ್ಧೀಕರಣ ಕಿಟ್ (GE ಹೆಲ್ತ್‌ಕೇರ್, USA) ಅನ್ನು ಬಳಸಿ ಮತ್ತು ಅವಕ್ಷೇಪನವನ್ನು 20 μl 60% (v/v) ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲ (FA), 20% (v/v) ಅಸಿಟೋನಿಟ್ರೈಲ್ ಮತ್ತು 20% (v/v) ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಕರಗಿಸಿ. ಐದು ಮೈಕ್ರೋಲೀಟರ್‌ಗಳನ್ನು RPLC (ಡಯೋನೆಕ್ಸ್ RSLC) ಮೂಲಕ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ (ಮ್ಯಾಕ್ಸಿಸ್ UHR-TOF, ಬ್ರೂಕರ್) ನೊಂದಿಗೆ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ. 60°C ಮತ್ತು 100μlmin -1 ನಲ್ಲಿ ಬೇರ್ಪಡಿಸುವಿಕೆಗಾಗಿ MabPac 1.2×100 mm ಕಾಲಮ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, UK) ಬಳಸಿ, 85% (v / v) ದ್ರಾವಕ A [0.1% (v / v) FA ಮತ್ತು 0.02% (V/v) TFA ಜಲೀಯ ದ್ರಾವಣ] ನಿಂದ 85% (v/v) ದ್ರಾವಕ B [0.1%(v/v) FA ಮತ್ತು 0.02%(v/v) 90%(v/v) ಅಸಿಟೋನಿಟ್ರೈಲ್ TFA ನಲ್ಲಿ]] ಪ್ರಮಾಣಿತ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಪ್ರೇ ಅಯಾನೀಕರಣ ಮೂಲ ಮತ್ತು ಡೀಫಾಲ್ಟ್ ನಿಯತಾಂಕಗಳನ್ನು 60 ನಿಮಿಷಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಕಾಲ ಬಳಸಿ, ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ 100 ರಿಂದ 2750 m/z (ಮಾಸ್-ಟು-ಚಾರ್ಜ್ ಅನುಪಾತ) ಪಡೆಯುತ್ತದೆ. ExPASy ಬಯೋಇನ್ಫರ್ಮ್ಯಾಟಿಕ್ಸ್ ಸಂಪನ್ಮೂಲ ಪೋರ್ಟಲ್ FindPept ಉಪಕರಣದ (https://web.expasy.org/findpept/) ಸಹಾಯದಿಂದ, ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್ ಅನ್ನು ಸಂಕೀರ್ಣದ ಉಪಘಟಕಗಳಿಗೆ ನಕ್ಷೆ ಮಾಡಿ.
ಕೋಶಗಳನ್ನು 100 ಮಿಲಿ NF-ಕಡಿಮೆ (10μMm-2 s-1), ಮಧ್ಯಮ (30μMm-2 s-1) ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ (300μMm-2 s-1) ಬೆಳಕಿನಲ್ಲಿ 72 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು. 100 ಮಿಲಿ ಸ್ಕ್ರೂ-ಟಾಪ್ ಬಾಟಲಿಯಲ್ಲಿ M22 ಮಧ್ಯಮ (ಅಮೋನಿಯಂ ಸಲ್ಫೇಟ್ ಅನ್ನು ಬಿಟ್ಟು ಸೋಡಿಯಂ ಸಕ್ಸಿನೇಟ್ ಅನ್ನು ಸೋಡಿಯಂ ಅಸಿಟೇಟ್‌ನಿಂದ ಬದಲಾಯಿಸುವ M22 ಮಾಧ್ಯಮ) (23). ಐದು 30-ಸೆಕೆಂಡ್ ಚಕ್ರಗಳಲ್ಲಿ, ಕೋಶಗಳನ್ನು ಲೈಸ್ ಮಾಡಲು 0.1 ಮೈಕ್ರಾನ್ ಗಾಜಿನ ಮಣಿಗಳನ್ನು 1:1 ಪರಿಮಾಣ ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ಮಣಿಗಳಿಂದ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತಿತ್ತು ಮತ್ತು 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ ತಂಪಾಗಿಸಲಾಗುತ್ತಿತ್ತು. ಕರಗದ ವಸ್ತು, ಮುರಿಯದ ಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು ಗಾಜಿನ ಮಣಿಗಳನ್ನು ಬೆಂಚ್‌ಟಾಪ್ ಮೈಕ್ರೋಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಜ್‌ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 16,000 RCF ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮೂಲಕ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು. 10 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ 40/15% (w/w) ಸುಕ್ರೋಸ್ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್‌ನೊಂದಿಗೆ 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ನಲ್ಲಿ 100,000 RCF ನೊಂದಿಗೆ Ti 70.1 ರೋಟರ್‌ನಲ್ಲಿ ಪೊರೆಯನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು.
ನಮ್ಮ ಹಿಂದಿನ ಕೆಲಸದಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ, PufW (16) ನಲ್ಲಿ ಹಿಸ್ ಟ್ಯಾಗ್‌ನ ಇಮ್ಯುನೊಡೆಟೆಕ್ಷನ್. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, 2x SDS ಲೋಡಿಂಗ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ (ಮೆರ್ಕ್, ಯುಕೆ) ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಕೋರ್ ಕಾಂಪ್ಲೆಕ್ಸ್ (11.8 nM) ಅಥವಾ RC ಯ ಅದೇ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಪೊರೆಯನ್ನು (ಕಡಿಮೆಯಾದ ವ್ಯತ್ಯಾಸ ವರ್ಣಪಟಲವನ್ನು ಕಳೆಯುವ ಮೂಲಕ ಆಕ್ಸಿಡೀಕರಣದಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಬಣ್ಣದ ಜೆಲ್ ಮೇಲಿನ ಲೋಡ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿಸುವುದು) ಎರಡು ಬಾರಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿಕೃತಿ 12% ಬಿಸ್-ಟ್ರಿಸ್ ನುಪೇಜ್ ಜೆಲ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, ಯುಕೆ) ಮೇಲೆ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು. RC-L ಉಪಘಟಕವನ್ನು ಲೋಡ್ ಮಾಡಲು ಮತ್ತು ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲು ಕೂಮಾಸ್ಸಿ ಬ್ರಿಲಿಯಂಟ್ ಬ್ಲೂ (ಬಯೋ-ರಾಡ್, ಯುಕೆ) ನೊಂದಿಗೆ ಜೆಲ್ ಅನ್ನು ಬಣ್ಣಿಸಲಾಗಿದೆ. ಎರಡನೇ ಜೆಲ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಇಮ್ಯುನೊಅಸ್ಸೇಗಾಗಿ ಮೆಥನಾಲ್-ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿದ ಪಾಲಿವಿನೈಲಿಡಿನ್ ಫ್ಲೋರೈಡ್ (PVDF) ಮೆಂಬರೇನ್‌ಗೆ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, ಯುಕೆ) ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು. PVDF ಪೊರೆಯನ್ನು 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 ಮತ್ತು 5% (w / v) ಕೆನೆ ತೆಗೆದ ಹಾಲಿನ ಪುಡಿಯಲ್ಲಿ ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ ಆಂಟಿ-ಹಿಸ್ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ (1:1000 A190-114A, ಬೆಥೈಲ್ ಲ್ಯಾಬೋರೇಟರೀಸ್, USA ನಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಕಾಯ ಬಫರ್ ಅನ್ನು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿ [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl ಮತ್ತು 0.05% (v/v) Tween-20] ನಲ್ಲಿ 4 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿಕಾಯ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 3 ಬಾರಿ ತೊಳೆಯುವ ನಂತರ, ಪೊರೆಯನ್ನು ಹಾರ್ಸ್‌ರಡೈಶ್ ಪೆರಾಕ್ಸಿಡೇಸ್ (ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್, ಯುಕೆ) ಆಂಟಿ-ಮೌಸ್ ಸೆಕೆಂಡರಿ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ (ಪ್ರತಿಕಾಯ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ 1:10,000 ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ) ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಯಿತು. WESTAR ETA C 2.0 ಕೆಮಿಲುಮಿನೆಸೆನ್ಸ್ ತಲಾಧಾರ (ಸೈನಾಜೆನ್, ಇಟಲಿ) ಮತ್ತು ಅಮರ್ಶ್ಯಾಮ್ ಇಮೇಜರ್ 600 (GE ಹೆಲ್ತ್‌ಕೇರ್, ಯುಕೆ) ಬಳಸಿ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವಿಕೆಯನ್ನು ಅನುಮತಿಸಲು (ಪ್ರತಿಕಾಯ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ 3 ತೊಳೆಯುವಿಕೆಯ ನಂತರ 5 ನಿಮಿಷಗಳು) ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಿ.
ಇಮೇಜ್‌ಜೆ (57) ನಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿ ಬಣ್ಣದ ಜೆಲ್ ಅಥವಾ ಇಮ್ಯುನೊಅಸ್ಸೇ ಲೇನ್‌ನ ತೀವ್ರತೆಯ ವಿತರಣೆಯನ್ನು ಚಿತ್ರಿಸುವ ಮೂಲಕ, ಶಿಖರದ ಅಡಿಯಲ್ಲಿರುವ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು ಆರ್‌ಸಿ-ಎಲ್ (ಬಣ್ಣದ ಜೆಲ್) ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್-ಡಬ್ಲ್ಯೂ (ಇಮ್ಯುನೊಅಸ್ಸೇ) ಗಳ ತೀವ್ರತೆಯ ಅನುಪಾತವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಚಿತ್ರವನ್ನು ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗೊಳಿಸಿ. ಶುದ್ಧ ಆರ್‌ಸಿ-ಎಲ್‌ಎಚ್‌114-ಡಬ್ಲ್ಯೂ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಆರ್‌ಸಿ-ಎಲ್‌ನ ಅನುಪಾತವು ಪ್ರೋಟೀನ್-ಡಬ್ಲ್ಯೂಗೆ 1:1 ಎಂದು ಊಹಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು ಅದಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಸಂಪೂರ್ಣ ಡೇಟಾ ಸೆಟ್ ಅನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಈ ಅನುಪಾತಗಳನ್ನು ಮೋಲಾರ್ ಅನುಪಾತಗಳಾಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಈ ಲೇಖನಕ್ಕೆ ಪೂರಕ ಸಾಮಗ್ರಿಗಳಿಗಾಗಿ, ದಯವಿಟ್ಟು http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 ನೋಡಿ.
ಇದು ಕ್ರಿಯೇಟಿವ್ ಕಾಮನ್ಸ್ ಅಟ್ರಿಬ್ಯೂಷನ್ ಪರವಾನಗಿಯ ನಿಯಮಗಳ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ವಿತರಿಸಲಾದ ಮುಕ್ತ ಪ್ರವೇಶ ಲೇಖನವಾಗಿದೆ. ಮೂಲ ಕೃತಿಯನ್ನು ಸರಿಯಾಗಿ ಉಲ್ಲೇಖಿಸಿದ್ದರೆ, ಯಾವುದೇ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಅನಿಯಂತ್ರಿತ ಬಳಕೆ, ವಿತರಣೆ ಮತ್ತು ಪುನರುತ್ಪಾದನೆಗೆ ಲೇಖನವು ಅವಕಾಶ ನೀಡುತ್ತದೆ.
ಗಮನಿಸಿ: ನೀವು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಿದ ವ್ಯಕ್ತಿಗೆ ನೀವು ಇಮೇಲ್ ಅನ್ನು ನೋಡಬೇಕೆಂದು ಬಯಸುತ್ತೀರಿ ಮತ್ತು ಅದು ಸ್ಪ್ಯಾಮ್ ಅಲ್ಲ ಎಂದು ತಿಳಿಯುವಂತೆ ನಿಮ್ಮ ಇಮೇಲ್ ವಿಳಾಸವನ್ನು ಒದಗಿಸುವಂತೆ ಮಾತ್ರ ನಾವು ಕೇಳುತ್ತೇವೆ. ನಾವು ಯಾವುದೇ ಇಮೇಲ್ ವಿಳಾಸಗಳನ್ನು ಸೆರೆಹಿಡಿಯುವುದಿಲ್ಲ.
ನೀವು ಸಂದರ್ಶಕರೇ ಎಂಬುದನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ಮತ್ತು ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಸ್ಪ್ಯಾಮ್ ಸಲ್ಲಿಕೆಯನ್ನು ತಡೆಯಲು ಈ ಪ್ರಶ್ನೆಯನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಡೇವಿಡ್ ಜೆಕೆ ಸ್ವೈನ್ಸ್‌ಬರಿ, ಪಾರ್ಕ್ ಕಿಯಾನ್, ಫಿಲಿಪ್ ಜೆ. ಜಾಕ್ಸನ್, ಕೈಟ್ಲಿನ್ ಎಂ. ಫೇರೀಸ್, ಡೇರಿಯಸ್ಜ್ ಎಂ. ನೀಡ್ಜ್‌ವೀಡ್ಜ್‌ಕಿ, ಎಲಿಜಬೆತ್ ಸಿ. ಮಾರ್ಟಿನ್, ಡೇವಿಡ್ ಎ. ಫಾರ್ಮರ್, ಲೋರ್ನಾ ಎ. ಮ್ಯಾಲೋನ್, ರೆಬೆಕ್ಕಾ ಎಫ್. ಥಾಂಪ್ಸನ್, ನೀಲ್ ಎ. ರಾನ್ಸನ್, ಡೇನಿಯಲ್ ಪಿ ಕ್ಯಾನಿಫ್, ಮಾರ್ಕ್ ಜೆ. ಡಿಕ್‌ಮನ್, ಡೀವಿ ಹೋಲ್ಟನ್, ಕ್ರಿಸ್ಟೀನ್ ಕಿರ್ಮೈಯರ್, ಆಂಡ್ರ್ಯೂ ಹಿಚ್‌ಕಾಕ್, ಸಿ. ನೀಲ್ ಹಂಟರ್
ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾ ಕೇಂದ್ರದಲ್ಲಿರುವ ಬೆಳಕಿನ ಬಲೆ 1 ಸಂಕೀರ್ಣದ ಹೆಚ್ಚಿನ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ರಚನೆಯು ಕ್ವಿನೋನ್ ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರದ ಬಗ್ಗೆ ಹೊಸ ಒಳನೋಟಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.
ಡೇವಿಡ್ ಜೆಕೆ ಸ್ವೈನ್ಸ್‌ಬರಿ, ಪಾರ್ಕ್ ಕಿಯಾನ್, ಫಿಲಿಪ್ ಜೆ. ಜಾಕ್ಸನ್, ಕೈಟ್ಲಿನ್ ಎಂ. ಫೇರೀಸ್, ಡೇರಿಯಸ್ಜ್ ಎಂ. ನೀಡ್ಜ್‌ವೀಡ್ಜ್‌ಕಿ, ಎಲಿಜಬೆತ್ ಸಿ. ಮಾರ್ಟಿನ್, ಡೇವಿಡ್ ಎ. ಫಾರ್ಮರ್, ಲೋರ್ನಾ ಎ. ಮ್ಯಾಲೋನ್, ರೆಬೆಕ್ಕಾ ಎಫ್. ಥಾಂಪ್ಸನ್, ನೀಲ್ ಎ. ರಾನ್ಸನ್, ಡೇನಿಯಲ್ ಪಿ ಕ್ಯಾನಿಫ್, ಮಾರ್ಕ್ ಜೆ. ಡಿಕ್‌ಮನ್, ಡೀವಿ ಹೋಲ್ಟನ್, ಕ್ರಿಸ್ಟೀನ್ ಕಿರ್ಮೈಯರ್, ಆಂಡ್ರ್ಯೂ ಹಿಚ್‌ಕಾಕ್, ಸಿ. ನೀಲ್ ಹಂಟರ್
ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾ ಕೇಂದ್ರದಲ್ಲಿರುವ ಬೆಳಕಿನ ಬಲೆ 1 ಸಂಕೀರ್ಣದ ಹೆಚ್ಚಿನ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ರಚನೆಯು ಕ್ವಿನೋನ್ ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರದ ಬಗ್ಗೆ ಹೊಸ ಒಳನೋಟಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.
©2021 ಅಮೇರಿಕನ್ ಅಸೋಸಿಯೇಷನ್ ​​ಫಾರ್ ದಿ ಅಡ್ವಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಟ್ ಆಫ್ ಸೈನ್ಸ್. ಎಲ್ಲಾ ಹಕ್ಕುಗಳನ್ನು ಕಾಯ್ದಿರಿಸಲಾಗಿದೆ. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ಮತ್ತು COUNTER ನ ಪಾಲುದಾರ. ಸೈನ್ಸ್ ಅಡ್ವಾನ್ಸ್ ISSN 2375-2548.