ಪ್ರಸ್ತುತ *ಪ್ರಸ್ತುತ ವಿಳಾಸ: ಕಲೋನ್ 50931, ಜರ್ಮನಿ, ವಯಸ್ಸಾಗುವಿಕೆಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಕಾಯಿಲೆಗಳಲ್ಲಿ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಒತ್ತಡದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಕುರಿತು ಕಲೋನ್ ಎಕ್ಸಲೆನ್ಸ್ ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಸಂಶೋಧನೆ (CECAD).
ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಕಾಯಿಲೆಗಳ ನರಕ್ಷಯವನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಲಾಗದು ಎಂದು ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಏಕೆಂದರೆ ನರಕೋಶಗಳ ಚಯಾಪಚಯ ಪ್ಲಾಸ್ಟಿಟಿ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ದೇಹದಲ್ಲಿನ ನರಕೋಶ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಜೀವಕೋಶ ಸ್ವಾಯತ್ತತೆಯ ಮೇಲೆ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಸರಿಯಾಗಿ ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲಾಗಿಲ್ಲ. ಇಲ್ಲಿ, ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸಿದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಸಮ್ಮಿಳನ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್‌ನಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ಪ್ರಗತಿಶೀಲ OXPHOS ಕೊರತೆಯೊಂದಿಗೆ ಪುರ್ಕಿಂಜೆ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳ ಕೋಶ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್ ಅನ್ನು ನಾವು ಪರಿಚಯಿಸುತ್ತೇವೆ. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯು ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ಸ್ ಕ್ಷೇತ್ರದಲ್ಲಿ ಆಳವಾದ ಬದಲಾವಣೆಯನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಅಂತಿಮವಾಗಿ ಜೀವಕೋಶದ ಸಾವಿಗೆ ಮೊದಲು ನಿಖರವಾದ ಚಯಾಪಚಯ ಕಾರ್ಯಕ್ರಮಗಳ ಅನುಕ್ರಮ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಯಿತು. ಅನಿರೀಕ್ಷಿತವಾಗಿ, ಪೈರುವೇಟ್ ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿಲೇಸ್ (PCx) ಮತ್ತು TCA ಚಕ್ರದ ಮಧ್ಯಂತರಗಳನ್ನು ಪೂರೈಸುವ ಇತರ ವಯಸ್ಸಾದ ವಿರೋಧಿ ಕಿಣ್ವಗಳ ಸ್ಪಷ್ಟ ಪ್ರಚೋದನೆಯನ್ನು ನಾವು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ. PCx ಅನ್ನು ಉಲ್ಬಣಗೊಳಿಸಿದ ಆಕ್ಸಿಡೇಟಿವ್ ಒತ್ತಡ ಮತ್ತು ನರಕ್ಷಯರೋಗವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುವುದು, OXPHOS ಕೊರತೆಯಿರುವ ನರಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಅಪಧಮನಿಕಾಠಿಣ್ಯವು ರಕ್ಷಣಾತ್ಮಕ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಕೊನೆಯದಾಗಿ ಕ್ಷೀಣಿಸಿದ ನರಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಸಮ್ಮಿಳನದ ಪುನಃಸ್ಥಾಪನೆಯು ಈ ಚಯಾಪಚಯ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಹಿಮ್ಮೆಟ್ಟಿಸುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಜೀವಕೋಶದ ಸಾವನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಗೆ ಸ್ಥಿತಿಸ್ಥಾಪಕತ್ವವನ್ನು ನೀಡುವ ಹಿಂದೆ ತಿಳಿದಿಲ್ಲದ ಮಾರ್ಗಗಳನ್ನು ನಮ್ಮ ಸಂಶೋಧನೆಗಳು ಗುರುತಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ರೋಗದ ಕೊನೆಯ ಹಂತಗಳಲ್ಲಿಯೂ ಸಹ ನರಕ್ಷಯವನ್ನು ಹಿಮ್ಮುಖಗೊಳಿಸಬಹುದು ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ.
ನರಕೋಶದ ಶಕ್ತಿಯ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುವಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾದ ಕೇಂದ್ರ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಮಾನವ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಕಾಯಿಲೆಗಳಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ವ್ಯಾಪಕವಾದ ನರವೈಜ್ಞಾನಿಕ ಲಕ್ಷಣಗಳು ಒತ್ತಿಹೇಳುತ್ತವೆ. ಈ ರೋಗಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನವು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಜೀನ್ ರೂಪಾಂತರಗಳಿಂದ ಉಂಟಾಗುತ್ತವೆ (1, 2) ಅಥವಾ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್‌ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಜೀನ್ ನಾಶ, ಇದು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಡಿಎನ್‌ಎ (mtDNA) ಯ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ಪರೋಕ್ಷವಾಗಿ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ (3, 4). ಪ್ರಾಣಿಗಳ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿನ ಕೆಲಸವು ಸುತ್ತಮುತ್ತಲಿನ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿನ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ, ಸಂಪ್ರದಾಯವಾದಿ ಚಯಾಪಚಯ ಮಾರ್ಗಗಳನ್ನು (5-7) ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಬಹುದು ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ, ಇದು ಈ ಸಂಕೀರ್ಣ ರೋಗಗಳ ರೋಗಕಾರಕತೆಯ ಆಳವಾದ ತಿಳುವಳಿಕೆಗೆ ಪ್ರಮುಖ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ. ಇದಕ್ಕೆ ತದ್ವಿರುದ್ಧವಾಗಿ, ಮೆದುಳಿನ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಅಡೆನೊಸಿನ್ ಟ್ರೈಫಾಸ್ಫೇಟ್ (ATP) ಉತ್ಪಾದನೆಯ ಸಾಮಾನ್ಯ ವೈಫಲ್ಯದಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳ ಚಯಾಪಚಯ ಬದಲಾವಣೆಗಳ ಬಗ್ಗೆ ನಮ್ಮ ತಿಳುವಳಿಕೆ ಮೂಲಭೂತವಾಗಿದೆ (8), ರೋಗವನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟಲು ಅಥವಾ ತಡೆಗಟ್ಟಲು ಬಳಸಬಹುದಾದ ಚಿಕಿತ್ಸಕ ಗುರಿಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವ ಅಗತ್ಯವನ್ನು ಒತ್ತಿಹೇಳುತ್ತದೆ. ನರಕ್ಷಯವನ್ನು ತಡೆಯಿರಿ (9). ಮಾಹಿತಿಯ ಕೊರತೆಯೆಂದರೆ, ಸುತ್ತಮುತ್ತಲಿನ ಅಂಗಾಂಶಗಳ ಜೀವಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ನರ ಕೋಶಗಳು ಬಹಳ ಸೀಮಿತ ಚಯಾಪಚಯ ನಮ್ಯತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (10). ಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಲು ಮತ್ತು ಗಾಯ ಮತ್ತು ರೋಗ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಿಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸಲು ನರಕೋಶಗಳಿಗೆ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಗಳ ಪೂರೈಕೆಯನ್ನು ಸಂಘಟಿಸುವಲ್ಲಿ ಈ ಕೋಶಗಳು ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರ ವಹಿಸುತ್ತವೆ, ಮೆದುಳಿನ ಅಂಗಾಂಶದ ಸವಾಲಿನ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಿಗೆ ಜೀವಕೋಶ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವು ಬಹುತೇಕ ಗ್ಲಿಯಲ್ ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ (11-14). ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಮೆದುಳಿನ ಅಂಗಾಂಶದ ಅಂತರ್ಗತ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ನರಕೋಶದ ಉಪಗುಂಪುಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಭವಿಸುವ ಚಯಾಪಚಯ ಬದಲಾವಣೆಗಳ ಅಧ್ಯಯನವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ತಡೆಯುತ್ತದೆ. ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ, ನರಕೋಶಗಳಲ್ಲಿನ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ನಿಖರವಾದ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಮತ್ತು ಚಯಾಪಚಯ ಪರಿಣಾಮಗಳ ಬಗ್ಗೆ ಸ್ವಲ್ಪವೇ ತಿಳಿದಿದೆ.
ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಚಯಾಪಚಯ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಹೊರ ಪೊರೆಯ ಸಮ್ಮಿಳನ (Mfn2) ನಾಶದಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ನರ ವಿಘಟನೆಯ ವಿವಿಧ ಹಂತಗಳಲ್ಲಿ ನಾವು ಪುರ್ಕಿಂಜೆ ನರಕೋಶಗಳನ್ನು (PNs) ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಮಾನವರಲ್ಲಿ Mfn2 ರೂಪಾಂತರಗಳು ಚಾರ್ಕೋಟ್-ಮೇರಿ-ಟೂತ್ ಟೈಪ್ 2A (15) ಎಂದು ಕರೆಯಲ್ಪಡುವ ಆನುವಂಶಿಕ ಮೋಟಾರ್ ಸಂವೇದನಾ ನರರೋಗದ ರೂಪದೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿದ್ದರೂ, ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ Mfn2 ನ ಷರತ್ತುಬದ್ಧ ನಾಶವು ಆಕ್ಸಿಡೀಕರಣ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ (OXPHOS) ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಉತ್ತಮವಾಗಿ ಗುರುತಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಪ್ರಚೋದನೆಯಾಗಿದೆ. ವಿವಿಧ ನರಕೋಶ ಉಪವಿಭಾಗಗಳು (16-19) ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಉಂಟಾಗುವ ನರ ವಿಘಟನಾ ಫಿನೋಟೈಪ್ ಚಲನೆಯ ಅಸ್ವಸ್ಥತೆಗಳು (18, 19) ಅಥವಾ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಅಟಾಕ್ಸಿಯಾ (16) ನಂತಹ ಪ್ರಗತಿಶೀಲ ನರವೈಜ್ಞಾನಿಕ ಲಕ್ಷಣಗಳೊಂದಿಗೆ ಇರುತ್ತದೆ. ಲೇಬಲ್-ಮುಕ್ತ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ (LFQ) ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ಸ್, ಮೆಟಾಬಾಲೊಮಿಕ್ಸ್, ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಮತ್ತು ವೈರೋಲಾಜಿಕಲ್ ವಿಧಾನಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ಬಳಸುವ ಮೂಲಕ, ಪ್ರಗತಿಶೀಲ ನರ ವಿಘಟನೆಯು ಪೈರುವೇಟ್ ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿಲೇಸ್ (PCx) ಮತ್ತು PN ಗಳ ಅಪಧಮನಿಕಾಠಿಣ್ಯದಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಇತರ ಅಂಶಗಳನ್ನು ಬಲವಾಗಿ ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ ಇನ್ ವಿವೋ ಕಿಣ್ವಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ. ಈ ಸಂಶೋಧನೆಯ ಪ್ರಸ್ತುತತೆಯನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಲು, ನಾವು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ Mfn2-ಕೊರತೆಯ PN ಗಳಲ್ಲಿ PCx ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ-ನಿಯಂತ್ರಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಈ ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆಯು ಆಕ್ಸಿಡೇಟಿವ್ ಒತ್ತಡವನ್ನು ಉಲ್ಬಣಗೊಳಿಸಿತು ಮತ್ತು ನರಗಳ ಅವನತಿಯನ್ನು ವೇಗಗೊಳಿಸಿತು, ಹೀಗಾಗಿ ಅಜೋಸ್ಪೆರ್ಮಿಯಾ ಜೀವಕೋಶದ ಸಾವನ್ನು ಚಯಾಪಚಯ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯನ್ನು ನೀಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸಾಬೀತುಪಡಿಸಿತು. MFN2 ನ ತೀವ್ರ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ತೀವ್ರವಾದ OXPHOS ಕೊರತೆ, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ DNA ಯ ಬೃಹತ್ ಬಳಕೆ ಮತ್ತು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿ ಮುರಿದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಜಾಲದೊಂದಿಗೆ ಟರ್ಮಿನಲ್ ಡಿಜೆನರೇಶನ್ PN ಅನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ರಕ್ಷಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಜೀವಕೋಶದ ಮರಣದ ಮೊದಲು ರೋಗದ ಮುಂದುವರಿದ ಹಂತದಲ್ಲಿಯೂ ಸಹ ಈ ರೀತಿಯ ನರಗಳ ಅವನತಿ ಚೇತರಿಸಿಕೊಳ್ಳಬಹುದು ಎಂದು ಮತ್ತಷ್ಟು ಒತ್ತಿಹೇಳುತ್ತದೆ.
Mfn2 ನಾಕ್ಔಟ್ PN ಗಳಲ್ಲಿ ಮೈಟೋಕಾಂಡ್ರಿಯಾವನ್ನು ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲು, ನಾವು Cre-ಅವಲಂಬಿತ ಮೈಟೋಕಾಂಡ್ರಿಯಾ ಹಳದಿ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ (YFP) (mtYFP) (20) Cre ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸಲು ಅನುಮತಿಸುವ ಮೌಸ್ ಸ್ಟ್ರೈನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಮೈಟೋಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನವನ್ನು ಇನ್ ವಿವೋದಲ್ಲಿ ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ. PN ಗಳಲ್ಲಿ Mfn2 ಜೀನ್‌ನ ನಾಶವು ಮೈಟೋಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್‌ನ ಕ್ರಮೇಣ ವಿಭಜನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ S1A), ಮತ್ತು ಆರಂಭಿಕ ಬದಲಾವಣೆಯು 3 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬಂದಿದೆ. ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, ಕ್ಯಾಲ್ಬಿಂಡಿನ್ ಇಮ್ಯುನೊಸ್ಟೈನಿಂಗ್ ನಷ್ಟದಿಂದ ಸಾಕ್ಷಿಯಾಗಿರುವಂತೆ PN ಕೋಶ ಪದರದ ಗಣನೀಯ ಅವನತಿಯು 12 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನವರೆಗೆ ಪ್ರಾರಂಭವಾಗಲಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 1, A ಮತ್ತು B). ಮೈಟೋಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನದಲ್ಲಿನ ಆರಂಭಿಕ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಮತ್ತು ನರಕೋಶದ ಸಾವಿನ ಗೋಚರ ಆಕ್ರಮಣದ ನಡುವಿನ ಸಮಯದ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯು ಜೀವಕೋಶದ ಸಾವಿಗೆ ಮೊದಲು ಮೈಟೋಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯಿಂದ ಪ್ರಚೋದಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಚಯಾಪಚಯ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲು ನಮ್ಮನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸಿತು. YFP (YFP+)-ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ PN (ಚಿತ್ರ 1C) ಅನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ಮತ್ತು ನಿಯಂತ್ರಣ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) ಅನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ನಾವು ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್-ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿದ ಕೋಶ ವಿಂಗಡಣೆ (FACS) ಆಧಾರಿತ ತಂತ್ರವನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದನ್ನು ಇನ್ನು ಮುಂದೆ CTRL (ಚಿತ್ರ S1B) ಎಂದು ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. YFP ಸಿಗ್ನಲ್‌ನ ಸಾಪೇಕ್ಷ ತೀವ್ರತೆಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಗೇಟಿಂಗ್ ತಂತ್ರದ ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್ ನಮಗೆ PN ಗಳ YFP+ ದೇಹವನ್ನು (YFPhigh) PN ಅಲ್ಲದ (YFPneg) (ಚಿತ್ರ S1B) ಅಥವಾ ಕಲ್ಪಿತ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಆಕ್ಸಾನ್/ಡೆಂಡ್ರಿಟಿಕ್ ತುಣುಕುಗಳಿಂದ (YFPlow; ಚಿತ್ರ S1D, ಎಡ) ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ, ಇದನ್ನು ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್ (ಚಿತ್ರ S1D, ಬಲ) ದೃಢಪಡಿಸಿದೆ. ವರ್ಗೀಕರಿಸಿದ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯ ಗುರುತನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಲು, ನಾವು LFQ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ಸ್ ಮತ್ತು ನಂತರ ಪ್ರಧಾನ ಘಟಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು YFPhigh ಮತ್ತು YFPneg ಕೋಶಗಳ ನಡುವೆ ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯಿದೆ ಎಂದು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ S1C). YFPhigh ಜೀವಕೋಶಗಳು ತಿಳಿದಿರುವ PNs ಮಾರ್ಕರ್‌ಗಳ (ಅಂದರೆ Calb1, Pcp2, Grid2 ಮತ್ತು Itpr3) ನಿವ್ವಳ ಪುಷ್ಟೀಕರಣವನ್ನು ತೋರಿಸಿದವು (21, 22), ಆದರೆ ನರಕೋಶಗಳು ಅಥವಾ ಇತರ ಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳಲ್ಲಿ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಪುನರುತ್ಪಾದನೆ ಇಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 1D). ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾದ ವರ್ಗೀಕೃತ YFPhigh ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿನ ಮಾದರಿಗಳ ನಡುವಿನ ಹೋಲಿಕೆಯು ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಗುಣಾಂಕ 0.9 ​​ಅನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ, ಇದು ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳ ನಡುವೆ ಉತ್ತಮ ಪುನರುತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ S1E). ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಈ ಡೇಟಾವು ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯವಾದ PN ನ ತೀವ್ರ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಗಾಗಿ ನಮ್ಮ ಯೋಜನೆಯನ್ನು ಮೌಲ್ಯೀಕರಿಸಿತು. ಬಳಸಿದ L7-cre ಚಾಲಕ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯು ವಿತರಣೆಯ ನಂತರದ ಮೊದಲ ವಾರದಲ್ಲಿ ಮೊಸಾಯಿಕ್ ಮರುಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ (23), ನಾವು CTRL ಮತ್ತು ಷರತ್ತುಬದ್ಧ (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) ನಿಂದ ಇಲಿಗಳನ್ನು ಕೊಲ್ಲಲು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿದೆವು ನರಕೋಶಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ. ಮರುಸಂಯೋಜನೆ ಪೂರ್ಣಗೊಂಡ ನಂತರ, ಇದನ್ನು 4 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನಲ್ಲಿ Mfn2cKO ಎಂದು ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ಅಂತಿಮ ಹಂತವಾಗಿ, ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ವಿಘಟನೆಯ ಹೊರತಾಗಿಯೂ PN ಪದರವು ಹಾಗೇ ಇದ್ದಾಗ ನಾವು 8 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸನ್ನು ಆರಿಸಿಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 1B ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ S1A). ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ನಾವು ಒಟ್ಟು 3013 ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಪರಿಮಾಣೀಕರಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಅದರಲ್ಲಿ ಸುಮಾರು 22% ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್ ಅನ್ನು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯವಾಗಿ ಆಧರಿಸಿದ MitoCarta 2.0 ಟಿಪ್ಪಣಿಗಳನ್ನು ಆಧರಿಸಿವೆ (ಚಿತ್ರ 1E) (ಚಿತ್ರ 1E) (24). 8 ನೇ ವಾರದಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾದ ಡಿಫರೆನ್ಷಿಯಲ್ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಕೇವಲ 10.5% ಮಾತ್ರ ಗಮನಾರ್ಹ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 1F ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ S1F), ಇದರಲ್ಲಿ 195 ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಕೆಳಮಟ್ಟಕ್ಕೆ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲ್ಪಟ್ಟವು ಮತ್ತು 120 ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಮೇಲಕ್ಕೆ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲ್ಪಟ್ಟವು (ಚಿತ್ರ 1F). ಈ ಡೇಟಾ ಸೆಟ್‌ನ "ನವೀನ ಮಾರ್ಗ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ" ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಿದ ಜೀನ್‌ಗಳು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಚಯಾಪಚಯ ಮಾರ್ಗಗಳ ನಿರ್ಬಂಧಿತ ಗುಂಪಿಗೆ ಸೇರಿವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 1G). ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, OXPHOS ಮತ್ತು ಕ್ಯಾಲ್ಸಿಯಂ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಮಾರ್ಗಗಳ ಡೌನ್‌ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್ ಸಮ್ಮಿಳನ-ಕೊರತೆಯ PN ಗಳಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಪ್ರಚೋದನೆಯನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸುತ್ತದೆಯಾದರೂ, ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಇತರ ವರ್ಗಗಳು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಅಪ್‌ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್ ಆಗುತ್ತವೆ, ಇದು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ PN ಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಭವಿಸುವ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತದೆ. ರಿವೈರಿಂಗ್ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತದೆ. ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆ.
(ಎ) ಪಿಎನ್‌ಗಳ ಪ್ರಗತಿಶೀಲ ನಷ್ಟವನ್ನು ತೋರಿಸುವ CTRL ಮತ್ತು Mfn2cKO ಇಲಿಗಳ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ವಿಭಾಗಗಳ ಪ್ರತಿನಿಧಿ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಛಾಯಾಚಿತ್ರಗಳು (ಕ್ಯಾಲ್ಬಿಂಡಿನ್, ಬೂದು); ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಳನ್ನು DAPI ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತಿ-ಬಣ್ಣ ಮಾಡಲಾಯಿತು. (ಬಿ) (ಎ) ನ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ (ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಏಕಮುಖ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ, ***P<0.001; n = ಮೂರು ಇಲಿಗಳಿಂದ 4 ರಿಂದ 6 ವಲಯಗಳು). (ಸಿ) ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಕೆಲಸದ ಹರಿವು. (ಡಿ) ಪುರ್ಕಿಂಜೆ (ಮೇಲ್ಭಾಗ) ಮತ್ತು ಇತರ ಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳಿಗೆ (ಮಧ್ಯಮ) ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾದ ಮಾರ್ಕರ್‌ಗಳ ಶಾಖ ನಕ್ಷೆ ವಿತರಣೆ. (ಇ) ವರ್ಗೀಕರಿಸಿದ ಪಿಎನ್‌ನಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ತೋರಿಸುವ ವೆನ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ. (ಎಫ್) 8 ವಾರಗಳಲ್ಲಿ Mfn2cKO ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಜ್ವಾಲಾಮುಖಿ ಕಥಾವಸ್ತು (1.3 ರ ಮಹತ್ವ ಕಟ್-ಆಫ್ ಮೌಲ್ಯ). (ಜಿ) ಸೃಜನಶೀಲತೆಯ ಮಾರ್ಗ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು 8 ವಾರಗಳಾಗಿ ವರ್ಗೀಕರಿಸಲಾದ Mfn2cKO PN ನಲ್ಲಿ ಐದು ಪ್ರಮುಖ ಅಪ್-ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್ (ಕೆಂಪು) ಮತ್ತು ಡೌನ್-ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್ (ನೀಲಿ) ಮಾರ್ಗಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಪತ್ತೆಯಾದ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಸರಾಸರಿ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಟ್ಟವನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಗ್ರೇಸ್ಕೇಲ್ ಹೀಟ್ ಮ್ಯಾಪ್: ಹೊಂದಿಸಲಾದ P ಮೌಲ್ಯ. ns, ಮುಖ್ಯವಲ್ಲ.
ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ಸ್ ದತ್ತಾಂಶವು I, III ಮತ್ತು IV ಸಂಕೀರ್ಣಗಳ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಕ್ರಮೇಣ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ. I, III ಮತ್ತು IV ಸಂಕೀರ್ಣಗಳು ಎಲ್ಲಾ ಅಗತ್ಯ mtDNA-ಎನ್‌ಕೋಡ್ ಮಾಡಿದ ಉಪಘಟಕಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿವೆ, ಆದರೆ ಪರಮಾಣು-ಕೋಡ್ ಮಾಡಿದ ಸಂಕೀರ್ಣ II ಮೂಲತಃ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಲಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 2A ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ S2A). . ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ಸ್ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಅಂಗಾಂಶ ವಿಭಾಗಗಳ ಇಮ್ಯುನೊಹಿಸ್ಟೋಕೆಮಿಸ್ಟ್ರಿ PN ನಲ್ಲಿ ಸಂಕೀರ್ಣ IV ನ MTCO1 (ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಸೈಟೋಕ್ರೋಮ್ C ಆಕ್ಸಿಡೇಸ್ ಉಪಘಟಕ 1) ಉಪಘಟಕದ ಮಟ್ಟವು ಕ್ರಮೇಣ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 2B). mtDNA-ಎನ್‌ಕೋಡ್ ಮಾಡಿದ ಉಪಘಟಕ Mtatp8 ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಯಿತು (ಚಿತ್ರ S2A), ಆದರೆ ಪರಮಾಣು-ಎನ್‌ಕೋಡ್ ಮಾಡಿದ ATP ಸಿಂಥೇಸ್ ಉಪಘಟಕದ ಸ್ಥಿರ-ಸ್ಥಿತಿಯ ಮಟ್ಟವು ಬದಲಾಗದೆ ಉಳಿಯಿತು, ಇದು mtDNA ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದ್ದಾಗ ತಿಳಿದಿರುವ ಸ್ಥಿರ ATP ಸಿಂಥೇಸ್ ಉಪಘಟಕ F1 ಸಂಕೀರ್ಣಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತದೆ. ರಚನೆಯು ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತದೆ. ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸಿ (7). ವಿಂಗಡಿಸಲಾದ Mfn2cKO PN ಗಳಲ್ಲಿ mtDNA ಮಟ್ಟವನ್ನು ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಸರಪಳಿ ಕ್ರಿಯೆ (qPCR) ಮೂಲಕ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡುವುದರಿಂದ mtDNA ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿ ಕ್ರಮೇಣ ಇಳಿಕೆ ಕಂಡುಬಂದಿದೆ ಎಂದು ದೃಢಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ನಿಯಂತ್ರಣ ಗುಂಪಿನೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, 8 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನಲ್ಲಿ, mtDNA ಮಟ್ಟದ ಸುಮಾರು 20% ಮಾತ್ರ ಉಳಿಸಿಕೊಳ್ಳಲಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 2C). ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, Mfn2cKO PN ಗಳ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ ಸ್ಟೇನಿಂಗ್ ಅನ್ನು DNA ಯನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಬಳಸಲಾಯಿತು, ಇದು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳ ಸಮಯ-ಅವಲಂಬಿತ ಬಳಕೆಯನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 2D). ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅವನತಿ ಮತ್ತು ಒತ್ತಡದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿರುವ ಕೆಲವು ಅಭ್ಯರ್ಥಿಗಳು ಮಾತ್ರ ಅಪ್-ನಿಯಂತ್ರಿತರಾಗಿದ್ದಾರೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ, ಇದರಲ್ಲಿ Lonp1, Afg3l2 ಮತ್ತು Clpx, ಮತ್ತು OXPHOS ಸಂಕೀರ್ಣ ಜೋಡಣೆ ಅಂಶಗಳು ಸೇರಿವೆ. ಅಪೊಪ್ಟೋಸಿಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಗಮನಾರ್ಹ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಪತ್ತೆಯಾಗಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ S2B). ಅದೇ ರೀತಿ, ಕ್ಯಾಲ್ಸಿಯಂ ಸಾಗಣೆಯಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾ ಮತ್ತು ಎಂಡೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ರೆಟಿಕ್ಯುಲಮ್ ಚಾನಲ್‌ಗಳು ಕೇವಲ ಸಣ್ಣ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ S2C). ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಆಟೋಫ್ಯಾಜಿ-ಸಂಬಂಧಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನವು ಯಾವುದೇ ಗಮನಾರ್ಹ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಕಂಡುಕೊಂಡಿಲ್ಲ, ಇದು ಇಮ್ಯುನೊಹಿಸ್ಟೋಕೆಮಿಸ್ಟ್ರಿ ಮತ್ತು ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿಯಿಂದ ವಿವೋದಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಿದ ಆಟೋಫ್ಯಾಗೋಸೋಮ್‌ಗಳ ಗೋಚರ ಪ್ರಚೋದನೆಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ S3). ಆದಾಗ್ಯೂ, PN ಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರಗತಿಶೀಲ OXPHOS ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯು ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ಅಲ್ಟ್ರಾಸ್ಟ್ರಕ್ಚರಲ್ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಬದಲಾವಣೆಗಳೊಂದಿಗೆ ಇರುತ್ತದೆ. 5 ಮತ್ತು 8 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನ Mfn2cKO PN ಗಳ ಜೀವಕೋಶ ದೇಹಗಳು ಮತ್ತು ಡೆಂಡ್ರಿಟಿಕ್ ಮರಗಳಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗಳನ್ನು ಕಾಣಬಹುದು ಮತ್ತು ಒಳಗಿನ ಪೊರೆಯ ರಚನೆಯು ಆಳವಾದ ಬದಲಾವಣೆಗಳಿಗೆ ಒಳಗಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ S4, A ಮತ್ತು B). ಈ ಅಲ್ಟ್ರಾಸ್ಟ್ರಕ್ಚರಲ್ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಮತ್ತು mtDNA ಯಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಇಳಿಕೆಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, ಟೆಟ್ರಾಮೀಥೈಲ್ರೋಡಮೈನ್ ಮೀಥೈಲ್ ಎಸ್ಟರ್ (TMRM) ನೊಂದಿಗೆ ತೀವ್ರವಾದ ಸೆರೆಬ್ರಲ್ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಸ್ಲೈಸ್‌ಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು Mfn2cKO PN ಗಳಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಮೆಂಬರೇನ್ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ S4C).
(ಎ) OXPHOS ಸಂಕೀರ್ಣದ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಟ್ಟದ ಸಮಯ ಕೋರ್ಸ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. 8 ವಾರಗಳಲ್ಲಿ P<0.05 ಇರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಪರಿಗಣಿಸಿ (ಎರಡು-ಮಾರ್ಗ ANOVA). ಚುಕ್ಕೆಗಳ ಸಾಲು: CTRL ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಹೊಂದಾಣಿಕೆ ಇಲ್ಲ. (ಬಿ) ಎಡ: MTCO1 ವಿರೋಧಿ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ವಿಭಾಗದ ಉದಾಹರಣೆ (ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 20 μm). ಪುರ್ಕಿಂಜೆ ಜೀವಕೋಶ ದೇಹಗಳಿಂದ ಆಕ್ರಮಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಹಳದಿ ಬಣ್ಣದಿಂದ ಮುಚ್ಚಲಾಗಿದೆ. ಬಲ: MTCO1 ಮಟ್ಟಗಳ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ (ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಏಕ-ಮಾರ್ಗ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ; n = ಮೂರು ಇಲಿಗಳಿಂದ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾದ 7 ರಿಂದ 20 ಕೋಶಗಳು). (ಸಿ) ವಿಂಗಡಿಸಲಾದ PN ನಲ್ಲಿ mtDNA ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆಯ qPCR ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಏಕ-ಮಾರ್ಗ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ; n = 3 ರಿಂದ 7 ಇಲಿಗಳು). (ಡಿ) ಎಡ: DNA ವಿರೋಧಿ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಸ್ಲೈಸ್‌ನ ಉದಾಹರಣೆ (ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 20 μm). ಪರ್ಕಿಂಜೆ ಜೀವಕೋಶ ದೇಹಗಳಿಂದ ಆಕ್ರಮಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಹಳದಿ ಬಣ್ಣದಿಂದ ಮುಚ್ಚಲಾಗಿದೆ. ಬಲ: mtDNA ಗಾಯಗಳ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ (ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಏಕಮುಖ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ; ಮೂರು ಇಲಿಗಳಿಂದ n = 5 ರಿಂದ 9 ಕೋಶಗಳು). (E) ಸಂಪೂರ್ಣ-ಕೋಶ ಪ್ಯಾಚ್ ಕ್ಲಾಂಪ್ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಮೈಟೊವೈಎಫ್‌ಪಿ + ಪುರ್ಕಿಂಜೆ ಕೋಶಗಳನ್ನು (ಬಾಣ) ತೋರಿಸುವ ತೀವ್ರ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ವಿಭಾಗದ ಉದಾಹರಣೆ. (F) IV ಕರ್ವ್‌ನ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ. (G) CTRL ಮತ್ತು Mfn2cKO ಪುರ್ಕಿಂಜೆ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಡಿಪೋಲರೈಸಿಂಗ್ ಕರೆಂಟ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್‌ನ ಪ್ರತಿನಿಧಿ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್‌ಗಳು. ಮೇಲಿನ ಟ್ರೇಸ್: AP ಅನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸಿದ ಮೊದಲ ಪಲ್ಸ್. ಕೆಳಗಿನ ಟ್ರೇಸ್: ಗರಿಷ್ಠ AP ಆವರ್ತನ. (H) ಪೋಸ್ಟ್‌ನ್ಯಾಪ್ಟಿಕ್ ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ ಇನ್‌ಪುಟ್‌ಗಳ (sPSPs) ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ. ಪ್ರತಿನಿಧಿ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ಟ್ರೇಸ್ ಮತ್ತು ಅದರ ಜೂಮ್ ಅನುಪಾತವನ್ನು (I) ನಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಏಕಮುಖ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಮೂರು ಇಲಿಗಳಿಂದ n = 5 ರಿಂದ 20 ಕೋಶಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಡೇಟಾವನ್ನು ಸರಾಸರಿ ± SEM ಎಂದು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) ರಂದ್ರ ಪ್ಯಾಚ್ ಕ್ಲಾಂಪ್ ಮೋಡ್ ಬಳಸಿ ದಾಖಲಿಸಲಾದ ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ AP ಯ ಪ್ರತಿನಿಧಿ ಕುರುಹುಗಳು. ಮೇಲಿನ ಟ್ರೇಸ್: ಗರಿಷ್ಠ AP ಆವರ್ತನ. ಕೆಳಗಿನ ಟ್ರೇಸ್: ಒಂದೇ AP ಯ ಜೂಮ್. (K) (J) ಪ್ರಕಾರ ಸರಾಸರಿ ಮತ್ತು ಗರಿಷ್ಠ AP ಆವರ್ತನವನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಿ. ಮನ್-ವಿಟ್ನಿ ಪರೀಕ್ಷೆ; n = 5 ಕೋಶಗಳನ್ನು ನಾಲ್ಕು ಇಲಿಗಳಿಂದ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಡೇಟಾವನ್ನು ಸರಾಸರಿ ± SEM ಎಂದು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ; ಮುಖ್ಯವಲ್ಲ.
8 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನ Mfn2cKO PN ನಲ್ಲಿ ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ OXPHOS ಹಾನಿ ಪತ್ತೆಯಾಗಿದೆ, ಇದು ನರಕೋಶಗಳ ಶಾರೀರಿಕ ಕಾರ್ಯವು ತೀವ್ರವಾಗಿ ಅಸಹಜವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ನಾವು 4 ರಿಂದ 5 ವಾರಗಳು ಮತ್ತು 7 ರಿಂದ 8 ವಾರಗಳಲ್ಲಿ ತೀವ್ರವಾದ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಸ್ಲೈಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಪೂರ್ಣ-ಕೋಶ ಪ್ಯಾಚ್ ಕ್ಲಾಂಪ್ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುವ ಮೂಲಕ OXPHOS-ಕೊರತೆಯ ನರಕೋಶಗಳ ನಿಷ್ಕ್ರಿಯ ವಿದ್ಯುತ್ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 2E). ಅನಿರೀಕ್ಷಿತವಾಗಿ, Mfn2cKO ನರಕೋಶಗಳ ಸರಾಸರಿ ವಿಶ್ರಾಂತಿ ಪೊರೆಯ ಸಾಮರ್ಥ್ಯ ಮತ್ತು ಇನ್‌ಪುಟ್ ಪ್ರತಿರೋಧವು ನಿಯಂತ್ರಣಕ್ಕೆ ಹೋಲುತ್ತದೆ, ಆದಾಗ್ಯೂ ಜೀವಕೋಶಗಳ ನಡುವೆ ಸೂಕ್ಷ್ಮ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳಿವೆ (ಕೋಷ್ಟಕ 1). ಅದೇ ರೀತಿ, 4 ರಿಂದ 5 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನಲ್ಲಿ, ಪ್ರಸ್ತುತ-ವೋಲ್ಟೇಜ್ ಸಂಬಂಧದಲ್ಲಿ (IV ಕರ್ವ್) ಯಾವುದೇ ಗಮನಾರ್ಹ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಕಂಡುಬಂದಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 2F). ಆದಾಗ್ಯೂ, 7 ರಿಂದ 8 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನ ಯಾವುದೇ Mfn2cKO ನರಕೋಶಗಳು IV ಕಟ್ಟುಪಾಡು (ಹೈಪರ್‌ಪೋಲರೈಸೇಶನ್ ಹಂತ) ದಿಂದ ಬದುಕುಳಿದವು, ಇದು ಈ ಕೊನೆಯ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಹೈಪರ್‌ಪೋಲರೈಸೇಶನ್ ಸಾಮರ್ಥ್ಯಕ್ಕೆ ಸ್ಪಷ್ಟ ಸಂವೇದನೆ ಇದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, Mfn2cKO ನರಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ, ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಕ್ರಿಯಾಶೀಲ ವಿಭವ (AP) ವಿಸರ್ಜನಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುವ ವಿಧ್ರುವೀಕರಣ ಪ್ರವಾಹಗಳನ್ನು ಚೆನ್ನಾಗಿ ಸಹಿಸಿಕೊಳ್ಳಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಅವುಗಳ ಒಟ್ಟಾರೆ ವಿಸರ್ಜನಾ ಮಾದರಿಗಳು 8 ವಾರಗಳ ಹಳೆಯ ನಿಯಂತ್ರಣ ನರಕೋಶಗಳಿಗಿಂತ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಭಿನ್ನವಾಗಿಲ್ಲ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಕೋಷ್ಟಕ 1 ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ 2G). ಅದೇ ರೀತಿ, ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ ಪೋಸ್ಟ್‌ನ್ಯಾಪ್ಟಿಕ್ ಪ್ರವಾಹಗಳ (sPSCs) ಆವರ್ತನ ಮತ್ತು ವೈಶಾಲ್ಯವು ನಿಯಂತ್ರಣ ಗುಂಪಿನ ಆವರ್ತನಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಬಹುದು, ಮತ್ತು ಘಟನೆಗಳ ಆವರ್ತನವು 4 ವಾರಗಳಿಂದ 5 ವಾರಗಳಿಂದ 7 ವಾರಗಳಿಂದ 8 ವಾರಗಳವರೆಗೆ ಇದೇ ರೀತಿಯ ಹೆಚ್ಚಳದೊಂದಿಗೆ ಹೆಚ್ಚಾಯಿತು (ಚಿತ್ರ 2, H ಮತ್ತು I). PN ಗಳಲ್ಲಿ ಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ಪಕ್ವತೆಯ ಅವಧಿ (25). ರಂದ್ರ PN ಗಳ ಪ್ಯಾಚ್‌ಗಳ ನಂತರ ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ. ಈ ಸಂರಚನೆಯು ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ATP ದೋಷಗಳ ಸಂಭವನೀಯ ಪರಿಹಾರವನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ, ಇದು ಸಂಪೂರ್ಣ ಕೋಶ ಪ್ಯಾಚ್ ಕ್ಲ್ಯಾಂಪ್ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಂಭವಿಸಬಹುದು. ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, Mfn2cKO ನರಕೋಶಗಳ ವಿಶ್ರಾಂತಿ ಪೊರೆಯ ವಿಭವ ಮತ್ತು ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ ಗುಂಡಿನ ಆವರ್ತನವು ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಲಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 2, J ಮತ್ತು K). ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ OXPHOS ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ PN ಗಳು ಹೆಚ್ಚಿನ ಆವರ್ತನ ಡಿಸ್ಚಾರ್ಜ್ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಚೆನ್ನಾಗಿ ನಿಭಾಯಿಸಬಲ್ಲವು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ, ಇದು ಸಾಮಾನ್ಯ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫಿಸಿಯೋಲಾಜಿಕಲ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುವ ಪರಿಹಾರ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಡೇಟಾವನ್ನು ಸರಾಸರಿ ± SEM (ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಏಕಮುಖ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ, ಹೋಲ್ಮ್-ಸಿಡಾಕ್‌ನ ಬಹು ಹೋಲಿಕೆ ಪರೀಕ್ಷೆ; *P<0.05) ಎಂದು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಘಟಕ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಆವರಣಗಳಿಂದ ಸೂಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ಸ್ ಡೇಟಾಸೆಟ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಯಾವುದೇ ವರ್ಗವು (ಚಿತ್ರ 1G) ತೀವ್ರವಾದ OXPHOS ಕೊರತೆಯನ್ನು ಎದುರಿಸುವ ಮಾರ್ಗಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆಯೇ ಎಂದು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲು ನಾವು ಹೊರಟಿದ್ದೇವೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಪೀಡಿತ PN ಸಾಮಾನ್ಯ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫಿಸಿಯಾಲಜಿಯನ್ನು ಏಕೆ ನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು ಎಂಬುದನ್ನು ವಿವರಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 2, E ನಿಂದ K). . ಶಾಖೆಯ ಸರಪಳಿ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳ (BCAA) ಕ್ಯಾಟಬಾಲಿಸಂನಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಕಿಣ್ವಗಳು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಅಪ್-ನಿಯಂತ್ರಿತವಾಗಿವೆ ಎಂದು ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ಸ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3A ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ S5A), ಮತ್ತು ಅಂತಿಮ ಉತ್ಪನ್ನವಾದ ಅಸಿಟೈಲ್-CoA (CoA) ಅಥವಾ ಸಕ್ಸಿನೈಲ್ CoA ಅಪಧಮನಿಕಾಠಿಣ್ಯದ ಆಮ್ಲ (TCA) ಚಕ್ರದಲ್ಲಿ ಟ್ರೈಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಪೂರೈಸಬಹುದು. BCAA ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮಮಿನೇಸ್ 1 (BCAT1) ಮತ್ತು BCAT2 ಎರಡರ ಅಂಶವು ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ. ಅವು α-ಕೀಟೋಗ್ಲುಟರೇಟ್‌ನಿಂದ ಗ್ಲುಟಮೇಟ್ ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುವ ಮೂಲಕ BCAA ಕ್ಯಾಟಬಾಲಿಸಂನ ಮೊದಲ ಹಂತವನ್ನು ವೇಗವರ್ಧಿಸುತ್ತವೆ (26). ಶಾಖೆಯ ಸರಪಳಿ ಕೀಟೋ ಆಮ್ಲ ಡಿಹೈಡ್ರೋಜಿನೇಸ್ (BCKD) ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ರೂಪಿಸುವ ಎಲ್ಲಾ ಉಪಘಟಕಗಳು ಅಪ್-ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್ ಆಗುತ್ತವೆ (ಸಂಕೀರ್ಣವು ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಬರುವ BCAA ಇಂಗಾಲದ ಅಸ್ಥಿಪಂಜರದ ನಂತರದ ಮತ್ತು ಬದಲಾಯಿಸಲಾಗದ ಡಿಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ವೇಗವರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ) (ಚಿತ್ರ 3A ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ S5A). ಆದಾಗ್ಯೂ, ವಿಂಗಡಿಸಲಾದ PN ನಲ್ಲಿ BCAA ನಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಸ್ಪಷ್ಟ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಕಂಡುಬಂದಿಲ್ಲ, ಇದು ಈ ಅಗತ್ಯ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳ ಹೆಚ್ಚಿದ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆ ಅಥವಾ TCA ಚಕ್ರವನ್ನು ಪೂರೈಸಲು ಇತರ ಮೂಲಗಳ (ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಅಥವಾ ಲ್ಯಾಕ್ಟಿಕ್ ಆಮ್ಲ) ಬಳಕೆಯಿಂದಾಗಿರಬಹುದು (ಚಿತ್ರ S5B). OXPHOS ಕೊರತೆಯಿರುವ PN ಗಳು 8 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿದ ಗ್ಲುಟಾಮಿನ್ ವಿಭಜನೆ ಮತ್ತು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮಿನೇಷನ್ ಚಟುವಟಿಕೆಗಳನ್ನು ಸಹ ತೋರಿಸಿದವು, ಇದು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಕಿಣ್ವಗಳಾದ ಗ್ಲುಟಾಮಿನೇಸ್ (GLS) ಮತ್ತು ಗ್ಲುಟಾಮಿನ್ ಪೈರುವೇಟ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮಿನೇಸ್ 2 (GPT2) ನ ಅಪ್-ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್ ಮೂಲಕ ಪ್ರತಿಫಲಿಸಬಹುದು (ಚಿತ್ರ 3, A ಮತ್ತು C). GLS ನ ಅಪ್-ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್ ಸ್ಪ್ಲೈಸ್ಡ್ ಐಸೊಫಾರ್ಮ್ ಗ್ಲುಟಮಿನೇಸ್ C (GLS-GAC) ಗೆ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ (Mfn2cKO/CTRL ನ ಬದಲಾವಣೆಯು ಸರಿಸುಮಾರು 4.5 ಪಟ್ಟು, P = 0.05), ಮತ್ತು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿ ಅದರ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಅಪ್-ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಜೈವಿಕ ಶಕ್ತಿಯನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಗಮನಿಸಬೇಕಾದ ಸಂಗತಿ. (27).
(A) 8 ವಾರಗಳಲ್ಲಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟಪಡಿಸಿದ ಮಾರ್ಗದಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿನ ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆಯನ್ನು ಶಾಖ ನಕ್ಷೆಯು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. (B) ಆಂಟಿ-ಪಿಸಿಎಕ್ಸ್ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಸ್ಲೈಸ್‌ನ ಉದಾಹರಣೆ (ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 20 μm). ಹಳದಿ ಬಾಣವು ಪುರ್ಕಿಂಜೆ ಜೀವಕೋಶದ ದೇಹವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. (C) ಅಪಧಮನಿಕಾಠಿಣ್ಯಕ್ಕೆ ಪ್ರಮುಖ ಅಭ್ಯರ್ಥಿಯಾಗಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಸಮಯ ಕೋರ್ಸ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (ಬಹು ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆ, *FDR <5%; n = 3-5 ಇಲಿಗಳು). (D) ಮೇಲೆ: [1-13C]ಪೈರುವೇಟ್ ಟ್ರೇಸರ್‌ನಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಇಂಗಾಲವನ್ನು ಪ್ರವೇಶಿಸುವ ವಿಭಿನ್ನ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುವ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ (ಅಂದರೆ, PDH ಅಥವಾ ಟ್ರಾನ್ಸ್-ಅಪಧಮನಿಯ ಮಾರ್ಗದ ಮೂಲಕ). ಕೆಳಗೆ: [1-13C]ಪೈರುವೇಟ್ (ಜೋಡಿಸಿದ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆ; ** P <0.01) ನೊಂದಿಗೆ ತೀವ್ರವಾದ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಸ್ಲೈಸ್‌ಗಳನ್ನು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ ನಂತರ ಆಸ್ಪರ್ಟಿಕ್ ಆಮ್ಲ, ಸಿಟ್ರಿಕ್ ಆಮ್ಲ ಮತ್ತು ಮಾಲಿಕ್ ಆಮ್ಲವಾಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾದ ಏಕ-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಇಂಗಾಲದ (M1) ಶೇಕಡಾವಾರು ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಪಿಟೀಲು ಚಾರ್ಟ್ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. (E) ಸೂಚಿಸಲಾದ ಮಾರ್ಗದ ಸಮಗ್ರ ಸಮಯ ಇತಿಹಾಸ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. 8 ವಾರಗಳಲ್ಲಿ P<0.05 ಇರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಪರಿಗಣಿಸಿ​. ಡ್ಯಾಶ್ ಮಾಡಿದ ಗೆರೆ: ಹೊಂದಾಣಿಕೆ ಮೌಲ್ಯವಿಲ್ಲ (ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ದ್ವಿಮುಖ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ; * P <0.05; *** P <0.001). ಡೇಟಾವನ್ನು ಸರಾಸರಿ ± SEM ಎಂದು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ನಮ್ಮ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ, BCAA ಕ್ಯಾಟಬಾಲಿಸಮ್ ಪ್ರಮುಖ ಅಪ್-ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್ ಮಾರ್ಗಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದಾಗಿದೆ. ಈ ಅಂಶವು TCA ಚಕ್ರಕ್ಕೆ ಪ್ರವೇಶಿಸುವ ವಾತಾಯನ ಪರಿಮಾಣವು OXPHOS ಕೊರತೆಯಿರುವ PN ನಲ್ಲಿ ಬದಲಾಗಬಹುದು ಎಂದು ಬಲವಾಗಿ ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಇದು ನರಕೋಶದ ಚಯಾಪಚಯ ರಿವೈರಿಂಗ್‌ನ ಪ್ರಮುಖ ರೂಪವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸಬಹುದು, ಇದು ತೀವ್ರವಾದ OXPHOS ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ನಿರ್ವಹಣೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ನರಕೋಶದ ಶರೀರಶಾಸ್ತ್ರ ಮತ್ತು ಬದುಕುಳಿಯುವಿಕೆಯ ಮೇಲೆ ನೇರ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಬಹುದು. ಈ ಊಹೆಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, ಮುಖ್ಯ ವಿರೋಧಿ ಅಪಧಮನಿಕಾಠಿಣ್ಯದ ಕಿಣ್ವ PCx ಅಪ್-ರೆಗ್ಯುಲೇಟ್ ಆಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (Mfn2cKO/CTRL ಸರಿಸುಮಾರು 1.5 ಬಾರಿ ಬದಲಾಗುತ್ತದೆ; ಚಿತ್ರ 3A), ಇದು ಪೈರುವೇಟ್ ಅನ್ನು ಆಕ್ಸಲೋಅಸೆಟೇಟ್ ಆಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸುವುದನ್ನು ವೇಗವರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ (28), ಇದು ಮೆದುಳಿನ ಅಂಗಾಂಶದಲ್ಲಿದೆ ಎಂದು ನಂಬಲಾಗಿದೆ. in ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಆಸ್ಟ್ರೋಸೈಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ (29, 30). ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ಸ್ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿಯು OXPHOS-ಕೊರತೆಯ PN ಗಳಲ್ಲಿ PCx ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಮತ್ತು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ, ಆದರೆ PCx ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕತೆಯು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ನಿಯಂತ್ರಣದ ಪಕ್ಕದ ಬರ್ಗ್‌ಮನ್ ಗ್ಲಿಯಲ್ ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3B). PCx ನ ಗಮನಿಸಿದ ಅಪ್‌ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, ನಾವು ತೀವ್ರವಾದ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಚೂರುಗಳನ್ನು [1-13C] ಪೈರುವೇಟ್ ಟ್ರೇಸರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಿದ್ದೇವೆ. ಪೈರುವೇಟ್ ಅನ್ನು ಪೈರುವೇಟ್ ಡಿಹೈಡ್ರೋಜಿನೇಸ್ (PDH) ನಿಂದ ಆಕ್ಸಿಡೀಕರಿಸಿದಾಗ, ಅದರ ಐಸೊಟೋಪ್ ಲೇಬಲ್ ಕಣ್ಮರೆಯಾಯಿತು, ಆದರೆ ನಾಳೀಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಿಂದ ಪೈರುವೇಟ್ ಚಯಾಪಚಯಗೊಂಡಾಗ TCA ಚಕ್ರ ಮಧ್ಯಂತರಗಳಲ್ಲಿ ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 3D). ನಮ್ಮ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ಸ್ ಡೇಟಾವನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸಲು, Mfn2cKO ಚೂರುಗಳ ಆಸ್ಪರ್ಟಿಕ್ ಆಮ್ಲದಲ್ಲಿ ಈ ಟ್ರೇಸರ್‌ನಿಂದ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಮಾರ್ಕರ್‌ಗಳನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಆದರೆ ಸಿಟ್ರಿಕ್ ಆಮ್ಲ ಮತ್ತು ಮಾಲಿಕ್ ಆಮ್ಲವು ಸಹ ಮಧ್ಯಮ ಪ್ರವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿತ್ತು, ಆದರೂ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 3D).
ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಫ್ಯಾಕ್ಟರ್ ಎ ಜೀನ್ (Tfam) ಅನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ನಾಶಪಡಿಸುವ ಡೋಪಮೈನ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯೊಂದಿಗೆ ಮಿಟೊಪಾರ್ಕ್ ಇಲಿಗಳ ಡೋಪಮೈನ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ (ಚಿತ್ರ S6B), PCx ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಸಹ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಯಿತು (31), ಇದು ಅಸಿಟೋನ್ ಆಮ್ಲ ಅಪಧಮನಿಕಾಠಿಣ್ಯವು ದೇಹದಲ್ಲಿನ ನರಕೋಶದ OXPHOS ನ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ರೋಗದ ಸಂಭವವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಅಪಧಮನಿಕಾಠಿಣ್ಯದೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿರಬಹುದಾದ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಬಹುದಾದ ವಿಶಿಷ್ಟ ಕಿಣ್ವಗಳು (32-34) OXPHOS ಕೊರತೆಯಿರುವ PN ಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲ್ಪಡುತ್ತವೆ ಎಂದು ಕಂಡುಬಂದಿದೆ ಎಂಬುದು ಗಮನಿಸಬೇಕಾದ ಸಂಗತಿ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ ಪ್ರೊಪಿಯೊನೈಲ್-CoA ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿಲೇಸ್ (PCC-A), ಮ್ಯಾಲೋನಿಲ್-CoA ಪ್ರೊಪಿಯೊನೈಲ್-CoA ಅನ್ನು ಸಕ್ಸಿನೈಲ್-CoA ಆಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಮಾಲಿಕ್ ಕಿಣ್ವ 3 (ME3), ಇದರ ಮುಖ್ಯ ಪಾತ್ರವೆಂದರೆ ಮಾಲೇಟ್‌ನಿಂದ ಪೈರುವೇಟ್ ಅನ್ನು ಚೇತರಿಸಿಕೊಳ್ಳುವುದು (ಚಿತ್ರ 3, A ಮತ್ತು C) (33, 35). ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, Pdk3 ಕಿಣ್ವದಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಹೆಚ್ಚಳ ಕಂಡುಬಂದಿದೆ, ಇದು ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಟ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು PDH ಅನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ (36), ಆದರೆ PDH ಅಥವಾ PDH ಕಿಣ್ವ ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವ Pdp1 ಕಿಣ್ವದಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಪತ್ತೆಯಾಗಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 3A). ಸ್ಥಿರವಾಗಿ, Mern2cKO PN ಗಳಲ್ಲಿ, Ser293 ರಲ್ಲಿ PDH ಸಂಕೀರ್ಣದ ಪೈರುವೇಟ್ ಡಿಹೈಡ್ರೋಜಿನೇಸ್ E1 ಘಟಕದ α1 ಉಪಘಟಕ α (PDHE1α) ಉಪಘಟಕದ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ S6C) (ಚಿತ್ರ S6C). ಪೈರುವೇಟ್‌ಗೆ ನಾಳೀಯ ಪ್ರವೇಶವಿಲ್ಲ.
ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಸೆರಿನ್ ಮತ್ತು ಗ್ಲೈಸಿನ್ ಜೈವಿಕ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಸೂಪರ್ ಮಾರ್ಗ, ಸಂಬಂಧಿತ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಫೋಲೇಟ್ (1C) ಚಕ್ರ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಲಿನ್ ಜೈವಿಕ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ (ಚಿತ್ರ 1G ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ S5C) ಇವೆಲ್ಲವೂ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಮೇಲಕ್ಕೆ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲ್ಪಡುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ. ಸುತ್ತಮುತ್ತಲಿನ ಅಂಗಾಂಶಗಳು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯೊಂದಿಗೆ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳ್ಳುತ್ತವೆ (5-7). ಈ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ಸ್ ಡೇಟಾವನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸುವ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು OXPHOS ಕಾಣೆಯಾದ PN ನಲ್ಲಿ, 8 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನ ಇಲಿಗಳ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಚೂರುಗಳನ್ನು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಫೋಲೇಟ್ ಚಕ್ರದ ಪ್ರಮುಖ ಕಿಣ್ವವಾದ ಸೆರಿನ್ ಹೈಡ್ರಾಕ್ಸಿಮೀಥೈಲ್‌ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫರೇಸ್ 2 (SHMT2) ಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ. ಗಮನಾರ್ಹ ರೋಗನಿರೋಧಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ (ಚಿತ್ರ S5D). 13 CU-ಗ್ಲೂಕೋಸ್-ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟೆಡ್ ಅಕ್ಯೂಟ್ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಚೂರುಗಳಲ್ಲಿ, ಮೆಟಾಬಾಲಿಕ್ ಟ್ರೇಸಿಂಗ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳು ಸೆರಿನ್ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಲಿನ್ ಜೈವಿಕ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಮೇಲಕ್ಕೆ-ನಿಯಂತ್ರಣವನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ದೃಢಪಡಿಸಿದವು, ಇದು ಸೆರಿನ್ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಲಿನ್ ಆಗಿ ಕಾರ್ಬನ್ ಐಸೋಫಾರ್ಮ್‌ಗಳ ಹರಿವು ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ S5E). GLS ಮತ್ತು GPT2 ನಿಂದ ಉತ್ತೇಜಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳು ಗ್ಲುಟಾಮೈನ್‌ನಿಂದ ಗ್ಲುಟಮೇಟ್‌ನ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು ಗ್ಲುಟಮೇಟ್ ಮತ್ತು α-ಕೀಟೋಗ್ಲುಟರೇಟ್ ನಡುವಿನ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮಿನೇಷನ್‌ಗೆ ಕಾರಣವಾಗಿರುವುದರಿಂದ, ಅವುಗಳ ಅಪ್‌ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್ OXPHOS-ಕೊರತೆಯ ನರಕೋಶಗಳು ಗ್ಲುಟಮೇಟ್‌ಗೆ ಹೆಚ್ಚಿದ ಬೇಡಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಪ್ರೋಲಿನ್‌ನ ಹೆಚ್ಚಿದ ಜೈವಿಕ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಕಾಪಾಡಿಕೊಳ್ಳುವ ಗುರಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿರಬಹುದು (ಚಿತ್ರ S5C). ಈ ಬದಲಾವಣೆಗಳಿಗೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, PN-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ Mfn2cKO ಇಲಿಗಳಿಂದ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಆಸ್ಟ್ರೋಸೈಟ್‌ಗಳ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಈ ಮಾರ್ಗಗಳು (ಎಲ್ಲಾ ಆಂಟಿಪೆರಾಕ್ಸಿಡೇಸ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಂತೆ) ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಬದಲಾಗಲಿಲ್ಲ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ, ಹೀಗಾಗಿ ಈ ಚಯಾಪಚಯ ಪುನರ್ನಿರ್ದೇಶನವು ಕ್ಷೀಣಿಸಿದ PN ಗೆ ಆಯ್ದವಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ S6, D ನಿಂದ G).
ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಈ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳು PN ಗಳಲ್ಲಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಚಯಾಪಚಯ ಮಾರ್ಗಗಳ ತಾತ್ಕಾಲಿಕ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ವಿಭಿನ್ನ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿದವು. ಅಸಹಜ ನರಕೋಶದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಕಾರ್ಯವು ಆರಂಭಿಕ ಅಪಧಮನಿಕಾಠಿಣ್ಯ ಮತ್ತು 1C ಮರುರೂಪಿಸುವಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು (ಚಿತ್ರ 3E ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ S5C), ಮತ್ತು I ಮತ್ತು IV ಸಂಕೀರ್ಣಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಲ್ಲಿ ಊಹಿಸಬಹುದಾದ ಬದಲಾವಣೆಗಳಿಗೂ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು, ಸೆರಿನ್ ಡಿ ನೊವೊ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಮಾತ್ರ ಇದು ನಂತರದ ಹಂತಗಳಲ್ಲಿ ಮಾತ್ರ ಸ್ಪಷ್ಟವಾಯಿತು. OXPHOS ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆ (ಚಿತ್ರ 3E ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ S5C). ಈ ಸಂಶೋಧನೆಗಳು TCA ಚಕ್ರದಲ್ಲಿ ಅಪಧಮನಿಕಾಠಿಣ್ಯದ ಹೆಚ್ಚಳದೊಂದಿಗೆ ಒತ್ತಡ-ಪ್ರೇರಿತ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ (1C ಚಕ್ರ) ಮತ್ತು ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ (ಸೆರಿನ್ ಜೈವಿಕ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ) ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು ನರಕೋಶದ ಚಯಾಪಚಯವನ್ನು ಮರುರೂಪಿಸಲು ಅನುಕ್ರಮ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸುತ್ತವೆ.
8 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನ OXPHOS- ಕೊರತೆಯಿರುವ PNಗಳು ಹೆಚ್ಚಿನ ಆವರ್ತನದ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಸರಿದೂಗಿಸಲು ಗಮನಾರ್ಹವಾದ ಚಯಾಪಚಯ ಮರುಸಂಪರ್ಕಕ್ಕೆ ಒಳಗಾಗಬಹುದು. ಈ ಆವಿಷ್ಕಾರವು ಈ ಕ್ಷಣದಲ್ಲಿಯೂ ಸಹ, ಈ ಜೀವಕೋಶಗಳು ನರಗಳ ಅವನತಿಯನ್ನು ವಿಳಂಬಗೊಳಿಸಲು ಅಥವಾ ತಡೆಯಲು ಚಿಕಿತ್ಸಕ ಹಸ್ತಕ್ಷೇಪವನ್ನು ಪಡೆಯಬಹುದು ಎಂಬ ಆಸಕ್ತಿದಾಯಕ ಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ಹುಟ್ಟುಹಾಕುತ್ತದೆ. ತಡವಾಗಿ. ನಾವು ಎರಡು ಸ್ವತಂತ್ರ ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಗಳ ಮೂಲಕ ಈ ಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ಪರಿಹರಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಮೊದಲ ವಿಧಾನದಲ್ಲಿ, ನಾವು Cre- ಅವಲಂಬಿತ ಅಡೆನೊ-ಸಂಬಂಧಿತ ವೈರಸ್ (AAV) ವೆಕ್ಟರ್ ಅನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಿದ್ದೇವೆ ಇದರಿಂದ MFN2 ಅನ್ನು OXPHOS- ಕೊರತೆಯಿರುವ PNಗಳಲ್ಲಿ ಇನ್ ವಿವೋದಲ್ಲಿ ಆಯ್ದವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಬಹುದು (ಚಿತ್ರ S7A). AAV ಎನ್‌ಕೋಡಿಂಗ್ MFN2 ಮತ್ತು ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ರಿಪೋರ್ಟರ್ ಜೀನ್ mCherry (Mfn2-AAV) ಅನ್ನು ಪ್ರಾಥಮಿಕ ನರಕೋಶ ಸಂಸ್ಕೃತಿಗಳಲ್ಲಿ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ ಪರಿಶೀಲಿಸಲಾಯಿತು, ಇದು MFN2 ಅನ್ನು Cre- ಅವಲಂಬಿತ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲು ಕಾರಣವಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನವನ್ನು ರಕ್ಷಿಸಿತು, ಇದರಿಂದಾಗಿ Mfn2cKO ನರಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ನರ ರೂಪಾಂತರವನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ S7, B, D ಮತ್ತು E). ಮುಂದೆ, ನಾವು 8 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನ Mfn2-AAV ಅನ್ನು Mfn2cKO ನ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್‌ಗೆ ಸ್ಟೀರಿಯೊಟ್ಯಾಕ್ಟಿಕ್ ಆಗಿ ತಲುಪಿಸಲು ಮತ್ತು ಇಲಿಗಳನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಲು ಇನ್ ವಿವೋ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು 12 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನ ಇಲಿಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 4A). ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಪಡೆದ Mfn2cKO ಇಲಿಗಳು ಸತ್ತವು (ಚಿತ್ರ 1, A ಮತ್ತು B) (16). ಇನ್ ವಿವೋ ವೈರಲ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಡಕ್ಷನ್ ಕೆಲವು ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ವಲಯಗಳಲ್ಲಿ PN ನ ಆಯ್ದ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಗೆ ಕಾರಣವಾಯಿತು (ಚಿತ್ರ S7, G ಮತ್ತು H). mCherry (Ctrl-AAV) ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ನಿಯಂತ್ರಣ AAV ಯ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ Mfn2cKO ಪ್ರಾಣಿಗಳಲ್ಲಿ ನರಗಳ ಅವನತಿಯ ಮಟ್ಟದ ಮೇಲೆ ಯಾವುದೇ ಗಮನಾರ್ಹ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಲಿಲ್ಲ. ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, Mfn2-AAV ನೊಂದಿಗೆ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಡ್ಯೂಸ್ ಮಾಡಲಾದ Mfn2cKO ಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು PN ಕೋಶ ಪದರದ ಗಮನಾರ್ಹ ರಕ್ಷಣಾತ್ಮಕ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 4, B ಮತ್ತು C). ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ನರಕೋಶದ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ನಿಯಂತ್ರಣ ಪ್ರಾಣಿಗಳಿಂದ ಬಹುತೇಕ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಗದಂತೆ ತೋರುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 4, B ಮತ್ತು C, ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ S7, H ಮತ್ತು I). MFN2 ಅಲ್ಲದ MFN1 ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು ನರಕೋಶದ ಸಾವನ್ನು ಉಳಿಸುವಲ್ಲಿ ಸಮಾನವಾಗಿ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 4C ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ S7, C ಮತ್ತು F), ಇದು ಅಪಸ್ಥಾನೀಯ MFN1 ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು MFN2 ಕೊರತೆಯನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಪೂರೈಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಏಕ PN ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು Mfn2-AAV ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾದ ಅಲ್ಟ್ರಾಸ್ಟ್ರಕ್ಚರ್ ಅನ್ನು ರಕ್ಷಿಸಿತು, mtDNA ಮಟ್ಟವನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯಗೊಳಿಸಿತು ಮತ್ತು ಆಂಜಿಯೋಜೆನೆಸಿಸ್ ವಿರೋಧಿ ಮಾರ್ಕರ್ PCx ನ ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಹಿಮ್ಮೆಟ್ಟಿಸಿತು (ಚಿತ್ರ 4, C ನಿಂದ E). ವಿಶ್ರಾಂತಿ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ರಕ್ಷಿಸಲ್ಪಟ್ಟ Mfn2cKO ಇಲಿಗಳ ದೃಶ್ಯ ಪರಿಶೀಲನೆಯು ಅವುಗಳ ಭಂಗಿ ಮತ್ತು ಮೋಟಾರ್ ಲಕ್ಷಣಗಳು (ಚಲನೆ S1 ನಿಂದ S3) ಸುಧಾರಿಸಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ. ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ, OXPHOS ನಲ್ಲಿ ತೀವ್ರವಾಗಿ ಕೊರತೆಯಿರುವ PN ಗಳಲ್ಲಿ MFN2 ನ ವಿಳಂಬಿತ ಮರುಪರಿಚಯವು mtDNA ಬಳಕೆಯನ್ನು ಹಿಮ್ಮೆಟ್ಟಿಸಲು ಮತ್ತು ಅಪಧಮನಿಕಾಠಿಣ್ಯವನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸಲು ಸಾಕಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ಈ ಪ್ರಯೋಗಗಳು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಆಕ್ಸಾನ್ ಅವನತಿ ಮತ್ತು ನರಕೋಶದ ಸಾವನ್ನು ಇನ್ ವಿವೋದಲ್ಲಿ ತಡೆಯುತ್ತದೆ.
(A) ಸೂಚಿಸಲಾದ ಚಯಾಪಚಯ ಮಾರ್ಗವನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿದಾಗ AAV ಎನ್‌ಕೋಡಿಂಗ್ MFN2 ಅನ್ನು ಇಂಜೆಕ್ಟ್ ಮಾಡುವ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ವೇಳಾಪಟ್ಟಿಯನ್ನು ತೋರಿಸುವ ಯೋಜನೆ. (B) Mfn2cKO ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ 8 ವಾರಗಳಲ್ಲಿ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಡ್ಯೂಸ್ ಮಾಡಲಾದ ಮತ್ತು ಆಂಟಿ-ಕ್ಯಾಲ್ಬಿಂಡಿನ್ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ 12 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಚೂರುಗಳ ಪ್ರತಿನಿಧಿ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಚಿತ್ರಗಳು. ಬಲ: ಆಕ್ಸಾನ್ ಫೈಬರ್‌ಗಳ ಸ್ಕೇಲಿಂಗ್. ಆಕ್ಸಾನ್ ಜೂಮ್‌ನ ಪ್ರಮಾಣವು 450 ಮತ್ತು 75 μm ಆಗಿದೆ. (C) ಎಡ: AAV ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಡಕ್ಷನ್ ಲೂಪ್‌ನಲ್ಲಿ (AAV+) ಪುರ್ಕಿಂಜೆ ಕೋಶ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ (ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಏಕಮುಖ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ; n = 3 ಇಲಿಗಳು). ಬಲ: 12 ನೇ ವಾರದಲ್ಲಿ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಡ್ಯೂಸ್ ಮಾಡಲಾದ PN ನಲ್ಲಿ mtDNA ಫೋಕಸ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (ಜೋಡಿಸದ t-ಪರೀಕ್ಷೆ; n = ಮೂರು ಇಲಿಗಳಿಂದ 6 ಕೋಶಗಳು). * P <0.05; ** P <0.01. (D) ಸೂಚಿಸಲಾದ ವೈರಲ್ ವೆಕ್ಟರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಡ್ಯೂಸ್ ಮಾಡಲಾದ Mfn2cKO ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ವಿಭಾಗಗಳ PN ಗಳ ಪ್ರತಿನಿಧಿ ಪ್ರಸರಣ ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್ ಮೈಕ್ರೋಗ್ರಾಫ್‌ಗಳು. ಗುಲಾಬಿ ಬಣ್ಣದ ಮುಖವಾಡವು ಡೆಂಡ್ರೈಟ್‌ಗಳಿಂದ ಆಕ್ರಮಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ವಿವರಿಸುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಹಳದಿ ಚುಕ್ಕೆಗಳಿರುವ ಚೌಕವು ಬಲಭಾಗದಲ್ಲಿ ಒದಗಿಸಲಾದ ಜೂಮ್ ಅನ್ನು ವಿವರಿಸುತ್ತದೆ; n ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 1μm. (E) 12 ವಾರಗಳಲ್ಲಿ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಡ್ಯೂಸ್ ಮಾಡಲಾದ PN ನಲ್ಲಿ PCx ಸ್ಟೇನಿಂಗ್‌ನ ಉದಾಹರಣೆಯನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 20μm. OE, ಅತಿಯಾದ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ; FC, ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆ.
ಅಂತಿಮವಾಗಿ, OXPHOS ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಅನುಭವಿಸಿದ PN ಗಳಲ್ಲಿ ಪೆರಾಕ್ಸಿಡೇಸ್-ಪ್ರೇರಿತ ಜೀವಕೋಶದ ಬದುಕುಳಿಯುವಿಕೆಯ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ನಾವು ತನಿಖೆ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ. ನಾವು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಮೌಸ್ PCx mRNA (AAV-shPCx) ಅನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸಿಕೊಂಡು mCherry ಎನ್‌ಕೋಡಿಂಗ್ AAV-shRNA (ಶಾರ್ಟ್ ಹೇರ್‌ಪಿನ್ RNA) ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು Mfn2cKO ಇಲಿಗಳ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಂಗೆ ವೈರಸ್ ಅಥವಾ ಅದರ ಸ್ಕ್ರಾಂಬಲ್ಡ್ ಕಂಟ್ರೋಲ್ (AAV-scr) ಅನ್ನು ಚುಚ್ಚಿದ್ದೇವೆ. PCx ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಹೆಚ್ಚಾದಾಗ (ಚಿತ್ರ 3C) ಮತ್ತು PN ಕೋಶ ಪದರವು ಇನ್ನೂ ಹಾಗೇ ಇದ್ದಾಗ (ಚಿತ್ರ 1A) ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ PCx ನಾಕ್‌ಡೌನ್ ಅನ್ನು ಸಾಧಿಸಲು ವಯಸ್ಸಿನ ನಾಲ್ಕನೇ ವಾರದಲ್ಲಿ (ಚಿತ್ರ 5A) ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಅನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. PCx (ಚಿತ್ರ S8A) ಅನ್ನು ನಾಕ್ ಡೌನ್ ಮಾಡುವುದರಿಂದ PN ಸಾವಿನ ಗಮನಾರ್ಹ ವೇಗವರ್ಧನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಸೋಂಕಿತ ಉಂಗುರಕ್ಕೆ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 5, B ಮತ್ತು C). PCx ಅಪ್-ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್ ನಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ಚಯಾಪಚಯ ಪರಿಣಾಮಗಳ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು, ಗ್ಲುಟಾಥಿಯೋನ್ ಅನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲು PCx ನಾಕ್‌ಡೌನ್ ಮತ್ತು AAV-ಮಧ್ಯಸ್ಥ ಆಪ್ಟಿಕಲ್ ಬಯೋಸೆನ್ಸರ್ Grx1-roGFP2 ಅನ್ನು ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಿದ ನಂತರ PN ಗಳ ರೆಡಾಕ್ಸ್ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ನಾವು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ S8, B ನಿಂದ D). ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ರೆಡಾಕ್ಸ್ ಸಂಭಾವ್ಯತೆಯ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಬದಲಾವಣೆ (38). ನಂತರ, FLIM ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ ನಂತರ ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ರೆಡಾಕ್ಸ್ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಸಂಭಾವ್ಯ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು 7 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನ Mfn2cKO ಅಥವಾ ನಿಯಂತ್ರಣ ಲಿಟರ್‌ಮೇಟ್‌ಗಳ ತೀವ್ರ ಮೆದುಳಿನ ಚೂರುಗಳಲ್ಲಿ ನಾವು ಎರಡು-ಫೋಟಾನ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಜೀವಿತಾವಧಿಯ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ (FLIM) ಅನ್ನು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ S8, E ನಿಂದ G). PCx ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಇಲ್ಲದ ಒಂದೇ Mfn2cKO PN ಗಳ ಆಕ್ಸಿಡೀಕರಣ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ತೋರಿಸಿದೆ, ಇದು ನಿಯಂತ್ರಣ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಸ್ಕ್ರಾಂಬಲ್ಡ್ shRNA ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ Mfn2cKO PN ಗಳಿಗಿಂತ ಭಿನ್ನವಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 5, D ಮತ್ತು E). PCx ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ-ನಿಯಂತ್ರಿಸಿದಾಗ, ಹೆಚ್ಚು ಆಕ್ಸಿಡೀಕೃತ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ತೋರಿಸುವ Mfn2cKO PN ಗಳ ಶೇಕಡಾವಾರು ಪ್ರಮಾಣವು ಮೂರು ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 5E), ಇದು PCx ಅಪ್-ನಿಯಂತ್ರಣವು ಕ್ಷೀಣಿಸಿದ ನರಕೋಶಗಳ ರೆಡಾಕ್ಸ್ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಕಾಯ್ದುಕೊಂಡಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
(A) ಸೂಚಿಸಲಾದ ಚಯಾಪಚಯ ಮಾರ್ಗವನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿದಾಗ AAV ಎನ್‌ಕೋಡಿಂಗ್ shPCx ಅನ್ನು ಇಂಜೆಕ್ಟ್ ಮಾಡುವ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ವೇಳಾಪಟ್ಟಿಯನ್ನು ತೋರಿಸುವ ಯೋಜನೆ. (B) 4 ವಾರಗಳಲ್ಲಿ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಡ್ಯೂಸ್ ಮಾಡಲಾದ ಮತ್ತು ಆಂಟಿ-ಕ್ಯಾಲ್ಸಿನೂರಿನ್ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ Mfn2cKO ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ 8 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ವಿಭಾಗಗಳ ಪ್ರತಿನಿಧಿ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಛಾಯಾಚಿತ್ರಗಳು. ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 450μm. (C) AAV-ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಡ್ಯೂಸ್ಡ್ ಲೂಪ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಪುರ್ಕಿಂಜೆ ಕೋಶ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ (ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಏಕಮುಖ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ; n = 3 ರಿಂದ 4 ಇಲಿಗಳು). ಡೇಟಾವನ್ನು ಸರಾಸರಿ ± SEM ಎಂದು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ; ***P<0.001. (D) ಪ್ರತಿನಿಧಿ FLIM ಚಿತ್ರವು ನಿರ್ದಿಷ್ಟಪಡಿಸಿದ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಗ್ಲುಟಾಥಿಯೋನ್ ರೆಡಾಕ್ಸ್ ಸೆನ್ಸರ್ Grx1-roGFP2 ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ 7 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನ PN ನ ಸರಾಸರಿ ಜೀವಿತಾವಧಿಯನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. LUT (ಲುಕ್-ಅಪ್ ಟೇಬಲ್) ಅನುಪಾತ: ಬದುಕುಳಿಯುವ ಸಮಯದ ಮಧ್ಯಂತರ (ಪಿಕೋಸೆಕೆಂಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ). ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 25μm. (ಇ) ಹಿಸ್ಟೋಗ್ರಾಮ್ (D) (n=158 ರಿಂದ 368 ಜೀವಕೋಶಗಳವರೆಗೆ ಪ್ರತಿ ಷರತ್ತಿನಡಿಯಲ್ಲಿ ಎರಡು ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ Grx1-roGFP2 ಜೀವಿತಾವಧಿಯ ಮೌಲ್ಯಗಳ ವಿತರಣೆಯನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಪ್ರತಿ ಹಿಸ್ಟೋಗ್ರಾಮ್‌ನ ಮೇಲಿನ ಪೈ ಚಾರ್ಟ್: ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಉದ್ದವಾದ (ಕೆಂಪು, ಆಕ್ಸಿಡೀಕೃತ) ಅಥವಾ ಕಡಿಮೆ (ನೀಲಿ, ಕಡಿಮೆಯಾದ) ಜೀವಿತಾವಧಿಯ ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಕೋಶಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು CTRL-AAV-scr ನಲ್ಲಿ ಸರಾಸರಿ ಜೀವಿತಾವಧಿಯ ಮೌಲ್ಯದ 1 SD ಯನ್ನು ಮೀರುತ್ತದೆ. (ಎಫ್) ಪ್ರಸ್ತಾವಿತ ಮಾದರಿಯು ನರಕೋಶದ PCx ನ ಅಪ್‌ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್‌ನ ರಕ್ಷಣಾತ್ಮಕ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.
ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ನಾವು ಇಲ್ಲಿ ಒದಗಿಸುವ ದತ್ತಾಂಶವು MFN2 ನ ಮರು-ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು ತೀವ್ರವಾದ OXPHOS ಕೊರತೆ, ತೀವ್ರವಾದ mtDNA ಸವಕಳಿ ಮತ್ತು ಅತ್ಯಂತ ಅಸಹಜ ಇಸ್ಟಾ ತರಹದ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನದೊಂದಿಗೆ ಮುಂದುವರಿದ PN ಅನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ರಕ್ಷಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಮುಂದುವರಿದ ಕಾಯಿಲೆಗಳಲ್ಲಿಯೂ ಸಹ ನಿರಂತರ ಪ್ರಗತಿಯನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ. ನರವಿಘಟನೆಯು ಜೀವಕೋಶದ ಸಾವಿಗೆ ಮುಂಚಿನ ಹಂತದ ಹಿಮ್ಮುಖ ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ಮಟ್ಟದ ಚಯಾಪಚಯ ನಮ್ಯತೆಯು ಅಪಧಮನಿಕಾಠಿಣ್ಯವನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುವ ನರಕೋಶಗಳ ಸಾಮರ್ಥ್ಯದಿಂದ ಮತ್ತಷ್ಟು ಒತ್ತಿಹೇಳುತ್ತದೆ (TCA ಚಕ್ರದ ಮರುವೈರಿಂಗ್), ಇದು OXPHOS ಕೊರತೆಯಿರುವ PN ಗಳಲ್ಲಿ PCx ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಜೀವಕೋಶದ ಸಾವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ರಕ್ಷಣಾತ್ಮಕ ಪಾತ್ರವನ್ನು ವಹಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 5F).
ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ, OXPHOS ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಗೆ PN ಗಳ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು ಚಯಾಪಚಯ ಕಾರ್ಯಕ್ರಮಗಳಿಂದ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲಾದ ಭೇದಾತ್ಮಕ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವ ಮಾರ್ಗದ ಮೂಲಕ ಕ್ರಮೇಣ TCA ಚಕ್ರ ಅಪಧಮನಿಕಾಠಿಣ್ಯಕ್ಕೆ ಒಮ್ಮುಖವಾಗುವುದು ಎಂಬುದಕ್ಕೆ ನಾವು ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸಿದ್ದೇವೆ. ನಾವು ಅನೇಕ ಪೂರಕ ವಿಧಾನಗಳೊಂದಿಗೆ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ತೀವ್ರವಾದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯಿಂದ ಸವಾಲು ಹಾಕಿದಾಗ, ನರಕೋಶಗಳು ಹಿಂದೆ ತಿಳಿದಿಲ್ಲದ ಚಯಾಪಚಯ ಸ್ಥಿತಿಸ್ಥಾಪಕತ್ವವನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ. ನಮ್ಮ ಆಶ್ಚರ್ಯಕ್ಕೆ, ಸಂಪೂರ್ಣ ರಿವೈರಿಂಗ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ನರಗಳ ಅವನತಿಯೊಂದಿಗೆ ಕ್ರಮೇಣ ಮತ್ತು ಬದಲಾಯಿಸಲಾಗದಂತೆ ಟರ್ಮಿನಲ್ ಮೆಟಾಬಾಲಿಕ್ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಅಗತ್ಯವಾಗಿ ಗುರುತಿಸುವುದಿಲ್ಲ, ಆದರೆ ನಮ್ಮ ಡೇಟಾವು ಜೀವಕೋಶದ ಸಾವಿಗೆ ಮುಂಚಿನ ಹಂತದಲ್ಲಿಯೂ ಸಹ ನಿರ್ವಹಣಾ ನರಕೋಶವನ್ನು ರೂಪಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ಸಂಶೋಧನೆಯು ನರಕೋಶಗಳು ದೇಹದಲ್ಲಿ ಗಣನೀಯ ಪ್ರಮಾಣದ ಚಯಾಪಚಯ ಪ್ಲಾಸ್ಟಿಟಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. MFN2 ನ ನಂತರದ ಮರುಪರಿಚಯವು ಪ್ರಮುಖ ಚಯಾಪಚಯ ಗುರುತುಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಹಿಮ್ಮೆಟ್ಟಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು PN ಅವನತಿಯನ್ನು ತಡೆಯಬಹುದು ಎಂದು ಈ ಅಂಶವು ಸಾಬೀತುಪಡಿಸುತ್ತದೆ. ಇದಕ್ಕೆ ವಿರುದ್ಧವಾಗಿ, ಇದು ಅಪಧಮನಿಕಾಠಿಣ್ಯವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನರಗಳನ್ನು ವೇಗಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ. ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಸೆಕ್ಸುವಲ್.
ನಮ್ಮ ಸಂಶೋಧನೆಯಲ್ಲಿ ಅತ್ಯಂತ ಆಕರ್ಷಕವಾದ ಸಂಶೋಧನೆಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದೆಂದರೆ, OXPHOS ಕೊರತೆಯಿರುವ PNಗಳು ಅಪಧಮನಿಕಾಠಿಣ್ಯವನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಉತ್ತೇಜಿಸುವ ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಮೂಲಕ TCA ಚಕ್ರ ಚಯಾಪಚಯವನ್ನು ಮಾರ್ಪಡಿಸಬಹುದು. ಚಯಾಪಚಯ ಮರುಜೋಡಣೆ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳ ಸಾಮಾನ್ಯ ಲಕ್ಷಣವಾಗಿದೆ, ಅವುಗಳಲ್ಲಿ ಕೆಲವು TCA ಚಕ್ರ ಮಧ್ಯಂತರಗಳನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವ ಸಮಾನತೆಯನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಗ್ಲುಟಾಮಿನ್ ಅನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿವೆ, ಇದು ಉಸಿರಾಟದ ಸರಪಳಿಯನ್ನು ಚಾಲನೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಲಿಪಿಡ್ ಮತ್ತು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್ ಜೈವಿಕ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪೂರ್ವಗಾಮಿಗಳ ಉತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ (39, 40). ಇತ್ತೀಚಿನ ಅಧ್ಯಯನವು OXPHOS ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಅನುಭವಿಸುತ್ತಿರುವ ಬಾಹ್ಯ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿ, ಗ್ಲುಟಾಮಿನ್/ಗ್ಲುಟಮೇಟ್ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಮರುಸಂಪರ್ಕವು ಸಹ ಒಂದು ಪ್ರಮುಖ ಲಕ್ಷಣವಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (5, 41), ಅಲ್ಲಿ TCA ಚಕ್ರಕ್ಕೆ ಗ್ಲುಟಾಮಿನ್ ಪ್ರವೇಶದ ದಿಕ್ಕು OXPHOS ಗಾಯದ ತೀವ್ರತೆಯಿಂದಾಗಿ (41). ಆದಾಗ್ಯೂ, ದೇಹದಲ್ಲಿ ನರಕೋಶದ ಚಯಾಪಚಯ ಪ್ಲಾಸ್ಟಿಟಿಯ ಯಾವುದೇ ಹೋಲಿಕೆ ಮತ್ತು ರೋಗದ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ ಅದರ ಸಂಭವನೀಯ ಪ್ರಸ್ತುತತೆಯ ಬಗ್ಗೆ ಸ್ಪಷ್ಟ ಪುರಾವೆಗಳ ಕೊರತೆಯಿದೆ. ಇತ್ತೀಚಿನ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ, ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ನರಕೋಶಗಳು ನರಪ್ರೇಕ್ಷಕಕ್ಕಾಗಿ ಗ್ಲುಟಮೇಟ್ ಪೂಲ್‌ಗಳನ್ನು ಸಜ್ಜುಗೊಳಿಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಚಯಾಪಚಯ ಒತ್ತಡದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಆಕ್ಸಿಡೇಟಿವ್ ಚಯಾಪಚಯ ಮತ್ತು ಅಪಧಮನಿಕಾಠಿಣ್ಯವನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ (42). TCA ಸೈಕಲ್ ಕಿಣ್ವ ಸಕ್ಸಿನೇಟ್ ಡಿಹೈಡ್ರೋಜಿನೇಸ್‌ನ ಔಷಧೀಯ ಪ್ರತಿಬಂಧದ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ, ಪೈರುವೇಟ್ ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿಲೇಷನ್ ಕಲ್ಚರ್ಡ್ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಗ್ರ್ಯಾನ್ಯೂಲ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಆಕ್ಸಲೋಅಸೆಟೇಟ್‌ನ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಂಬಲಾಗಿದೆ (34). ಆದಾಗ್ಯೂ, ಮೆದುಳಿನ ಅಂಗಾಂಶಕ್ಕೆ ಈ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ಶಾರೀರಿಕ ಪ್ರಸ್ತುತತೆ (ಅಪಧಮನಿ ಕಾಠಿಣ್ಯವು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಆಸ್ಟ್ರೋಸೈಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಂಬಲಾಗಿದೆ) ಇನ್ನೂ ಪ್ರಮುಖ ಶಾರೀರಿಕ ಮಹತ್ವವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ (43). ಈ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ದೇಹದಲ್ಲಿ OXPHOS ನಿಂದ ಹಾನಿಗೊಳಗಾದ PN ಗಳನ್ನು BCAA ಅವನತಿ ಮತ್ತು ಪೈರುವೇಟ್ ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿಲೇಷನ್‌ಗೆ ಬದಲಾಯಿಸಬಹುದು ಎಂದು ನಮ್ಮ ಡೇಟಾ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಇವು TCA ಪೂಲ್ ಮಧ್ಯಂತರಗಳ ಪೂರಕತೆಯ ಎರಡು ಪ್ರಮುಖ ಮೂಲಗಳಾಗಿವೆ. ನರಕೋಶದ ಶಕ್ತಿ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಗೆ BCAA ಕ್ಯಾಟಬಾಲಿಸಂನ ಸಂಭಾವ್ಯ ಕೊಡುಗೆಯನ್ನು ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸಲಾಗಿದ್ದರೂ, ನರಪ್ರೇಕ್ಷಕಕ್ಕೆ ಗ್ಲುಟಮೇಟ್ ಮತ್ತು GABA ಪಾತ್ರದ ಜೊತೆಗೆ (44), ವಿವೋದಲ್ಲಿ ಈ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳಿಗೆ ಇನ್ನೂ ಯಾವುದೇ ಪುರಾವೆಗಳಿಲ್ಲ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಅಪಧಮನಿಕಾಠಿಣ್ಯವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುವ ಮೂಲಕ ಸಂಯೋಜನೆ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಿಂದ ನಡೆಸಲ್ಪಡುವ TCA ಮಧ್ಯಂತರಗಳ ಬಳಕೆಯನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯ PN ಗಳು ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತವಾಗಿ ಸರಿದೂಗಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಊಹಿಸುವುದು ಸುಲಭ. ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಆಸ್ಪರ್ಟಿಕ್ ಆಮ್ಲಕ್ಕೆ ಹೆಚ್ಚಿದ ಬೇಡಿಕೆಯನ್ನು ಕಾಯ್ದುಕೊಳ್ಳಲು PCx ನ ಅಪ್‌ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್ ಅಗತ್ಯವಾಗಬಹುದು, ಇದನ್ನು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯೊಂದಿಗೆ ಜೀವಕೋಶಗಳ ಪ್ರಸರಣದಲ್ಲಿ ಸೂಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (45). ಆದಾಗ್ಯೂ, ನಮ್ಮ ಮೆಟಾಬಾಲೊಮಿಕ್ಸ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು Mfn2cKO PN ಗಳಲ್ಲಿ ಆಸ್ಪರ್ಟಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಸ್ಥಿರ-ಸ್ಥಿತಿಯ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಗಮನಾರ್ಹ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಲಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ S6A), ಇದು ಸಂಭಾವ್ಯವಾಗಿ ಪ್ರಸರಣ ಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು ಪೋಸ್ಟ್-ಮೈಟೋಟಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ಆಸ್ಪರ್ಟಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ವಿಭಿನ್ನ ಚಯಾಪಚಯ ಬಳಕೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆ. ಇನ್ ವಿವೋ ನಿಷ್ಕ್ರಿಯ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ PCx ಅಪ್‌ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್‌ನ ನಿಖರವಾದ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಇನ್ನೂ ನಿರೂಪಿಸಬೇಕಾಗಿದೆ, ಈ ಅಕಾಲಿಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳ ರೆಡಾಕ್ಸ್ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಕಾಪಾಡಿಕೊಳ್ಳುವಲ್ಲಿ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರ ವಹಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದನ್ನು ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಸ್ಲೈಸ್‌ಗಳ ಮೇಲಿನ FLIM ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾಗಿದೆ. ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, PCx ಅನ್ನು ಅಪ್‌ರೆಗ್ಯುಲೇಟ್ ಮಾಡುವುದರಿಂದ PN ಗಳನ್ನು ತಡೆಯುವುದು ಹೆಚ್ಚು ಆಕ್ಸಿಡೀಕೃತ ಸ್ಥಿತಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು ಮತ್ತು ಜೀವಕೋಶದ ಸಾವನ್ನು ವೇಗಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ. BCAA ಅವನತಿಯ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಪೈರುವೇಟ್‌ನ ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿಲೇಷನ್ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಬಾಹ್ಯ ಅಂಗಾಂಶಗಳನ್ನು ನಿರೂಪಿಸುವ ಮಾರ್ಗಗಳಲ್ಲ (7). ಆದ್ದರಿಂದ, ಅವು OXPHOS- ಕೊರತೆಯಿರುವ ನರಕೋಶಗಳ ಆದ್ಯತೆಯ ಲಕ್ಷಣವೆಂದು ತೋರುತ್ತದೆ, ನರಗಳ ಅವನತಿಗೆ ಮುಖ್ಯವಾದ ಏಕೈಕ ಲಕ್ಷಣವಲ್ಲದಿದ್ದರೂ ಸಹ.
ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಕಾಯಿಲೆಯು ವೈವಿಧ್ಯಮಯ ರೀತಿಯ ನರಕ್ಷಯ ಕಾಯಿಲೆಯಾಗಿದ್ದು, ಇದು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಅಟಾಕ್ಸಿಯಾವಾಗಿ ಪ್ರಕಟವಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ PN ಗಳಿಗೆ ಹಾನಿ ಮಾಡುತ್ತದೆ (46). ಈ ನರಕೋಶದ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಗೆ ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಗುರಿಯಾಗುತ್ತದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿನ ಅವುಗಳ ಆಯ್ದ ಅವನತಿಯು ಮಾನವ ಸ್ಪಿನೋಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಅಟಾಕ್ಸಿಯಾವನ್ನು ನಿರೂಪಿಸುವ ಅನೇಕ ಮೋಟಾರ್ ಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಪುನರುತ್ಪಾದಿಸಲು ಸಾಕಾಗುತ್ತದೆ (16, 47, 48). ವರದಿಗಳ ಪ್ರಕಾರ, ರೂಪಾಂತರಿತ ಜೀನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಜೆನಿಕ್ ಮೌಸ್ ಮಾದರಿಯು ಮಾನವ ಸ್ಪಿನೋಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಅಟಾಕ್ಸಿಯಾದೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ (49, 50), PNPH ನಲ್ಲಿ OXPHOS ಕೊರತೆಯ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡುವ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ಒತ್ತಿಹೇಳುತ್ತದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಈ ವಿಶಿಷ್ಟ ನರಕೋಶದ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸುವುದು ಮತ್ತು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡುವುದು ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, PN ಗಳು ಒತ್ತಡಕ್ಕೆ ಬಹಳ ಸೂಕ್ಷ್ಮವಾಗಿರುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಸಂಪೂರ್ಣ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಕೋಶ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯ ಕಡಿಮೆ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ, ಅನೇಕ ಓಮಿಕ್ಸ್-ಆಧಾರಿತ ಅಧ್ಯಯನಗಳಿಗೆ, ಅವುಗಳನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣ ಕೋಶಗಳಾಗಿ ಆಯ್ದ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆ ಇನ್ನೂ ಸವಾಲಿನ ಅಂಶವಾಗಿದೆ. ಇತರ ಜೀವಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳ (ವಿಶೇಷವಾಗಿ ವಯಸ್ಕ ಅಂಗಾಂಶಗಳ) ಮಾಲಿನ್ಯದ ಸಂಪೂರ್ಣ ಕೊರತೆಯನ್ನು ಸಾಧಿಸುವುದು ಅಸಾಧ್ಯವಾದರೂ, ನಾವು FACS ನೊಂದಿಗೆ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ವಿಘಟನೆಯ ಹಂತವನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸಿ, ಕೆಳಮುಖ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ಸ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಸಾಕಷ್ಟು ಸಂಖ್ಯೆಯ ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯವಾದ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಪಡೆದುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಇಡೀ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಮ್‌ನ ಅಸ್ತಿತ್ವದಲ್ಲಿರುವ ಡೇಟಾ ಸೆಟ್‌ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಸಾಕಷ್ಟು ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರೋಟೀನ್ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯನ್ನು (ಸುಮಾರು 3000 ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು) ಹೊಂದಿದ್ದೇವೆ (51). ಸಂಪೂರ್ಣ ಜೀವಕೋಶಗಳ ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ಸಂರಕ್ಷಿಸುವ ಮೂಲಕ, ನಾವು ಇಲ್ಲಿ ಒದಗಿಸುವ ವಿಧಾನವು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾದಲ್ಲಿನ ಚಯಾಪಚಯ ಮಾರ್ಗಗಳಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಲು ಮಾತ್ರವಲ್ಲದೆ, ಅದರ ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ಪ್ರತಿರೂಪಗಳಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಲು ಸಹ ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಜೀವಕೋಶ ಪ್ರಕಾರವನ್ನು ಉತ್ಕೃಷ್ಟಗೊಳಿಸಲು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಮೆಂಬರೇನ್ ಟ್ಯಾಗ್‌ಗಳ ಬಳಕೆಯನ್ನು ಪೂರೈಸುತ್ತದೆ. ಸಂಕೀರ್ಣ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಹೊಸ ವಿಧಾನ (52, 53). ನಾವು ವಿವರಿಸುವ ವಿಧಾನವು ಪುರ್ಕಿಂಜೆ ಕೋಶಗಳ ಅಧ್ಯಯನಕ್ಕೆ ಮಾತ್ರ ಸಂಬಂಧಿಸಿಲ್ಲ, ಆದರೆ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಇತರ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಂತೆ ರೋಗಪೀಡಿತ ಮಿದುಳಿನಲ್ಲಿನ ಚಯಾಪಚಯ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಪರಿಹರಿಸಲು ಯಾವುದೇ ರೀತಿಯ ಜೀವಕೋಶಕ್ಕೆ ಸುಲಭವಾಗಿ ಅನ್ವಯಿಸಬಹುದು.
ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಈ ಚಯಾಪಚಯ ಮರುಜೋಡಣೆ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ನಾವು ಒಂದು ಚಿಕಿತ್ಸಕ ವಿಂಡೋವನ್ನು ಗುರುತಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಅದು ಜೀವಕೋಶದ ಒತ್ತಡದ ಪ್ರಮುಖ ಚಿಹ್ನೆಗಳನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಹಿಮ್ಮೆಟ್ಟಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನರಕೋಶದ ಅವನತಿಯನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಇಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದ ರಿವೈರಿಂಗ್‌ನ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳುವುದು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ನರಕೋಶದ ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ಕಾಪಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು ಸಂಭವನೀಯ ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳ ಬಗ್ಗೆ ಮೂಲಭೂತ ಒಳನೋಟಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸಬಹುದು. ಇತರ ಮೆದುಳಿನ ಜೀವಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳಲ್ಲಿ ಶಕ್ತಿಯ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ವಿಂಗಡಿಸುವ ಗುರಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಭವಿಷ್ಯದ ಸಂಶೋಧನೆಯು ಇತರ ನರವೈಜ್ಞಾನಿಕ ಕಾಯಿಲೆಗಳಿಗೆ ಈ ತತ್ವದ ಅನ್ವಯಿಕತೆಯನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಲು ಅಗತ್ಯವಿದೆ.
ಮಿಟೊಪಾರ್ಕ್ ಇಲಿಗಳನ್ನು ಈ ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಲಾಗಿದೆ (31). loxP ಪಾರ್ಶ್ವ Mfn2 ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ C57BL/6N ಇಲಿಗಳನ್ನು ಈ ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಲಾಗಿದೆ (18) ಮತ್ತು L7-Cre ಇಲಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಕರಿಸಲಾಗಿದೆ (23). ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಡಬಲ್ ಹೆಟೆರೋಜೈಗಸ್ ಸಂತತಿಯನ್ನು ನಂತರ ಹೋಮೋಜೈಗಸ್ Mfn2loxP/Mfn2loxP ಇಲಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಕರಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದು Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) ಗಾಗಿ ಪುರ್ಕಿಂಜೆ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಜೀನ್ ನಾಕ್‌ಔಟ್‌ಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ. ಸಂಯೋಗದ ಉಪವಿಭಾಗದಲ್ಲಿ, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP ಆಲೀಲ್ (stop-mtYFP) ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚುವರಿ ದಾಟುವಿಕೆಗಳ ಮೂಲಕ ಪರಿಚಯಿಸಲಾಯಿತು (20). ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರಾಣಿಗಳ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಯುರೋಪಿಯನ್, ರಾಷ್ಟ್ರೀಯ ಮತ್ತು ಸಾಂಸ್ಥಿಕ ಮಾರ್ಗಸೂಚಿಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಜರ್ಮನಿಯ ನಾರ್ತ್ ರೈನ್-ವೆಸ್ಟ್‌ಫಾಲಿಯಾದಲ್ಲಿರುವ ಉಮ್ವೆಲ್ಟ್ ಮತ್ತು ವರ್ಬ್ರಾಚರ್‌ಸ್ಚುಟ್ಜ್‌ನ ಲ್ಯಾಂಡೆಸಮ್ಟ್‌ಫರ್‌ನ್ಯಾಚುರ್ ಅನುಮೋದಿಸಿದ್ದಾರೆ. ಪ್ರಾಣಿಗಳ ಕೆಲಸವು ಯುರೋಪಿಯನ್ ಫೆಡರೇಶನ್ ಆಫ್ ಲ್ಯಾಬೋರೇಟರಿ ಅನಿಮಲ್ ಸೈನ್ಸಸ್ ಅಸೋಸಿಯೇಷನ್‌ಗಳ ಮಾರ್ಗದರ್ಶನವನ್ನು ಸಹ ಅನುಸರಿಸುತ್ತದೆ.
ಗರ್ಭಿಣಿ ಮಹಿಳೆಯ ಗರ್ಭಕಂಠದ ಸ್ಥಳಾಂತರವನ್ನು ಅರಿವಳಿಕೆ ಮಾಡಿದ ನಂತರ, ಇಲಿಯ ಭ್ರೂಣವನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (E13). ಹ್ಯಾಂಕ್ಸ್‌ನ ಸಮತೋಲಿತ ಉಪ್ಪು ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ (HBSS) ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್ ಅನ್ನು 10 mM ಹೆಪ್ಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕವಾಗಿ ವಿಭಜಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪಪೈನ್ (20 U/ml) ಮತ್ತು ಸಿಸ್ಟೀನ್ (1μg/ml) ಹೊಂದಿರುವ ಡಲ್ಬೆಕ್ಕೊದ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಈಗಲ್ಸ್ ಮೀಡಿಯಂಗೆ ರವಾನಿಸಲಾಯಿತು. DMEM ನಲ್ಲಿ ಅಂಗಾಂಶವನ್ನು ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕಿಣ್ವಕ ಜೀರ್ಣಕ್ರಿಯೆಯ ಮೂಲಕ ಅದನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು. Ml) 37°C ನಲ್ಲಿ 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ, ಮತ್ತು ನಂತರ 10% ಭ್ರೂಣದ ಗೋವಿನ ಸೀರಮ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕವಾದ DMEM ನಲ್ಲಿ ಯಾಂತ್ರಿಕವಾಗಿ ಮಿಲ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. 6 ಸೆಂ.ಮೀ. ಸಂಸ್ಕೃತಿ ಭಕ್ಷ್ಯಕ್ಕೆ 2×106 ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಅಥವಾ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ 0.5×105 ಕೋಶಗಳು/cm2 ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಪಾಲಿಲೈಸಿನ್‌ನಿಂದ ಲೇಪಿತವಾದ ಗಾಜಿನ ಕವರ್‌ಸ್ಲಿಪ್‌ಗಳ ಮೇಲೆ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಬೀಜ ಮಾಡಲಾಯಿತು. 4 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ, ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು 1% B27 ಪೂರಕ ಮತ್ತು 0.5 mM ಗ್ಲುಟಾಮ್ಯಾಕ್ಸ್ ಹೊಂದಿರುವ ನ್ಯೂರೋಬಾಸಲ್ ಸೀರಮ್-ಮುಕ್ತ ಮಾಧ್ಯಮದೊಂದಿಗೆ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ನರಕೋಶಗಳನ್ನು ಪ್ರಯೋಗದ ಉದ್ದಕ್ಕೂ 37°C ಮತ್ತು 5% CO2 ನಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ವಾರಕ್ಕೊಮ್ಮೆ ಆಹಾರವನ್ನು ನೀಡಲಾಯಿತು. ಇನ್ ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ ಮರುಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುವ ಸಲುವಾಗಿ, ಕೆಳಗಿನ AAV9 ವೈರಸ್ ವೆಕ್ಟರ್‌ನ 3μl (24-ಬಾವಿ ಸಂಸ್ಕೃತಿ ಭಕ್ಷ್ಯ) ಅಥವಾ 0.5μl (24-ಬಾವಿ ತಟ್ಟೆ) ಅನ್ನು ಎರಡನೇ ದಿನ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ ನರಕೋಶಗಳಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಲು ಬಳಸಲಾಯಿತು: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (ಆಡ್‌ಜೀನ್, ಕ್ಯಾಟಲಾಗ್ ಸಂಖ್ಯೆ 105530-AAV9) ಮತ್ತು AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (ಆಡ್‌ಜೀನ್, ಕ್ಯಾಟಲಾಗ್ ಸಂಖ್ಯೆ 105545-AAV9).
ಮೌಸ್ Mfn1 ಮತ್ತು Mfn2 ಪೂರಕ DNA (ಕ್ರಮವಾಗಿ ಆಡ್ಜೀನ್ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ #23212 ಮತ್ತು #23213 ನಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ) ಅನ್ನು C-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ V5 ಅನುಕ್ರಮ (GKPIPNPLLGLDST) ನೊಂದಿಗೆ ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು T2A ಅನುಕ್ರಮದ ಮೂಲಕ ಚೌಕಟ್ಟಿನಲ್ಲಿ mCherry ನೊಂದಿಗೆ ಬೆಸೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. Grx1-roGFP2 ಎಂಬುದು ಹೈಡೆಲ್‌ಬರ್ಗ್ TP ಡಿಕ್ DFKZ (ಡಾಯ್ಚಸ್ ಕ್ರೆಬ್ಸ್‌ಫೋರ್ಸ್‌ಚಂಗ್ಸ್‌ಜೆಂಟ್ರಮ್) ನಿಂದ ಬಂದ ಕೊಡುಗೆಯಾಗಿದೆ. ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು tdTomato ಕ್ಯಾಸೆಟ್ ಅನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸುವ ಮೂಲಕ, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ಮತ್ತು pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 ವೆಕ್ಟರ್‌ಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಕ್ಯಾಸೆಟ್ ಅನ್ನು pAAV-CAG-FLEX-tdTomato ಬೆನ್ನೆಲುಬಿಗೆ (ಆಡ್‌ಜೀನ್ ಉಲ್ಲೇಖ ಸಂಖ್ಯೆ 28306) ಸಬ್‌ಕ್ಲೋನ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ನಿಯಂತ್ರಣ ವೆಕ್ಟರ್ pAAV-CAG-FLEX-mCherry ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಇದೇ ರೀತಿಯ ತಂತ್ರವನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. AAV-shPCx ರಚನೆಯನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು, ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ AAV ವೆಕ್ಟರ್ (ವೆಕ್ಟರ್‌ಬಿಲ್ಡರ್, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) ಅಗತ್ಯವಿದೆ, ಇದು shRNA ಅನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸಿಕೊಂಡು ಮೌಸ್ PCx ಅನ್ನು ಎನ್‌ಕೋಡ್ ಮಾಡುವ DNA ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) U6 ಪ್ರವರ್ತಕದ ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿ, mCherry ಅನ್ನು CMV ಪ್ರವರ್ತಕದ ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸಹಾಯಕ AAV ವೆಕ್ಟರ್‌ಗಳ ಉತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ತಯಾರಕರ ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ (ಸೆಲ್ ಬಯೋಲ್ಯಾಬ್ಸ್) ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ಅನ್ನು ತಾತ್ಕಾಲಿಕವಾಗಿ ಸಾಗಿಸುವ ವರ್ಗಾವಣೆ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ. 293AAV ಕೋಶಗಳ ವರ್ಗಾವಣೆ-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ಅಥವಾ Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) ಕೋಡಿಂಗ್ ಜೀನ್, ಹಾಗೆಯೇ AAV1 ಕ್ಯಾಪ್ಸಿಡ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮತ್ತು ಪರಿಕರ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕೋಡಿಂಗ್ ಕ್ಯಾಲ್ಸಿಯಂ ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಪ್ಯಾಕೇಜಿಂಗ್. ಕಚ್ಚಾ ವೈರಸ್ ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಒಣ ಐಸ್/ಎಥೆನಾಲ್ ಸ್ನಾನದಲ್ಲಿ ಫ್ರೀಜ್-ಥಾ ಚಕ್ರಗಳಿಂದ ಮತ್ತು ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬಫರ್ಡ್ ಸಲೈನ್ (PBS) ನಲ್ಲಿ ಲೈಸ್ಡ್ ಕೋಶಗಳಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ. AAV ವೆಕ್ಟರ್ ಅನ್ನು ನಿರಂತರ ಅಯೋಡಿಕ್ಸಾನಾಲ್ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಅಲ್ಟ್ರಾಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಗೇಶನ್ (32,000 rpm ಮತ್ತು 4°C ನಲ್ಲಿ 24 ಗಂಟೆಗಳು) ಮೂಲಕ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಅಮಿಕಾನ್ ಅಲ್ಟ್ರಾ-15 ಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಗೇಶನ್ ಫಿಲ್ಟರ್ ಬಳಸಿ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಲಾಯಿತು. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 ಜೀನೋಮ್ ನಕಲು (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX ನ ಜೀನೋಮ್ ಟೈಟರ್ ಅನ್ನು ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ (54), ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) ಮತ್ತು AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) ನಿಂದ ಅಳೆಯಲಾಯಿತು.
ಪ್ರಾಥಮಿಕ ನರಕೋಶಗಳನ್ನು ಐಸ್-ಕೋಲ್ಡ್ 1x PBS ನಲ್ಲಿ ಸ್ಕ್ರ್ಯಾಪ್ ಮಾಡಿ, ಪೆಲೆಟ್ ಮಾಡಿ, ನಂತರ ಫಾಸ್ಫೇಟೇಸ್ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟಿಯೇಸ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್ (ರೋಚೆ) ಹೊಂದಿರುವ 0.5% ಟ್ರೈಟಾನ್ X-100 / 0.5% ಸೋಡಿಯಂ ಡಿಯೋಕ್ಸಿಕೋಲೇಟ್/PBS ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಏಕರೂಪಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. ಬೈಸಿನ್‌ಕೋನಿನಿಕ್ ಆಸಿಡ್ ಅಸ್ಸೇ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಬಳಸಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು SDS-ಪಾಲಿಯಾಕ್ರಿಲಾಮೈಡ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಮೂಲಕ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಪಾಲಿವಿನೈಲಿಡಿನ್ ಫ್ಲೋರೈಡ್ ಮೆಂಬರೇನ್ (GE ಹೆಲ್ತ್‌ಕೇರ್) ಮೇಲೆ ಬ್ಲಾಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರ್ಬಂಧಿಸಿ ಮತ್ತು TBST (ಟ್ವೀನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಟ್ರಿಸ್-ಬಫರ್ಡ್ ಸಲೈನ್), ತೊಳೆಯುವ ಹಂತಗಳು ಮತ್ತು TBST ಇನ್‌ಕ್ಯುಬೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ ದ್ವಿತೀಯ ಪ್ರತಿಕಾಯದಲ್ಲಿ 5% ಹಾಲಿನಲ್ಲಿ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ (ವಿವರಗಳಿಗಾಗಿ ಟೇಬಲ್ S1 ನೋಡಿ) ಕಾವುಕೊಡಿ. +4°C ನಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಿ. ತೊಳೆಯುವ ನಂತರ, ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ದ್ವಿತೀಯ ಪ್ರತಿಕಾಯವನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಿ. ತರುವಾಯ, ಅದೇ ಬ್ಲಾಟ್ ಅನ್ನು ವಿರೋಧಿ-β-ಆಕ್ಟಿನ್ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡುವ ಮೂಲಕ, ಅದೇ ಲೋಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸಲಾಯಿತು. ಕೆಮಿಲುಮಿನಿಸೆನ್ಸ್‌ಗೆ ಪರಿವರ್ತಿಸುವ ಮತ್ತು ಕೆಮಿಲುಮಿನಿಸೆನ್ಸ್ ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪತ್ತೆ (ಜಿಇ ಹೆಲ್ತ್‌ಕೇರ್).
ಗಾಜಿನ ಕವರ್‌ಲಿಪ್‌ಗಳ ಮೇಲೆ ಈ ಹಿಂದೆ ಬೀಜಗಳನ್ನು ಹಾಕಲಾದ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಸಮಯದ ಹಂತದಲ್ಲಿ 4% ಪ್ಯಾರಾಫಾರ್ಮಲ್ಡಿಹೈಡ್ (PFA)/PBS ನೊಂದಿಗೆ ಸರಿಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಕವರ್‌ಲಿಪ್‌ಗಳನ್ನು ಮೊದಲು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 0.1% ಟ್ರೈಟಾನ್ X-100/PBS ನೊಂದಿಗೆ ವ್ಯಾಪಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ಬ್ಲಾಕಿಂಗ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ [3% ಗೋವಿನ ಸೀರಮ್ ಅಲ್ಬುಮಿನ್ (BSA)/PBS] ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಎರಡನೇ ದಿನ, ಕವರ್‌ಲಿಪ್‌ಗಳನ್ನು ಬ್ಲಾಕಿಂಗ್ ಬಫರ್‌ನಿಂದ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಸೂಕ್ತವಾದ ಫ್ಲೋರೋಫೋರ್-ಸಂಯೋಜಿತ ದ್ವಿತೀಯಕ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ; ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಮಾದರಿಗಳನ್ನು PBS ನಲ್ಲಿ 4′,6-ಡಯಾಮಿಡಿನೋ-2 -ಫೆನಿಲಿಂಡೋಲ್ (DAPI) ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ಅಕ್ವಾ-ಪಾಲಿ/ಮೌಂಟ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್ ಸ್ಲೈಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಸರಿಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಗಂಡು ಮತ್ತು ಹೆಣ್ಣು ಇಲಿಗಳಿಗೆ (ಗಂಡು ಮತ್ತು ಹೆಣ್ಣು) ಕೆಟಮೈನ್ (130 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಕೆಜಿ) ಮತ್ತು ಕ್ಸೈಲಾಜಿನ್ (10 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಕೆಜಿ) ಇಂಟ್ರಾಪೆರಿಟೋನಿಯಲ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಮೂಲಕ ಅರಿವಳಿಕೆ ನೀಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕಾರ್ಪ್ರೊಫೆನ್ ನೋವು ನಿವಾರಕ (5 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಕೆಜಿ) ನೊಂದಿಗೆ ಸಬ್ಕ್ಯುಟೇನಿಯಸ್ ಆಗಿ ನೀಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಬೆಚ್ಚಗಿನ ಪ್ಯಾಡ್ ಹೊಂದಿದ ಸ್ಟೀರಿಯೊಟ್ಯಾಕ್ಟಿಕ್ ಉಪಕರಣದಲ್ಲಿ (ಕೋಪ್ಫ್) ಇರಿಸಲಾಯಿತು. ತಲೆಬುರುಡೆಯನ್ನು ಒಡ್ಡಿ ಮತ್ತು ಮಿಸ್ ಮೂಳೆಗೆ ಅನುಗುಣವಾದ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್‌ನ ಭಾಗವನ್ನು ತೆಳುಗೊಳಿಸಲು ದಂತ ಡ್ರಿಲ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ (ಲ್ಯಾಮ್ಡಾದಿಂದ: ಬಾಲ 1.8, ಲ್ಯಾಟರಲ್ 1, ಲೋಬ್ಯೂಲ್‌ಗಳು IV ಮತ್ತು V ಗೆ ಅನುರೂಪವಾಗಿದೆ). ಕೆಳಗಿನ ನಾಳೀಯ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸುವುದನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ತಲೆಬುರುಡೆಯಲ್ಲಿ ಸಣ್ಣ ರಂಧ್ರವನ್ನು ಎಚ್ಚರಿಕೆಯಿಂದ ರಚಿಸಲು ಬಾಗಿದ ಸಿರಿಂಜ್ ಸೂಜಿಯನ್ನು ಬಳಸಿ. ನಂತರ ತೆಳುವಾದ ಗಾಜಿನ ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿಯನ್ನು ನಿಧಾನವಾಗಿ ಮೈಕ್ರೋ-ಹೋಲ್‌ಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (ಡ್ಯೂರಾ ಮೇಟರ್‌ನ ವೆಂಟ್ರಲ್ ಬದಿಯಲ್ಲಿ -1.3 ರಿಂದ -1 ರವರೆಗೆ), ಮತ್ತು 200 ರಿಂದ 300 nl AAV ಅನ್ನು ಮೈಕ್ರೋ-ಇಂಜೆಕ್ಟರ್ (ನರಿಶಿಗೆ) ಗೆ ಹಸ್ತಚಾಲಿತ ಸಿರಿಂಜ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ (ನರಿಶಿಗೆ) 10 ರಿಂದ 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಅವಧಿಯಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ ಒತ್ತಡದಲ್ಲಿ ಹಲವಾರು ಬಾರಿ ಚುಚ್ಚಲಾಗುತ್ತದೆ. ಇನ್ಫ್ಯೂಷನ್ ನಂತರ, ವೈರಸ್ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಹರಡಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡಲು ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿಯನ್ನು ಇನ್ನೊಂದು 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಇರಿಸಿ. ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿಗಳನ್ನು ಹಿಂತೆಗೆದುಕೊಂಡ ನಂತರ, ಗಾಯದ ಉರಿಯೂತವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಮತ್ತು ಪ್ರಾಣಿ ಚೇತರಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಚರ್ಮವನ್ನು ಎಚ್ಚರಿಕೆಯಿಂದ ಹೊಲಿಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆಯ ನಂತರ ಹಲವಾರು ದಿನಗಳವರೆಗೆ ಪ್ರಾಣಿಗಳಿಗೆ ನೋವು ನಿವಾರಕಗಳು (ಕ್ಯಾಸ್ಪೊಫೆನ್) ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಲಾಯಿತು, ಆ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಅವುಗಳ ದೈಹಿಕ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಎಚ್ಚರಿಕೆಯಿಂದ ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಅವುಗಳನ್ನು ಹೇಳಲಾದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ದಯಾಮರಣಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. ಎಲ್ಲಾ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಯುರೋಪಿಯನ್, ರಾಷ್ಟ್ರೀಯ ಮತ್ತು ಸಾಂಸ್ಥಿಕ ಮಾರ್ಗಸೂಚಿಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಜರ್ಮನಿಯ ನಾರ್ತ್ ರೈನ್-ವೆಸ್ಟ್‌ಫಾಲಿಯಾದ ಉಮ್ವೆಲ್ಟ್ ಮತ್ತು ವರ್ಬ್ರಾಚರ್‌ಸ್ಚುಟ್ಜ್‌ನ ಲ್ಯಾಂಡೆಸಮ್ಟ್‌ಫರ್‌ನ್ಯಾಚುರ್ ಅನುಮೋದಿಸಿದರು.
ಪ್ರಾಣಿಗಳಿಗೆ ಕೆಟಮೈನ್ (100 mg/kg) ಮತ್ತು ಕ್ಸೈಲಾಜಿನ್ (10 mg/kg) ನೊಂದಿಗೆ ಅರಿವಳಿಕೆ ನೀಡಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಹೃದಯವನ್ನು ಮೊದಲು 0.1 M PBS ನೊಂದಿಗೆ ಮತ್ತು ನಂತರ PBS ನಲ್ಲಿ 4% PFA ನೊಂದಿಗೆ ಪರ್ಫ್ಯೂಸ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಅಂಗಾಂಶವನ್ನು ವಿಭಜಿಸಿ 4% PFA/PBS ನಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ 4°C ನಲ್ಲಿ ಸರಿಪಡಿಸಲಾಯಿತು. PBS ನಲ್ಲಿ ಸ್ಥಿರ ಮೆದುಳಿನಿಂದ ಸ್ಯಾಗಿಟ್ಟಲ್ ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು (50 μm ದಪ್ಪ) ತಯಾರಿಸಲು ಕಂಪಿಸುವ ಚಾಕುವನ್ನು (ಲೈಕಾ ಮೈಕ್ರೋಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್ GmbH, ವಿಯೆನ್ನಾ, ಆಸ್ಟ್ರಿಯಾ) ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಬೇರೆ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟಪಡಿಸದ ಹೊರತು, ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶ ಮತ್ತು ಸ್ಫೂರ್ತಿದಾಯಕದಲ್ಲಿ ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ (13) ಮುಕ್ತ-ತೇಲುವ ವಿಭಾಗಗಳ ಕಲೆಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, ಮೊದಲು, ಪಡೆದ ಚೂರುಗಳನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 0.5% ಟ್ರೈಟಾನ್ X-100/PBS ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರವೇಶಸಾಧ್ಯಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು; ಕೆಲವು ಎಪಿಟೋಪ್‌ಗಳಿಗೆ (Pcx ಮತ್ತು Shmt2), 80°C (PH 9) ನಲ್ಲಿ ಟ್ರಿಸ್-EDTA ಬಫರ್ ಮೂಲಕ ಈ ಹಂತದ ಬದಲಿಗೆ 25 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಚೂರುಗಳನ್ನು ಬಿಸಿ ಮಾಡಿ. ಮುಂದೆ, ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ 4°C ನಲ್ಲಿ ಬ್ಲಾಕಿಂಗ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ (3% BSA/PBS) ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ (ಟೇಬಲ್ S1 ನೋಡಿ) ಬೆರೆಸಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. ಮರುದಿನ, ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ಬ್ಲಾಕಿಂಗ್ ಬಫರ್‌ನಿಂದ ತೊಳೆದು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಸೂಕ್ತವಾದ ಫ್ಲೋರೋಫೋರ್-ಸಂಯೋಜಿತ ದ್ವಿತೀಯಕ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು; ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು PBS ನಲ್ಲಿ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ತೊಳೆದು, DAPI ಯೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತಿ-ಸ್ಟೇನ್ ಮಾಡಿ, ನಂತರ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್ ಸ್ಲೈಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಅಕ್ವಾಪಾಲಿಮೌಂಟ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸರಿಪಡಿಸಲಾಯಿತು.
ಮಾದರಿಯನ್ನು ಚಿತ್ರಿಸಲು ಬಿಳಿ ಬೆಳಕಿನ ಲೇಸರ್ ಮತ್ತು 405 ಡಯೋಡ್ ನೇರಳಾತೀತ ಲೇಸರ್ ಹೊಂದಿರುವ ಲೇಸರ್ ಸ್ಕ್ಯಾನಿಂಗ್ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್ (TCS SP8-X ಅಥವಾ TCS ಡಿಜಿಟಲ್ ಲೈಟ್ ಶೀಟ್, ಲೈಕಾ ಮೈಕ್ರೋಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಫ್ಲೋರೋಫೋರ್ ಅನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು ಹೈಬ್ರಿಡ್ ಡಿಟೆಕ್ಟರ್ (HyDs) ನೊಂದಿಗೆ ಸಿಗ್ನಲ್ ಅನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸುವ ಮೂಲಕ, LAS-X ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಅನ್ನು ಅನುಕ್ರಮ ಮೋಡ್‌ನಲ್ಲಿ ನೈಕ್ವಿಸ್ಟ್ ಮಾದರಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಜೋಡಿಸಲಾದ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲು ಬಳಸಲಾಯಿತು: ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕವಲ್ಲದ ಫಲಕಗಳಿಗೆ, ಇದು ಹೆಚ್ಚು ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಸಂಕೇತಗಳಾಗಿವೆ (ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಸೊಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು ಡೆಂಡ್ರೈಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ) mtYFP) BrightR ಮೋಡ್‌ನಲ್ಲಿ PN ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು HyD ಬಳಸಿ). ಹಿನ್ನೆಲೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು 0.3 ರಿಂದ 6 ns ವರೆಗಿನ ಗೇಟಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ವಿಂಗಡಿಸಲಾದ ಕೋಶಗಳ ನೈಜ-ಸಮಯದ ಚಿತ್ರಣ. 1% B27 ಪೂರಕ ಮತ್ತು 0.5 mM ಗ್ಲುಟಾಮ್ಯಾಕ್ಸ್ ಹೊಂದಿರುವ ನ್ಯೂರೋಬಾಸಲ್-ಎ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ವಿಂಗಡಿಸಿದ ನಂತರ, ಕೋಶಗಳನ್ನು ತಕ್ಷಣವೇ ಪಾಲಿ-ಎಲ್-ಲೈಸಿನ್-ಲೇಪಿತ ಗಾಜಿನ ಸ್ಲೈಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ (μ-ಸ್ಲೈಡ್8 ವೆಲ್, ಇಬಿಡಿ, ಕ್ಯಾಟಲಾಗ್ ಸಂಖ್ಯೆ 80826) ಬೀಜಗಳಾಗಿ ವಿಂಗಡಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ ಕೋಶಗಳು ನೆಲೆಗೊಳ್ಳಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡಲು ಅದನ್ನು 37°C ಮತ್ತು 5% CO2 ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ ಇರಿಸಿ. ಬಿಳಿ ಲೇಸರ್, HyD, 63×[1.4 ಸಂಖ್ಯಾತ್ಮಕ ದ್ಯುತಿರಂಧ್ರ (NA)] ತೈಲ ವಸ್ತುನಿಷ್ಠ ಮಸೂರ ಮತ್ತು ತಾಪನ ಹಂತವನ್ನು ಹೊಂದಿದ ಲೈಕಾ SP8 ಲೇಸರ್ ಸ್ಕ್ಯಾನಿಂಗ್ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್‌ನಲ್ಲಿ ನೈಜ-ಸಮಯದ ಚಿತ್ರಣವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
ಇಲಿಯನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಇಂಗಾಲದ ಡೈಆಕ್ಸೈಡ್‌ನಿಂದ ಅರಿವಳಿಕೆ ಮಾಡಿ ಶಿರಚ್ಛೇದ ಮಾಡಲಾಯಿತು, ಮೆದುಳನ್ನು ತಲೆಬುರುಡೆಯಿಂದ ತ್ವರಿತವಾಗಿ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 200μm ದಪ್ಪ (13C ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಪ್ರಯೋಗಕ್ಕಾಗಿ) ಅಥವಾ 275μm ದಪ್ಪ (ಎರಡು ಫೋಟಾನ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗೆ) ಸ್ಯಾಗಿಟಲ್ ವಿಭಾಗವಾಗಿ ಈ ಕೆಳಗಿನ ವಸ್ತುಗಳಿಂದ ತುಂಬಿಸಲಾಯಿತು. ಐಸ್ ಕ್ರೀಮ್ (HM-650 V, ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, ವಾಲ್‌ಡಾರ್ಫ್, ಜರ್ಮನಿ) ಈ ಕೆಳಗಿನ ವಸ್ತುಗಳಿಂದ ತುಂಬಿದೆ: 125 mM ಐಸ್-ಕೋಲ್ಡ್, ಕಾರ್ಬನ್-ಸ್ಯಾಚುರೇಟೆಡ್ (95% O2 ಮತ್ತು 5% CO2) ಕಡಿಮೆ Ca2 + ಕೃತಕ ಸೆರೆಬ್ರೊಸ್ಪೈನಲ್ ದ್ರವ (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ಸೋಡಿಯಂ ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬಫರ್, 25 mM NaHCO3, 25 mM ಗ್ಲೂಕೋಸ್, 0.5 mM CaCl2 ಮತ್ತು 3.5 mM MgCl2 (310 ರಿಂದ 330 mmol ವರೆಗಿನ ಆಸ್ಮೋಟಿಕ್ ಒತ್ತಡ). ಪಡೆದ ಮೆದುಳಿನ ಚೂರುಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿನ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ಸೋಡಿಯಂ ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬಫರ್, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ಗ್ಲೂಕೋಸ್, 1.0 mM CaCl2 ಮತ್ತು 2.0 mM MgCl2) ಮಧ್ಯಮ) pH 7.4 ಮತ್ತು 310 ರಿಂದ 320 mmol) ಹೊಂದಿರುವ ಪೂರ್ವ-ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಶನ್ ಕೋಣೆಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ.
ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಸ್ಲೈಸ್‌ಗಳನ್ನು ಮೀಸಲಾದ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಕೋಣೆಗೆ ಸ್ಥಳಾಂತರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು 32° ರಿಂದ 33°C ವರೆಗಿನ ಸ್ಥಿರ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ನಿರಂತರ ACSF ಪರ್ಫ್ಯೂಷನ್ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಲೈಕಾ 25x ಆಬ್ಜೆಕ್ಟಿವ್ ಲೆನ್ಸ್ (NA 0.95, ನೀರು), Ti: ನೀಲಮಣಿ ಲೇಸರ್ (ಗೋಸುಂಬೆ ವಿಷನ್ II, ಕೊಹೆರೆಂಟ್) ಹೊಂದಿದ ಮಲ್ಟಿಫೋಟಾನ್ ಲೇಸರ್ ಸ್ಕ್ಯಾನಿಂಗ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್ (TCS SP8 MP-OPO, ಲೈಕಾ ಮೈಕ್ರೋಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್) ಅನ್ನು ಸ್ಲೈಸ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು. FLIM ಮಾಡ್ಯೂಲ್ (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2 ನ FLIM. PN ಗಳ ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ರೆಡಾಕ್ಸ್ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಸಗಿಟ್ಟಲ್ ಮೆದುಳಿನ ಸ್ಲೈಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಎರಡು-ಫೋಟಾನ್ FLIM ನಿಂದ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ, ಅಲ್ಲಿ Grx1-roGFP2 ಬಯೋಸೆನ್ಸರ್ PN ಗಳನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿರಿಸಿಕೊಂಡಿದೆ. PN ಪದರದಲ್ಲಿ, ಸ್ವಾಧೀನ ಕ್ಷೇತ್ರವನ್ನು ಸ್ಲೈಸ್ ಮೇಲ್ಮೈಯಿಂದ ಸುಮಾರು 50 ರಿಂದ 80 μm ಕೆಳಗೆ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯವಾದ PN (ಅಂದರೆ, ಮಣಿಗಳಿಂದ ಕೂಡಿದ ರಚನೆಯ ಕೊರತೆ ಅಥವಾ ಡೆಂಡ್ರೈಟ್‌ಗಳ ಉದ್ದಕ್ಕೂ ನರಕೋಶದ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ಬದಲಾವಣೆಗಳು) ಮತ್ತು ಡಬಲ್ ಪಾಸಿಟಿವ್ roGFP2 ಸಂವೇದಕ ಮತ್ತು AAV ಎನ್‌ಕೋಡಿಂಗ್ shRNA PCx ಅಥವಾ ಅದರ ನಿಯಂತ್ರಣ ಅನುಕ್ರಮ (ಪ್ರತಿಯೊಂದೂ mCherry ಅನ್ನು ಸಹ-ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುತ್ತದೆ) ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು. 2x ಡಿಜಿಟಲ್ ಜೂಮ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಏಕ-ಸ್ಟ್ಯಾಕ್ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ [ಪ್ರಚೋದನಾ ತರಂಗಾಂತರ: 890 nm; 512 nm 512 ಪಿಕ್ಸೆಲ್‌ಗಳು]. ಪತ್ತೆ: ಆಂತರಿಕ ಹೈಡ್ರೋಡೈಡ್, ಫ್ಲೋರೊಸೆಸಿನ್ ಐಸೊಥಿಯೊಸೈನೇಟ್ (FITC) ಫಿಲ್ಟರ್ ಗುಂಪು] ಮತ್ತು 2 ರಿಂದ 3 ನಿಮಿಷಗಳ ಒಳಗೆ ಸರಾಸರಿ ಚಿತ್ರವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸಾಕಷ್ಟು ಫೋಟಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ (ಒಟ್ಟು 1000 ಫೋಟಾನ್‌ಗಳು) ಕರ್ವ್ ಫಿಟ್ಟಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪರ್ಫ್ಯೂಷನ್ ACSF ಗೆ ಬಾಹ್ಯ 10 mM H2O2 ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವಾಗ (ಆಕ್ಸಿಡೀಕರಣವನ್ನು ಗರಿಷ್ಠಗೊಳಿಸಲು, ಜೀವಿತಾವಧಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು) ಮತ್ತು ನಂತರ 2 mM ಡೈಥಿಯೊಥ್ರೈಟಾಲ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವಾಗ (ಕಡಿತದ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಜೀವಿತಾವಧಿಯಲ್ಲಿ ಇಳಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ) roGFP2 ನ ಜೀವಿತಾವಧಿಯ ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ Grx1-roGFP2 ತನಿಖೆಯ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆ ಮತ್ತು FLIM ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳ ಪರಿಶೀಲನೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು (ಚಿತ್ರ S8, D ನಿಂದ G ಗೆ). ಪಡೆದ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು FLIMfit 5.1.1 ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಬಳಸಿ, ಸಂಪೂರ್ಣ ಚಿತ್ರದ ಏಕ ಘಾತೀಯ ಕೊಳೆಯುವ ವಕ್ರರೇಖೆಯನ್ನು ಅಳತೆ ಮಾಡಿದ IRF (ಇನ್‌ಸ್ಟ್ರುಮೆಂಟ್ ರೆಸ್ಪಾನ್ಸ್ ಫಂಕ್ಷನ್) ಗೆ ಹೊಂದಿಸಿ, ಮತ್ತು χ2 ಸರಿಸುಮಾರು 1 ಆಗಿದೆ. ಒಂದೇ PN ನ ಜೀವಿತಾವಧಿಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಲು, ನರ ದೇಹದ ಸುತ್ತಲಿನ ಮುಖವಾಡವನ್ನು ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ಎಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಮುಖವಾಡದಲ್ಲಿನ ಸರಾಸರಿ ಜೀವಿತಾವಧಿಯನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಸಂಭಾವ್ಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. ತೀವ್ರ ವಿಭಾಗವನ್ನು ಪರ್ಫ್ಯೂಸ್ಡ್ ACSF ಗೆ ನೇರವಾಗಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಸೇರಿಸಿದ 100 nM TMRM ನೊಂದಿಗೆ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಿದ ನಂತರ, PN ಗಳ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಸಂಭಾವ್ಯ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಎರಡು-ಫೋಟಾನ್ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕದಿಂದ ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. TMRM ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಅನ್ನು 920 nm ನಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಬ್ ಅನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು ಸಂಕೇತಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲು ಆಂತರಿಕ HyD (ಟೆಟ್ರಾಮೆಥೈಲ್ರೋಡಮೈನ್ ಐಸೊಥಿಯೊಸೈನೇಟ್: 585/40 nm) ಬಳಸಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು; ಅದೇ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ತರಂಗಾಂತರವನ್ನು ಬಳಸುವ ಮೂಲಕ ಆದರೆ mtYFP ಅನ್ನು ಚಿತ್ರಿಸಲು ವಿಭಿನ್ನ ಆಂತರಿಕ HyD (FITC :525/50) ಅನ್ನು ಬಳಸುವ ಮೂಲಕ. ಏಕ ಕೋಶ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಸಂಭಾವ್ಯತೆಯನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲು ಇಮೇಜ್‌ಜೆಯ ಇಮೇಜ್ ಕ್ಯಾಲ್ಕುಲೇಟರ್ ಪ್ಲಗ್-ಇನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಪ್ಲಗ್-ಇನ್ ಸಮೀಕರಣ: ಸಿಗ್ನಲ್ = ನಿಮಿಷ (mtYFP, TMRM) ಅನ್ನು ಅನುಗುಣವಾದ ಚಾನಲ್‌ನ ಏಕ-ಸ್ಟ್ಯಾಕ್ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಚಿತ್ರದಲ್ಲಿ ಪುರ್ಕಿಂಜೆ ಸೊಮಾಲಿಯಲ್ಲಿ TMRM ಸಿಗ್ನಲ್ ಅನ್ನು ತೋರಿಸುವ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ನಂತರ ಫಲಿತಾಂಶದ ಮಾಸ್ಕ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಪಿಕ್ಸೆಲ್ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ತೋರಿಸುವ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಭಾಗವನ್ನು ಪಡೆಯಲು mtYFP ಚಾನಲ್‌ನ ಅನುಗುಣವಾದ ಮಿತಿ ಸಿಂಗಲ್-ಸ್ಟ್ಯಾಕ್ ಚಿತ್ರದ ಮೇಲೆ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಚಿತ್ರವನ್ನು ಹ್ಯೂಜೆನ್ಸ್ ಪ್ರೊ (ಸೈಂಟಿಫಿಕ್ ವಾಲ್ಯೂಮ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್) ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಬಳಸಿ ವಿಘಟಿಸಲಾಗಿದೆ. ಟೈಲ್‌ಗಳ ಸ್ಕ್ಯಾನ್ ಮಾಡಿದ ಚಿತ್ರಗಳಿಗಾಗಿ, LAS-X ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಒದಗಿಸಿದ ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಹೊಲಿಗೆ ಅಲ್ಗಾರಿದಮ್ ಬಳಸಿ ಒಂದೇ ಟೈಲ್‌ನ ಮಾಂಟೇಜ್ ಅನ್ನು ತಯಾರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಚಿತ್ರದ ಮಾಪನಾಂಕ ನಿರ್ಣಯದ ನಂತರ, ಚಿತ್ರವನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗೊಳಿಸಲು ಮತ್ತು ಹೊಳಪು ಮತ್ತು ವ್ಯತಿರಿಕ್ತತೆಯನ್ನು ಏಕರೂಪವಾಗಿ ಹೊಂದಿಸಲು ಇಮೇಜ್‌ಜೆ ಮತ್ತು ಅಡೋಬ್ ಫೋಟೋಶಾಪ್ ಬಳಸಿ. ಗ್ರಾಫಿಕ್ ತಯಾರಿಕೆಗಾಗಿ ಅಡೋಬ್ ಇಲ್ಲಸ್ಟ್ರೇಟರ್ ಬಳಸಿ.
mtDNA ಫೋಕಸ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್ ಮೂಲಕ DNA ವಿರುದ್ಧ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ವಿಭಾಗಗಳಲ್ಲಿ mtDNA ಗಾಯಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಗುರಿ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಜೀವಕೋಶದ ದೇಹ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಜೀವಕೋಶದ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗಾಗಿ ರಚಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಆಯಾ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಮಲ್ಟಿ ಮೆಷರ್ ಪ್ಲಗ್-ಇನ್ (ಇಮೇಜ್‌ಜೆ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್) ಬಳಸಿ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗಿದೆ. ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಜೀವಕೋಶದ ದೇಹ ಪ್ರದೇಶದಿಂದ ಪರಮಾಣು ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಕಳೆಯಿರಿ. ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಮಿತಿ ಚಿತ್ರದ ಮೇಲೆ mtDNA ಅನ್ನು ಸೂಚಿಸುವ ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ DNA ಬಿಂದುಗಳನ್ನು ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತವಾಗಿ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲು Analyze Particles ಪ್ಲಗ್-ಇನ್ (ಇಮೇಜ್‌ಜೆ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪಡೆದ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು CTRL ಇಲಿಗಳ PN ಸರಾಸರಿಗೆ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಲಾಯಿತು. ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿ ಕೋಶಕ್ಕೆ ಸರಾಸರಿ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಸೈಡ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯಂತೆ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. ಏಕ ಕೋಶ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ PN ನಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲು ImageJ ನ ಇಮೇಜ್ ಕ್ಯಾಲ್ಕುಲೇಟರ್ ಪ್ಲಗ್-ಇನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಅನುಗುಣವಾದ ಚಾನಲ್‌ನ ಏಕ-ಪದರದ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಚಿತ್ರದಲ್ಲಿ, ಸಮೀಕರಣದ ಮೂಲಕ: ಸಿಗ್ನಲ್ = ನಿಮಿಷ (mtYFP, ಪ್ರತಿಕಾಯ), ಪುರ್ಕಿನಾದಲ್ಲಿ ಒಂದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರತಿಕಾಯಕ್ಕೆ ಇಮ್ಯುನೊರಿಯಾಕ್ಟಿವಿಟಿಯನ್ನು ತೋರಿಸುವ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಗುರುತಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ನಂತರ ಫಲಿತಾಂಶದ ಮುಖವಾಡದಲ್ಲಿರುವ ಪಿಕ್ಸೆಲ್ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಭಾಗವನ್ನು ಪಡೆಯಲು mtYFP ಚಾನಲ್‌ನ ಅನುಗುಣವಾದ ಮಿತಿ ಸಿಂಗಲ್-ಸ್ಟ್ಯಾಕ್ ಚಿತ್ರದ ಮೇಲೆ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಪುರ್ಕಿಂಜೆ ಕೋಶ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. ಇಮೇಜ್‌ಜೆಯ ಸೆಲ್ ಕೌಂಟರ್ ಪ್ಲಗ್-ಇನ್ ಅನ್ನು ಪುರ್ಕಿಂಜೆ ಕೋಶಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಎಣಿಸಿದ ಕೋಶಗಳು ಆಕ್ರಮಿಸಿಕೊಂಡಿರುವ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಉಂಗುರದ ಉದ್ದದಿಂದ ಭಾಗಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪುರ್ಕಿಂಜೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲು ಬಳಸಲಾಯಿತು.
ಮಾದರಿ ತಯಾರಿಕೆ ಮತ್ತು ಸಂಗ್ರಹಣೆ. ನಿಯಂತ್ರಣ ಗುಂಪು ಮತ್ತು Mfn2cKO ಇಲಿಗಳ ಮೆದುಳುಗಳನ್ನು 0.1 M ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬಫರ್ (PB) ನಲ್ಲಿ 2% PFA/2.5% ಗ್ಲುಟರಾಲ್ಡಿಹೈಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಸರಿಪಡಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ ಸಿಲಿಯೇಟ್‌ಗಳನ್ನು (ಲೈಕಾ ಮೈಕ್ರೋಸಿಸ್ಟಮ್ GmbH, ವಿಯೆನ್ನಾ, ಆಸ್ಟ್ರಿಯಾ) ಬಳಸಿ ಕರೋನಲ್ ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ತಯಾರಿಸಲಾಯಿತು (ದಪ್ಪ 50 ರಿಂದ 60 μm) ನಂತರ 1 ಗಂಟೆ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 1% os ಟೆಟ್ರಾಕ್ಸೈಡ್ ಮತ್ತು 1.5% ಪೊಟ್ಯಾಸಿಯಮ್ ಫೆರೋಸೈನೈಡ್‌ನಲ್ಲಿ PB ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಸರಿಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ಮೂರು ಬಾರಿ ಬಟ್ಟಿ ಇಳಿಸಿದ ನೀರಿನಿಂದ ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 1% ಯುರೇನಿಲ್ ಅಸಿಟೇಟ್ ಹೊಂದಿರುವ 70% ಎಥೆನಾಲ್‌ನಿಂದ ಕಲೆ ಹಾಕಲಾಯಿತು. ನಂತರ ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ಶ್ರೇಣೀಕೃತ ಆಲ್ಕೋಹಾಲ್‌ನಲ್ಲಿ ನಿರ್ಜಲೀಕರಣಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸಿಲಿಕಾನ್-ಲೇಪಿತ ಗಾಜಿನ ಸ್ಲೈಡ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ಡರ್ಕುಪನ್ ACM (ಅರಾಲ್ಡೈಟ್ ಎರಕಹೊಯ್ದ ರೆಸಿನ್ M) ಎಪಾಕ್ಸಿ ರಾಳ (ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ ಸೈನ್ಸಸ್, ಕ್ಯಾಟಲಾಗ್ ಸಂಖ್ಯೆ 14040) ನಲ್ಲಿ ಅಳವಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಅಂತಿಮವಾಗಿ 60 ° C ನಲ್ಲಿ 48 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಒಲೆಯಲ್ಲಿ ಪಾಲಿಮರೈಸ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಲೈಕಾ ಅಲ್ಟ್ರಾಕಟ್ (ಲೈಕಾ ಮೈಕ್ರೋಸಿಸ್ಟಮ್ ಜಿಎಂಬಿಹೆಚ್, ವಿಯೆನ್ನಾ, ಆಸ್ಟ್ರಿಯಾ) ನಲ್ಲಿ 50 ಎನ್ಎಂ ಅಲ್ಟ್ರಾಥಿನ್ ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ಕತ್ತರಿಸಿ ಪಾಲಿಸ್ಟೈರೀನ್ ಫಿಲ್ಮ್‌ನಿಂದ ಲೇಪಿತವಾದ 2×1 ಮಿಮೀ ತಾಮ್ರ ಸ್ಲಿಟ್ ಗ್ರಿಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಆರಿಸಲಾಯಿತು. ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು H2O ನಲ್ಲಿ 4% ಯುರೇನಿಲ್ ಅಸಿಟೇಟ್ ದ್ರಾವಣದಿಂದ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಲೆ ಹಾಕಲಾಯಿತು, H2O ನೊಂದಿಗೆ ಹಲವಾರು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು, ನಂತರ H2O ನಲ್ಲಿ ರೆನಾಲ್ಡ್ಸ್ ಸೀಸದ ಸಿಟ್ರೇಟ್ ಅನ್ನು 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ H2O ನೊಂದಿಗೆ ಹಲವಾರು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು. ಮೈಕ್ರೋಗ್ರಾಫ್‌ಗಳನ್ನು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮಿಷನ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್ ಫಿಲಿಪ್ಸ್ CM100 (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, ವಾಲ್ಥಮ್, MA, USA) ನೊಂದಿಗೆ TVIPS (ಟೈಟ್ಜ್ ವಿಡಿಯೋ ಮತ್ತು ಇಮೇಜ್ ಪ್ರೊಸೆಸಿಂಗ್ ಸಿಸ್ಟಮ್) ಟೆಮ್‌ಕ್ಯಾಮ್-F416 ಡಿಜಿಟಲ್ ಕ್ಯಾಮೆರಾ (TVIPS GmbH, ಗೌಟಿಂಗ್, USA) ಬಳಸಿ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಯಿತು. ಜರ್ಮನಿ).
AAV ಸೋಂಕಿಗೆ ಒಳಗಾದ ಇಲಿಗಳಿಗೆ, ಮೆದುಳನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸಿ 1 ಮಿಮೀ ದಪ್ಪದ ಸಗಿಟ್ಟಲ್ ವಿಭಾಗವಾಗಿ ಕತ್ತರಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು AAV-ಸೋಂಕಿತ ಉಂಗುರವನ್ನು (ಅಂದರೆ, mCherry ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವುದು) ಗುರುತಿಸಲು ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಮ್ ಅನ್ನು ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್ ಬಳಸಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು. AAV ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಕನಿಷ್ಠ ಎರಡು ಸತತ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಾರ್ ಉಂಗುರಗಳಲ್ಲಿ ಪುರ್ಕಿಂಜೆ ಕೋಶ ಪದರದ (ಅಂದರೆ ಬಹುತೇಕ ಸಂಪೂರ್ಣ ಪದರ) ಅತಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಡಕ್ಷನ್ ದಕ್ಷತೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುವ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. AAV-ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಡ್ಯೂಸ್ಡ್ ಲೂಪ್ ಅನ್ನು ರಾತ್ರಿಯ ನಂತರದ ಸ್ಥಿರೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ ಮೈಕ್ರೋಡಿಸೆಕ್ಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು (0.1 M ಕೋಕೋಟ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ 4% PFA ಮತ್ತು 2.5% ಗ್ಲುಟರಾಲ್ಡಿಹೈಡ್) ಮತ್ತು ಮತ್ತಷ್ಟು ಸಂಸ್ಕರಿಸಲಾಯಿತು. EPON ಎಂಬೆಡಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ, ಸ್ಥಿರ ಅಂಗಾಂಶವನ್ನು 0.1 M ಸೋಡಿಯಂ ಕೋಕೋಟ್ ಬಫರ್ (ಅಪ್ಲಿಕೆಮ್) ನಿಂದ ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 0.1 M ಸೋಡಿಯಂ ಕೋಕೋಟ್ ಬಫರ್ (ಅಪ್ಲಿಕೆಮ್) 4 ಗಂಟೆಗಳಲ್ಲಿ 2% OsO4 (os, ಸೈನ್ಸ್ ಸರ್ವೀಸಸ್; ಕ್ಯಾಕೊ) ನೊಂದಿಗೆ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು, ನಂತರ 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ತೊಳೆಯಿರಿ. 0.1 M ಕೋಕಾಮೈಡ್ ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ 3 ಬಾರಿ ಪುನರಾವರ್ತಿಸಿ. ತರುವಾಯ, ಅಂಗಾಂಶವನ್ನು ನಿರ್ಜಲೀಕರಣಗೊಳಿಸಲು ಪ್ರತಿ ಎಥೆನಾಲ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು 4°C ನಲ್ಲಿ 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲು ಈಥನಾಲ್‌ನ ಆರೋಹಣ ಸರಣಿಯನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಅಂಗಾಂಶವನ್ನು ಪ್ರೊಪಿಲೀನ್ ಆಕ್ಸೈಡ್‌ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 4°C ನಲ್ಲಿ EPON (ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) ನಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ತಾಜಾ EPON ನಲ್ಲಿ ಅಂಗಾಂಶವನ್ನು 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಇರಿಸಿ, ಮತ್ತು ನಂತರ ಅದನ್ನು 62°C ನಲ್ಲಿ 72 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಹುದುಗಿಸಿ. 70 nm ಅಲ್ಟ್ರಾಥಿನ್ ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ಕತ್ತರಿಸಲು ಅಲ್ಟ್ರಾಮೈಕ್ರೋಟೋಮ್ (ಲೈಕಾ ಮೈಕ್ರೋಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್, UC6) ಮತ್ತು ವಜ್ರದ ಚಾಕು (ಡಯಾಟೋಮ್, ಬೀಲ್, ಸ್ವಿಟ್ಜರ್‌ಲ್ಯಾಂಡ್) ಅನ್ನು ಬಳಸಿ, ಮತ್ತು 37°C ನಲ್ಲಿ 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 1.5% ಯುರೇನಿಲ್ ಅಸಿಟೇಟ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಕಲೆ ಹಾಕಿ, ಮತ್ತು 4 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಸೀಸದ ಸಿಟ್ರೇಟ್ ದ್ರಾವಣದೊಂದಿಗೆ ಕಲೆ ಹಾಕಿ. ಕ್ಯಾಮೆರಾ ಒನ್‌ವ್ಯೂ 4K 16-ಬಿಟ್ (ಗ್ಯಾಟನ್) ಮತ್ತು ಡಿಜಿಟಲ್‌ಮೈಕ್ರೋಗ್ರಾಫ್ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ (ಗ್ಯಾಟನ್) ಹೊಂದಿದ JEM-2100 ಪ್ಲಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮಿಷನ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್ (JEOL) ಬಳಸಿ ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್ ಮೈಕ್ರೋಗ್ರಾಫ್‌ಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಗಿದೆ. ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, 5000× ಅಥವಾ 10,000× ಡಿಜಿಟಲ್ ಜೂಮ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್ ಮೈಕ್ರೋಗ್ರಾಫ್‌ಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.
ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾದ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. ಎಲ್ಲಾ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳಿಗೆ, ಇಮೇಜ್‌ಜೆ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಬಳಸಿ ಡಿಜಿಟಲ್ ಚಿತ್ರಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾದ ಬಾಹ್ಯರೇಖೆಗಳನ್ನು ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ವಿವರಿಸಲಾಗಿದೆ. ವಿಭಿನ್ನ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ನಿಯತಾಂಕಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿ ಕೋಶದ ಒಟ್ಟು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸಂ ಪ್ರದೇಶದಿಂದ ಭಾಗಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪಡೆದ ಶೇಕಡಾವಾರು ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸಂ ಪ್ರದೇಶ = ಕೋಶ ಪ್ರದೇಶ-ಕೋಶ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್ ಪ್ರದೇಶ) × 100. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ದುಂಡನ್ನು ಸೂತ್ರದೊಂದಿಗೆ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ [4π (ಪ್ರದೇಶ/ಪರಿಧಿ 2)]. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಇಸ್ಟಾ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಮುಖ್ಯ ಆಕಾರಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಎರಡು ವರ್ಗಗಳಾಗಿ ("ಕೊಳವೆಯಾಕಾರದ" ಮತ್ತು "ಗುಳ್ಳೆ") ವಿಂಗಡಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಆಟೋಫಾಗೋಸೋಮ್/ಲೈಸೋಸೋಮ್ ಸಂಖ್ಯೆ ಮತ್ತು ಸಾಂದ್ರತೆಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. ಡಿಜಿಟಲ್ ಚಿತ್ರದಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಆಟೋಫಾಗೋಸೋಮ್/ಲೈಸೋಸೋಮ್‌ನ ಬಾಹ್ಯರೇಖೆಗಳನ್ನು ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ರೂಪಿಸಲು ಇಮೇಜ್‌ಜೆ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಬಳಸಿ. ಆಟೋಫಾಗೋಸೋಮ್/ಲೈಸೋಸೋಮ್ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಪ್ರತಿ ಕೋಶದ ಒಟ್ಟು ಆಟೋಫಾಗೋಸೋಮ್/ಲೈಸೋಸೋಮ್ ರಚನೆಯ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸಂ ಪ್ರದೇಶದಿಂದ (ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸಂ ಪ್ರದೇಶ=ಕೋಶ ಪ್ರದೇಶ-ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್ ಪ್ರದೇಶ)×100 ಭಾಗಿಸುವ ಮೂಲಕ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿದ ಶೇಕಡಾವಾರು ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಆಟೋಫಾಗೋಸೋಮ್/ಲೈಸೋಸೋಮ್‌ಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಒಟ್ಟು ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿ ಕೋಶಕ್ಕೆ ಆಟೋಫಾಗೋಸೋಮ್/ಲೈಸೋಸೋಮ್ ರಚನೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯಿಂದ (ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ಪ್ರದೇಶದ ಪರಿಭಾಷೆಯಲ್ಲಿ) ಭಾಗಿಸುವ ಮೂಲಕ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ (ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ಪ್ರದೇಶ = ಕೋಶ ಪ್ರದೇಶ-ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ಪ್ರದೇಶ).
ತೀವ್ರ ವಿಭಾಗೀಕರಣ ಮತ್ತು ಮಾದರಿ ತಯಾರಿಕೆಗಾಗಿ ಲೇಬಲಿಂಗ್. ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗಾಗಿ, ತೀವ್ರವಾದ ಮೆದುಳಿನ ಚೂರುಗಳನ್ನು ಪೂರ್ವ-ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಷನ್ ಕೋಣೆಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ, ಇದು ಸ್ಯಾಚುರೇಟೆಡ್ ಇಂಗಾಲ (95% O2 ಮತ್ತು 5% CO2), ಹೆಚ್ಚಿನ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ಸೋಡಿಯಂ ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬಫರ್, 25.0 mM NaHCO 3, 25.0 mM d-ಗ್ಲೂಕೋಸ್, 1.0 mM CaCl 2 ಮತ್ತು 2.0 mM MgCl 2, pH 7.4 ಮತ್ತು 310 ರಿಂದ 320 mOsm ಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ), ಇದರಲ್ಲಿ ಗ್ಲೂಕೋಸ್ 13 C 6- ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಪರ್ಯಾಯ (ಯೂರಿಸೊಟಾಪ್, ಕ್ಯಾಟಲಾಗ್ ಸಂಖ್ಯೆ CLM-1396). ಪೈರುವೇಟ್ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗಾಗಿ, ತೀವ್ರವಾದ ಮೆದುಳಿನ ಚೂರುಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿನ Ca2 + ACSF ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ಸೋಡಿಯಂ ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬಫರ್, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ಗ್ಲೂಕೋಸ್, 1.0 mM CaCl2 ಮತ್ತು 2.0mM MgCl2 ಸೇರಿಸಿ, pH 7.4 ಮತ್ತು 310 ರಿಂದ 320mOsm ಗೆ ಹೊಂದಿಸಿ), ಮತ್ತು 1mM 1-[1-13C] ಪೈರುವೇಟ್ (ಯೂರಿಸೊಟಾಪ್, ಕ್ಯಾಟಲಾಗ್ ಸಂಖ್ಯೆ CLM-1082) ಸೇರಿಸಿ. ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು 37°C ನಲ್ಲಿ 90 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಬೇಕು. ಪ್ರಯೋಗದ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ, ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು 75 mM ಅಮೋನಿಯಂ ಕಾರ್ಬೋನೇಟ್ ಹೊಂದಿರುವ ಜಲೀಯ ದ್ರಾವಣದಿಂದ (pH 7.4) ತ್ವರಿತವಾಗಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ 40:40:20 (v:v:v) ಅಸಿಟೋನಿಟ್ರೈಲ್ (ACN): ಮೀಥನಾಲ್: ನೀರು ನಲ್ಲಿ ಏಕರೂಪಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಟ್ಟ ನಂತರ, ಮಾದರಿಗಳನ್ನು 21,000 ಗ್ರಾಂನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 4 ° C ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ಸೂಪರ್ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಸ್ಪೀಡ್‌ವ್ಯಾಕ್ ಸಾಂದ್ರಕದಲ್ಲಿ ಒಣಗಿಸಲಾಯಿತು. ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಒಣಗಿದ ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ಉಂಡೆಯನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯವರೆಗೆ -80 ° C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು.
13 ಸಿ-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳ ಲಿಕ್ವಿಡ್ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿ-ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. ಲಿಕ್ವಿಡ್ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿ-ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ (LC-MS) ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ಪೆಲೆಟ್ ಅನ್ನು 75μl LC-MS ದರ್ಜೆಯ ನೀರಿನಲ್ಲಿ (ಹನಿವೆಲ್) ಮತ್ತೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. 4°C ನಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 21,000 ಗ್ರಾಂನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ನಂತರ, ಸ್ಪಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಸೂಪರ್ನೇಟಂಟ್‌ನ 20 μl ಅನ್ನು ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ಫ್ಲಕ್ಸ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ಬಳಸಲಾಯಿತು, ಆದರೆ ಉಳಿದ ಸಾರವನ್ನು ತಕ್ಷಣವೇ ಅಯಾನು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ಬಳಸಲಾಯಿತು (ಕೆಳಗೆ ನೋಡಿ). ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದ ಬೆಂಜಾಯ್ಲ್ ಕ್ಲೋರೈಡ್ ಉತ್ಪನ್ನ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ (55, 56) ಬಳಸಿ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಮೊದಲ ಹಂತದಲ್ಲಿ, 10μl 100 mM ಸೋಡಿಯಂ ಕಾರ್ಬೋನೇಟ್ (ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) ಅನ್ನು 20μl ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ಸಾರಕ್ಕೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ 10μl 2% ಬೆಂಜಾಯ್ಲ್ ಕ್ಲೋರೈಡ್ (ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) ಅನ್ನು LC ದರ್ಜೆಯ ACN ಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಸುಳಿಯುವಂತೆ ಮಾಡಿ ನಂತರ 21,000 ಗ್ರಾಂನಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 20°C ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ತೆರವುಗೊಳಿಸಿದ ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಶಂಕುವಿನಾಕಾರದ ಗಾಜಿನ ಒಳಸೇರಿಸುವಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ (200 μl ಪರಿಮಾಣ) 2 ಮಿಲಿ ಆಟೋಸ್ಯಾಂಪ್ಲರ್ ವೀಲ್‌ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ. Q-Exactive (QE)-HF (ಅಲ್ಟ್ರಾ ಹೈ ಫೀಲ್ಡ್ ಆರ್ಬಿಟ್ರಾಪ್) ಹೈ-ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ಪ್ರಿಸಿಶನ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಗೆ ಸಂಪರ್ಕಗೊಂಡಿರುವ ಅಕ್ವಿಟಿ ಐಕ್ಲಾಸ್ ಅಲ್ಟ್ರಾ-ಹೈ ಪರ್ಫಾರ್ಮೆನ್ಸ್ LC ಸಿಸ್ಟಮ್ (ವಾಟರ್ಸ್) ಬಳಸಿ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, 2μl ಉತ್ಪನ್ನ ಮಾದರಿಯನ್ನು 1.8μm ಕಣಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ 100×1.0 mm ಹೈ-ಸ್ಟ್ರೆಂತ್ ಸಿಲಿಕಾ T3 ಕಾಲಮ್ (ವಾಟರ್ಸ್) ಗೆ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು. ಹರಿವಿನ ಪ್ರಮಾಣ 100μl/ನಿಮಿಷ, ಮತ್ತು ಬಫರ್ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯು ಬಫರ್ A (10 mM ಅಮೋನಿಯಂ ಫಾರ್ಮೇಟ್ ಮತ್ತು ನೀರಿನಲ್ಲಿ 0.15% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲ) ಮತ್ತು ಬಫರ್ B (ACN) ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ. ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಈ ಕೆಳಗಿನಂತಿರುತ್ತದೆ: 0 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ 0%B; 0%B. 0 ರಿಂದ 0.1 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ 0 ರಿಂದ 15% B; 0.1 ರಿಂದ 0.5 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ 15 ರಿಂದ 17% B; 0.5 ರಿಂದ 14 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ 17 ರಿಂದ 55% B; 14 ರಿಂದ 14.5 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ 55 ರಿಂದ 70% B; 18 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ 14.5 ರಿಂದ 70 ರಿಂದ 100% B; 18 ರಿಂದ 19 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ 100% B; 19 ರಿಂದ 19.1 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ 100 ರಿಂದ 0% B; 19.1 ರಿಂದ 28 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ 0% B (55, 56). QE-HF ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ ಧನಾತ್ಮಕ ಅಯಾನೀಕರಣ ಮೋಡ್‌ನಲ್ಲಿ 50 ರಿಂದ 750 ರವರೆಗಿನ m/z (ದ್ರವ್ಯರಾಶಿ/ಚಾರ್ಜ್ ಅನುಪಾತ) ದ್ರವ್ಯರಾಶಿ ಶ್ರೇಣಿಯೊಂದಿಗೆ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ. ಅನ್ವಯಿಕ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ 60,000, ಮತ್ತು ಪಡೆದ ಗಳಿಕೆ ನಿಯಂತ್ರಣ (AGC) ಅಯಾನು ಗುರಿ 3×106, ಮತ್ತು ಗರಿಷ್ಠ ಅಯಾನು ಸಮಯ 100 ಮಿಲಿಸೆಕೆಂಡುಗಳು. ಬಿಸಿಮಾಡಿದ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಪ್ರೇ ಅಯಾನೀಕರಣ (ESI) ಮೂಲವು 3.5 kV ನ ಸ್ಪ್ರೇ ವೋಲ್ಟೇಜ್, 250°C ನ ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿ ತಾಪಮಾನ, 60 AU ನ ಕವಚದ ಗಾಳಿಯ ಹರಿವು (ಅನಿಯಂತ್ರಿತ ಘಟಕಗಳು) ಮತ್ತು 20 AU ನ ಸಹಾಯಕ ಗಾಳಿಯ ಹರಿವಿನಲ್ಲಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ. 250°C. S ಲೆನ್ಸ್ ಅನ್ನು 60 AU ಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ.
13C ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ ಸಾವಯವ ಆಮ್ಲಗಳ ಅಯಾನ್ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿ-MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. ಉಳಿದ ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ಅವಕ್ಷೇಪವನ್ನು (55μl) QE-HF ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಗೆ ಸಂಪರ್ಕಿಸಲಾದ ಡಯೋನೆಕ್ಸ್ ಅಯಾನ್ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿ ಸಿಸ್ಟಮ್ (ICS 5000+, ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಬಳಸಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, 5μl ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ಸಾರವನ್ನು HPLC (2 mm×250 mm, ಕಣ ಗಾತ್ರ 4μm, ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಹೊಂದಿದ ಡಯೋನೆಕ್ಸ್ ಅಯಾನ್ ಪ್ಯಾಕ್ AS11-HC ಕಾಲಮ್‌ಗೆ 1 ರ ಭರ್ತಿ ಅನುಪಾತದೊಂದಿಗೆ ಪುಶ್-ಇನ್ ಪಾರ್ಶಿಯಲ್ ಲೂಪ್ ಮೋಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು. ) ಡಯೋನೆಕ್ಸ್ ಅಯಾನ್ ಪ್ಯಾಕ್ AG11-HC ಗಾರ್ಡ್ ಕಾಲಮ್ (2 mm x 50 mm, 4μm, ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್). ಕಾಲಮ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು 30°C ನಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆಟೋಸ್ಯಾಂಪ್ಲರ್ ಅನ್ನು 6°C ಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ. ಎಲುಯೆಂಟ್ ಜನರೇಟರ್ ಮೂಲಕ ಪೊಟ್ಯಾಸಿಯಮ್ ಹೈಡ್ರಾಕ್ಸೈಡ್ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಡಿಯೋನೈಸ್ಡ್ ನೀರಿನಿಂದ ಒದಗಿಸಲಾದ ಪೊಟ್ಯಾಸಿಯಮ್ ಹೈಡ್ರಾಕ್ಸೈಡ್ ಕಾರ್ಟ್ರಿಡ್ಜ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ. 380μl/ನಿಮಿಷದ ಹರಿವಿನ ದರದಲ್ಲಿ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸುವುದು, ಈ ಕೆಳಗಿನ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಅನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸುತ್ತದೆ: 0 ರಿಂದ 3 ನಿಮಿಷಗಳು, 10 mM KOH; 3 ರಿಂದ 12 ನಿಮಿಷಗಳು, 10 ರಿಂದ 50 mM KOH; 12 ರಿಂದ 19 ನಿಮಿಷಗಳು, 50 ರಿಂದ 100 mM KOH; 19 ರಿಂದ 21 ನಿಮಿಷಗಳು, 100 mM KOH; 21 ರಿಂದ 21.5 ನಿಮಿಷಗಳು, 100 ರಿಂದ 10 mM KOH. ಕಾಲಮ್ ಅನ್ನು 8.5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 10 mM KOH ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಮರು-ಸಮತೋಲನಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು.
ಕಾಲಮ್ ನಂತರ ಎಲ್ಯೂಟೆಡ್ ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್‌ಗಳನ್ನು 150μl/ನಿಮಿಷ ಐಸೊಪ್ರೊಪನಾಲ್ ಪೂರಕ ಸ್ಟ್ರೀಮ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ಋಣಾತ್ಮಕ ಅಯಾನೀಕರಣ ಕ್ರಮದಲ್ಲಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುವ ಹೆಚ್ಚಿನ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್‌ಗೆ ನಿರ್ದೇಶಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. MS 60,000 ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್‌ನೊಂದಿಗೆ m/z 50 ರಿಂದ 750 ವರೆಗಿನ ದ್ರವ್ಯರಾಶಿ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯನ್ನು ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡುತ್ತಿದೆ. AGC ಅನ್ನು 1×106 ಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಗರಿಷ್ಠ ಅಯಾನು ಸಮಯವನ್ನು 100 ms ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಬಿಸಿಮಾಡಿದ ESI ಮೂಲವನ್ನು 3.5 kV ಸ್ಪ್ರೇ ವೋಲ್ಟೇಜ್‌ನಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಗಿದೆ. ಅಯಾನು ಮೂಲದ ಇತರ ಸೆಟ್ಟಿಂಗ್‌ಗಳು ಈ ಕೆಳಗಿನಂತಿವೆ: ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿ ತಾಪಮಾನ 275°C; ಪೊರೆ ಅನಿಲ ಹರಿವು, 60 AU; ಸಹಾಯಕ ಅನಿಲ ಹರಿವು, 300°C ನಲ್ಲಿ 20 AU, ಮತ್ತು S ಲೆನ್ಸ್ ಸೆಟ್ಟಿಂಗ್ 60 AU ಗೆ.
13C ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್‌ಗಳ ಡೇಟಾ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. ಐಸೊಟೋಪ್ ಅನುಪಾತದ ಡೇಟಾ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಟ್ರೇಸ್‌ಫೈಂಡರ್ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ (ಆವೃತ್ತಿ 4.2, ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಬಳಸಿ. ಪ್ರತಿ ಸಂಯುಕ್ತದ ಗುರುತನ್ನು ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹ ಉಲ್ಲೇಖ ಸಂಯುಕ್ತದಿಂದ ಪರಿಶೀಲಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಸ್ವತಂತ್ರವಾಗಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಐಸೊಟೋಪ್ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು, ಪ್ರತಿ 13C ಐಸೊಟೋಪ್ (Mn) ನ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಅಯಾನ್ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಾಮ್ (XIC) ಪ್ರದೇಶವನ್ನು [M + H] + ನಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಗಿದೆ, ಇಲ್ಲಿ n ಎಂಬುದು ಗುರಿ ಸಂಯುಕ್ತದ ಕಾರ್ಬನ್ ಸಂಖ್ಯೆ, ಇದನ್ನು ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಅಥವಾ [MH] + ಅನ್ನು ಅಯಾನುಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. XIC ಯ ದ್ರವ್ಯರಾಶಿ ನಿಖರತೆಯು ಮಿಲಿಯನ್‌ಗೆ ಐದು ಭಾಗಗಳಿಗಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು RT ಯ ನಿಖರತೆಯು 0.05 ನಿಮಿಷಗಳು. ಪತ್ತೆಯಾದ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಐಸೊಟೋಪ್‌ನ ಅನುಪಾತವನ್ನು ಅನುಗುಣವಾದ ಸಂಯುಕ್ತದ ಎಲ್ಲಾ ಐಸೊಟೋಪ್‌ಗಳ ಮೊತ್ತಕ್ಕೆ ಲೆಕ್ಕಹಾಕುವ ಮೂಲಕ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಈ ಅನುಪಾತಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿ ಐಸೊಟೋಪ್‌ಗೆ ಶೇಕಡಾವಾರು ಮೌಲ್ಯಗಳಾಗಿ ನೀಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಮೋಲಾರ್ ಶೇಕಡಾ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ (MPE) ಎಂದು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (42).
ಹೆಪ್ಪುಗಟ್ಟಿದ ನರಕೋಶದ ಉಂಡೆಯನ್ನು 80% ಮೆಥನಾಲ್ (v/v) ನಲ್ಲಿ ಏಕರೂಪಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, ಸುಳಿಯಾಗಿಸಿ, -20°C ನಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. ಮಾದರಿಯನ್ನು ಮತ್ತೆ ಸುಳಿಯಾಗಿಸಿ ಮತ್ತು +4°C ನಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಬೆರೆಸಿ. ಮಾದರಿಯನ್ನು 21,000 ಗ್ರಾಂ ನಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 4°C ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಸೂಪರ್ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ ನಂತರದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ 25°C ನಲ್ಲಿ ಸ್ಪೀಡ್‌ವ್ಯಾಕ್ ಸಾಂದ್ರಕವನ್ನು ಬಳಸಿ ಒಣಗಿಸಲಾಯಿತು. ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ, ವಿಂಗಡಿಸಲಾದ ಕೋಶಗಳ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳ ಮೇಲೆ LC-MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಟ್ರೇಸ್‌ಫೈಂಡರ್ (ಆವೃತ್ತಿ 4.2, ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಬಳಸಿ, ಪ್ರತಿ ಸಂಯುಕ್ತದ ಮೊನೊಐಸೊಟೋಪಿಕ್ ದ್ರವ್ಯರಾಶಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಡೇಟಾ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರಿಪ್ರೊಸೆಸ್ ಕೋರ್ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಪ್ಯಾಕೇಜ್ (57) ಬಳಸಿ ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ಡೇಟಾದ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಣವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
ಸ್ಲೈಸ್ ತಯಾರಿಕೆ. ಇಲಿಯನ್ನು ಕಾರ್ಬನ್ ಡೈಆಕ್ಸೈಡ್‌ನಿಂದ ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಅರಿವಳಿಕೆ ಮಾಡಿ ಶಿರಚ್ಛೇದ ಮಾಡಲಾಯಿತು, ಮೆದುಳನ್ನು ತಲೆಬುರುಡೆಯಿಂದ ತ್ವರಿತವಾಗಿ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಐಸ್ ತುಂಬಿದ ಕಂಪಿಸುವ ಚಾಕುವನ್ನು (HM-650 V, ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, ವಾಲ್‌ಡಾರ್ಫ್, ಜರ್ಮನಿ) ಬಳಸಿ ಅದನ್ನು 300 ರಿಂದ 375 μm ಸ್ಯಾಗಿಟಲ್ ವಿಭಾಗಗಳಾಗಿ ಕತ್ತರಿಸಲಾಯಿತು. ಕೋಲ್ಡ್ ಕಾರ್ಬನ್ ಅನಿಲೀಕರಣ (95% O2 ಮತ್ತು 5% CO2) ಕಡಿಮೆ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ಸೋಡಿಯಂ ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬಫರ್, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ಗ್ಲೂಕೋಸ್, 1.0 mM CaCl2 ಮತ್ತು 6.0 mM MgCl2 pH 7.4 ಮತ್ತು 310 ರಿಂದ 330 mOsm ಗೆ ಹೊಂದಿಸಿ). ಪಡೆದ ಮೆದುಳಿನ ಚೂರುಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿನ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ಸೋಡಿಯಂ ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬಫರ್, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ಗ್ಲೂಕೋಸ್, 4.0 mM CaCl2 ಮತ್ತು mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 ಮತ್ತು 310 ರಿಂದ 320 mOsm) ಹೊಂದಿರುವ ಕೋಣೆಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ. ಚೂರುಗಳನ್ನು 20 ರಿಂದ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ ಇದರಿಂದ ಅವುಗಳನ್ನು ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ಮಾಡುವ ಮೊದಲು ಪುನಃಸ್ಥಾಪಿಸಬಹುದು.
ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್. ಎಲ್ಲಾ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್‌ಗಳಿಗೆ ಸ್ಥಿರ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ಚೇಂಬರ್ ಮತ್ತು 20x ನೀರಿನ ಇಮ್ಮರ್ಶನ್ ಆಬ್ಜೆಟಿವ್ ಲೆನ್ಸ್ (ಸೈಂಟಿಫಿಕಾ) ಹೊಂದಿರುವ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕ ಹಂತವನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಪುರ್ಕಿಂಜೆ ಕೋಶಗಳನ್ನು (i) ದೇಹದ ಗಾತ್ರ, (ii) ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಮ್‌ನ ಅಂಗರಚನಾ ಸ್ಥಳ ಮತ್ತು (iii) ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ mtYFP ರಿಪೋರ್ಟರ್ ಜೀನ್‌ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಿಂದ ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ. 5 ರಿಂದ 11 ಮೆಗಾಹ್ಮ್‌ಗಳ ತುದಿ ಪ್ರತಿರೋಧವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಪ್ಯಾಚ್ ಪೈಪೆಟ್ ಅನ್ನು ಬೊರೊಸಿಲಿಕೇಟ್ ಗಾಜಿನ ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿ (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, ಸೈನ್ಸ್ ಪ್ರಾಡಕ್ಟ್ಸ್, ಹಾಫ್‌ಹೀಮ್, ಜರ್ಮನಿ) ಮತ್ತು ಸಮತಲ ಪೈಪೆಟ್ ಇನ್ಸ್ಟ್ರುಮೆಂಟ್ಸ್ (P-1000, ಸಟರ್), ನೊವಾಟೊ, CA) ಮೂಲಕ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ಎಲ್ಲಾ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್‌ಗಳನ್ನು ELC-03XS npi ಪ್ಯಾಚ್ ಕ್ಲಾಂಪ್ ಆಂಪ್ಲಿಫಯರ್ (npi ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನಿಕ್ GmbH, Tam, ಜರ್ಮನಿ) ನಿರ್ವಹಿಸಿತು, ಇದನ್ನು ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಸಿಗ್ನಲ್ (ಆವೃತ್ತಿ 6.0, ಕೇಂಬ್ರಿಡ್ಜ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನಿಕ್, ಕೇಂಬ್ರಿಡ್ಜ್, ಯುಕೆ) ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ. ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು 12.5 kHz ಮಾದರಿ ದರದಲ್ಲಿ ದಾಖಲಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸಿಗ್ನಲ್ ಅನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ 1.3 ಮತ್ತು 10 kHz ಕಟ್‌ಆಫ್ ಆವರ್ತನಗಳೊಂದಿಗೆ ಎರಡು ಶಾರ್ಟ್-ಪಾಸ್ ಬೆಸೆಲ್ ಫಿಲ್ಟರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮೆಂಬರೇನ್ ಮತ್ತು ಪೈಪೆಟ್‌ನ ಕೆಪಾಸಿಟನ್ಸ್ ಅನ್ನು ಆಂಪ್ಲಿಫೈಯರ್ ಬಳಸಿ ಪರಿಹಾರ ಸರ್ಕ್ಯೂಟ್‌ನಿಂದ ಸರಿದೂಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಓರ್ಕಾ-ಫ್ಲ್ಯಾಶ್ 4.0 ಕ್ಯಾಮೆರಾದ (ಹಮಾಮಟ್ಸು, ಗೆರ್ಡೆನ್, ಜರ್ಮನಿ) ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು, ಇದನ್ನು ಹೊಕಾವೊ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ (ಆವೃತ್ತಿ 2.8, ಹಮಾಮಟ್ಸು, ಗೆರ್ಡೆನ್, ಜರ್ಮನಿ) ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ.
ದಿನನಿತ್ಯದ ಪೂರ್ಣ-ಕೋಶ ಸಂರಚನೆ ಮತ್ತು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ಮಾಡುವ ಮೊದಲು, ಈ ಕೆಳಗಿನ ಪದಾರ್ಥಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಆಂತರಿಕ ದ್ರಾವಣದಿಂದ ಪೈಪೆಟ್ ಅನ್ನು ತುಂಬಿಸಿ: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM ಪೊಟ್ಯಾಸಿಯಮ್ ಗ್ಲುಕೋನೇಟ್, 10.0 mM ಹೆಪ್ಸ್, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM ಗ್ವಾನೋಸಿನ್ ಟ್ರೈಫಾಸ್ಫೇಟ್ (GTP) (Na) ಮತ್ತು 10.0 mM ಕ್ರಿಯೇಟಿನೈನ್ ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಅನ್ನು pH 7.25 ಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಆಸ್ಮೋಟಿಕ್ ಒತ್ತಡವು 290 mOsm (ಸುಕ್ರೋಸ್) ಆಗಿತ್ತು. ಪೊರೆಯನ್ನು ಛಿದ್ರಗೊಳಿಸಲು 0 pA ಬಲವನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಿದ ತಕ್ಷಣ, ವಿಶ್ರಾಂತಿ ಪೊರೆಯ ವಿಭವವನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. -40, -30, -20, ಮತ್ತು -10 pA ನ ಹೈಪರ್ಪೋಲರೈಸ್ಡ್ ಪ್ರವಾಹಗಳನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸುವ ಮೂಲಕ ಇನ್ಪುಟ್ ಪ್ರತಿರೋಧವನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ವೋಲ್ಟೇಜ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಅಳೆಯಿರಿ ಮತ್ತು ಇನ್ಪುಟ್ ಪ್ರತಿರೋಧವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲು ಓಮ್ನ ನಿಯಮವನ್ನು ಬಳಸಿ. ವೋಲ್ಟೇಜ್ ಕ್ಲಾಂಪ್‌ನಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ದಾಖಲಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು sPSC ಅನ್ನು ಅರೆ-ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆ ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಬಳಸಿ ಇಗೋರ್ ಪ್ರೊ (ಆವೃತ್ತಿ 32 7.01, ವೇವ್‌ಮೆಟ್ರಿಕ್ಸ್, ಲೇಕ್ ಓಸ್ವೆಗೊ, ಒರೆಗಾನ್, USA) ನಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಿ ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. IV ಕರ್ವ್ ಮತ್ತು ಸ್ಥಿರ-ಸ್ಥಿತಿಯ ಪ್ರವಾಹವನ್ನು ಬ್ಯಾಟರಿಯನ್ನು ವಿಭಿನ್ನ ವಿಭವಗಳಲ್ಲಿ (-110 mV ನಿಂದ ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿ) ಕ್ಲ್ಯಾಂಪ್ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು 5 mV ಹಂತಗಳಲ್ಲಿ ವೋಲ್ಟೇಜ್ ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುವ ಮೂಲಕ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ಡಿಪೋಲರೈಸಿಂಗ್ ಕರೆಂಟ್ ಅನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸುವ ಮೂಲಕ AP ಉತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು. ಡಿಪೋಲರೈಸಿಂಗ್ ಕರೆಂಟ್ ಪಲ್ಸ್ ಅನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸುವಾಗ -70 mV ನಲ್ಲಿ ಕೋಶವನ್ನು ಕ್ಲ್ಯಾಂಪ್ ಮಾಡಿ. ಪ್ರತಿ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ಯೂನಿಟ್‌ನ ಹಂತದ ಗಾತ್ರವನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಹೊಂದಿಸಿ (10 ರಿಂದ 60 pA). ಅತ್ಯಧಿಕ AP ಆವರ್ತನಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುವ ಪಲ್ಸ್ ಸ್ಪೈಕ್‌ಗಳನ್ನು ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ಎಣಿಸುವ ಮೂಲಕ ಗರಿಷ್ಠ AP ಆವರ್ತನವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿ. ಮೊದಲು ಒಂದು ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ AP ಗಳನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸುವ ಡಿಪೋಲರೈಸೇಶನ್ ಪಲ್ಸ್‌ನ ಎರಡನೇ ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು AP ಮಿತಿಯನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ರಂಧ್ರವಿರುವ ಪ್ಯಾಚ್ ಸಂರಚನೆ ಮತ್ತು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. ಪ್ರಮಾಣಿತ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ರಂಧ್ರವಿರುವ ಪ್ಯಾಚ್ ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿ. ಈ ಕೆಳಗಿನ ಪದಾರ್ಥಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರದ ATP- ಮತ್ತು GTP-ಮುಕ್ತ ಪೈಪೆಟ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ: 128 mM ಗ್ಲುಕೋನೇಟ್ K, 10 mM KCl, 10 mM ಹೆಪ್ಸ್, 0.1 mM EGTA ಮತ್ತು 2 mM MgCl2, ಮತ್ತು pH 7.2 ಗೆ ಹೊಂದಿಸಿ (KOH ಬಳಸಿ). ಜೀವಕೋಶ ಪೊರೆಯ ಅನಿಯಂತ್ರಿತ ಪ್ರವೇಶಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟಲು ATP ಮತ್ತು GTP ಗಳನ್ನು ಅಂತರ್ಜೀವಕೋಶದ ದ್ರಾವಣದಿಂದ ಹೊರಗಿಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪಂಚ್ಡ್ ಪ್ಯಾಚ್ ದಾಖಲೆಯನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಪ್ಯಾಚ್ ಪೈಪೆಟ್ ಅನ್ನು ಆಂಫೋಟೆರಿಸಿನ್-ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಆಂತರಿಕ ದ್ರಾವಣದಿಂದ (ಸರಿಸುಮಾರು 200 ರಿಂದ 250μg/ml; G4888, ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) ತುಂಬಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಆಂಫೋಟೆರಿಸಿನ್ ಅನ್ನು ಡೈಮಿಥೈಲ್ ಸಲ್ಫಾಕ್ಸೈಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಕರಗಿಸಲಾಯಿತು (ಅಂತಿಮ ಸಾಂದ್ರತೆ: 0.1 ರಿಂದ 0.3%; DMSO; D8418, ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್). ಬಳಸಿದ DMSO ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಿದ ನರಕೋಶಗಳ ಮೇಲೆ ಯಾವುದೇ ಗಮನಾರ್ಹ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಲಿಲ್ಲ. ಪಂಚಿಂಗ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಚಾನಲ್ ಪ್ರತಿರೋಧವನ್ನು (Ra) ನಿರಂತರವಾಗಿ ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು Ra ಮತ್ತು AP ನ ವೈಶಾಲ್ಯವು ಸ್ಥಿರವಾದ ನಂತರ (20-40 ನಿಮಿಷಗಳು) ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಲಾಯಿತು. ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ವೋಲ್ಟೇಜ್ ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಕರೆಂಟ್ ಕ್ಲಾಂಪ್‌ನಲ್ಲಿ 2 ರಿಂದ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ಇಗೊರ್ ಪ್ರೊ (ಆವೃತ್ತಿ 7.05.2, ವೇವ್‌ಮೆಟ್ರಿಕ್ಸ್, USA), ಎಕ್ಸೆಲ್ (ಆವೃತ್ತಿ 2010, ಮೈಕ್ರೋಸಾಫ್ಟ್ ಕಾರ್ಪೊರೇಷನ್, ರೆಡ್‌ಮಂಡ್, USA) ಮತ್ತು ಗ್ರಾಫ್‌ಪ್ಯಾಡ್ ಪ್ರಿಸ್ಮ್ (ಆವೃತ್ತಿ 8.1.2, ಗ್ರಾಫ್‌ಪ್ಯಾಡ್ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಇಂಕ್., ಲಾ ಜೊಲ್ಲಾ, CA) ಬಳಸಿ ಡೇಟಾ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತ AP ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು, IgorPro ನ ನ್ಯೂರೋಮ್ಯಾಟಿಕ್ v3.0c ಪ್ಲಗ್-ಇನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಮಿತಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು AP ಗಳನ್ನು ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತವಾಗಿ ಗುರುತಿಸಿ, ಇದನ್ನು ಪ್ರತಿ ದಾಖಲೆಗೆ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಹೊಂದಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸ್ಪೈಕ್ ಮಧ್ಯಂತರವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, ಗರಿಷ್ಠ ತತ್ಕ್ಷಣದ ಸ್ಪೈಕ್ ಆವರ್ತನ ಮತ್ತು ಸರಾಸರಿ ಸ್ಪೈಕ್ ಆವರ್ತನದೊಂದಿಗೆ ಸ್ಪೈಕ್ ಆವರ್ತನವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಿ.
PN ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆ. ಹಿಂದೆ ಪ್ರಕಟಿಸಲಾದ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್‌ಗೆ ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುವ ಮೂಲಕ, ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಮೌಸ್ ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಮ್‌ನಿಂದ PN ಗಳನ್ನು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಯಿತು (58). ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಸೆರೆಬೆಲ್ಲಮ್ ಅನ್ನು ಐಸ್-ಕೋಲ್ಡ್ ಡಿಸೋಸಿಯೇಶನ್ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ [HBSS Ca2+ ಮತ್ತು Mg2+ ಇಲ್ಲದೆ, 20 mM ಗ್ಲೂಕೋಸ್, ಪೆನ್ಸಿಲಿನ್ (50 U/ml) ಮತ್ತು ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟೊಮೈಸಿನ್ (0.05 mg/ml)] ವಿಭಜಿಸಿ ಮೃದುಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಪಪೈನ್‌ನಲ್ಲಿ ಜೀರ್ಣಿಸಿಕೊಳ್ಳಲಾಯಿತು [HBSS, 1-ಸಿಸ್ಟೀನ್·HCl (1 mg / ml) ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕವಾಗಿದೆ, ಪಪೈನ್ (16 U/ml) ಮತ್ತು ಡಿಯೋಕ್ಸಿರೈಬೊನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ I (DNase I; 0.1 mg/ml)] 30°C ನಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಿ. ಮೊದಲು ಅಂಗಾಂಶಗಳನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಮೊಟ್ಟೆಯ ಲೋಳೆ (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) ಮತ್ತು DNase (0.1 mg/ml) ಹೊಂದಿರುವ HBSS ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ತೊಳೆಯಿರಿ, ಇದರಿಂದ ಕಿಣ್ವಕ ಜೀರ್ಣಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ತಡೆಯಬಹುದು, ಮತ್ತು ನಂತರ 20 mM ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಹೊಂದಿರುವ HBSS ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ HBSS ನಲ್ಲಿ ನಿಧಾನವಾಗಿ ರುಬ್ಬುವುದು, ಪೆನ್ಸಿಲಿನ್ (50 U/ml), ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟೊಮೈಸಿನ್ (0.05 mg/ml) ಮತ್ತು DNase (0.1 mg/ml) ಏಕ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಜೀವಕೋಶದ ಅಮಾನತು 70μm ಕೋಶ ಸ್ಟ್ರೈನರ್ ಮೂಲಕ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲ್ಪಟ್ಟಿತು, ನಂತರ ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ (1110 rpm, 5 ನಿಮಿಷಗಳು, 4°C) ಮೂಲಕ ಪೆಲ್ಲೆಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ವಿಂಗಡಣಾ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಮರುಹೊಂದಿಸಲಾಯಿತು [HBSS, 20 mM ಗ್ಲೂಕೋಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕವಾಗಿದೆ, 20% ಭ್ರೂಣದ ಗೋವು) ಸೀರಮ್, ಪೆನ್ಸಿಲಿನ್ (50 U/ml) ಮತ್ತು ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟೊಮೈಸಿನ್ (0.05 mg/ml)]; ಪ್ರೊಪಿಡಿಯಮ್ ಅಯೋಡೈಡ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಜೀವಕೋಶದ ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಿ ಮತ್ತು ಜೀವಕೋಶದ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು 1×106 ರಿಂದ 2×106 ಜೀವಕೋಶಗಳು/ml ಗೆ ಹೊಂದಿಸಿ. ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿಯ ಮೊದಲು, ಅಮಾನತುಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು 50 μm ಸೆಲ್ ಸ್ಟ್ರೈನರ್ ಮೂಲಕ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು.
ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೀಟರ್. FACSAria III ಯಂತ್ರ (BD ಬಯೋಸೈನ್ಸ್) ಮತ್ತು FACSDiva ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ (BD ಬಯೋಸೈನ್ಸ್, ಆವೃತ್ತಿ 8.0.1) ಬಳಸಿ 4°C ನಲ್ಲಿ ಕೋಶ ವಿಂಗಡಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಸೆಲ್ ಅಮಾನತುಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು 100 μm ನಳಿಕೆಯನ್ನು ಬಳಸಿ 20 psi ಒತ್ತಡದಲ್ಲಿ ~2800 ಘಟನೆಗಳು/ಸೆಕೆಂಡಿನ ದರದಲ್ಲಿ ವಿಂಗಡಿಸಲಾಯಿತು. ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಗೇಟಿಂಗ್ ಮಾನದಂಡಗಳು (ಕೋಶದ ಗಾತ್ರ, ಬೈಮೋಡಲ್ ತಾರತಮ್ಯ ಮತ್ತು ಸ್ಕ್ಯಾಟರಿಂಗ್ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳು) ಇತರ ಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳಿಂದ PN ನ ಸರಿಯಾದ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲದ ಕಾರಣ, mitoYFP+ ​​ಮತ್ತು ನಿಯಂತ್ರಣ mitoYFP − ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ YFP ತೀವ್ರತೆ ಮತ್ತು ಆಟೋಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್‌ನ ನೇರ ಹೋಲಿಕೆಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಗೇಟಿಂಗ್ ತಂತ್ರವನ್ನು ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ. 488 nm ಲೇಸರ್ ಲೈನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಮಾದರಿಯನ್ನು ವಿಕಿರಣಗೊಳಿಸುವ ಮೂಲಕ YFP ಉತ್ಸುಕವಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 530/30 nm ಬ್ಯಾಂಡ್ ಪಾಸ್ ಫಿಲ್ಟರ್ ಬಳಸಿ ಸಿಗ್ನಲ್ ಅನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲಾಗುತ್ತದೆ. mitoYFP+ ​​ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ, ನರಕೋಶದ ದೇಹ ಮತ್ತು ಆಕ್ಸಾನ್ ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು Rosa26-mitoYFP ವರದಿಗಾರ ಜೀನ್‌ನ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಬಲವನ್ನು ಸಹ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. 7-AAD ಅನ್ನು 561 nm ಹಳದಿ ಲೇಸರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಚೋದಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸತ್ತ ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ಹೊರಗಿಡಲು 675/20 nm ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಪಾಸ್ ಫಿಲ್ಟರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗುತ್ತದೆ. ಅದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಆಸ್ಟ್ರೋಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸಲು, ಕೋಶ ಅಮಾನತು ACSA-2-APC ಯೊಂದಿಗೆ ಬಣ್ಣ ಬಳಿಯಲಾಯಿತು, ನಂತರ ಮಾದರಿಯನ್ನು 640 nm ಲೇಸರ್ ಲೈನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ವಿಕಿರಣಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸಿಗ್ನಲ್ ಅನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು 660/20 nm ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಪಾಸ್ ಫಿಲ್ಟರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು.
ಸಂಗ್ರಹಿಸಿದ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ (1110 rpm, 5 ನಿಮಿಷಗಳು, 4°C) ಮೂಲಕ ಉಂಡೆಗಳನ್ನಾಗಿ ಮಾಡಿ -80°C ನಲ್ಲಿ ಬಳಕೆಯವರೆಗೆ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ. ಕಾರ್ಯವಿಧಾನದ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು Mfn2cKO ಇಲಿಗಳು ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಮರಿಗಳನ್ನು ಒಂದೇ ದಿನ ವರ್ಗೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. FACS ಡೇಟಾ ಪ್ರಸ್ತುತಿ ಮತ್ತು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು FlowJo ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ (FlowJo LLC, ಆಶ್‌ಲ್ಯಾಂಡ್, ಒರೆಗಾನ್, USA) ಬಳಸಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
ಮೇಲೆ ಹೇಳಿದಂತೆ (59), ನಂತರದ mtDNA ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ ವಿಂಗಡಿಸಲಾದ ನರಕೋಶಗಳಿಂದ DNA ಯನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ನೈಜ-ಸಮಯದ PCR ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಆರಂಭದಲ್ಲಿ ವಿಭಿನ್ನ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಜೀವಕೋಶಗಳ ಮೇಲೆ qPCR ಅನ್ನು ಚಲಾಯಿಸುವ ಮೂಲಕ ರೇಖೀಯತೆ ಮತ್ತು ಮಿತಿ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನೇಸ್ K (200 ng/ml) ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ 300 PN ಅನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ 55°C 120 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪ್ರೋಟೀನೇಸ್ K ಯ ಸಂಪೂರ್ಣ ನಿಷ್ಕ್ರಿಯತೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು 95°C ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಮತ್ತಷ್ಟು ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ. mt-Nd1 ಗೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾದ TaqMan ಪ್ರೋಬ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್) ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, mtDNA ಅನ್ನು 7900HT ರಿಯಲ್-ಟೈಮ್ PCR ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಲ್ಲಿ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಅರೆ-ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ PCR ಮೂಲಕ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ವಿಜ್ಞಾನ, ಕ್ಯಾಟಲಾಗ್ ಸಂಖ್ಯೆ Mm04225274_s1), mt-Nd6 (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, ಕ್ಯಾಟಲಾಗ್ ಸಂಖ್ಯೆ AIVI3E8) ಮತ್ತು 18S (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, ಕ್ಯಾಟಲಾಗ್ ಸಂಖ್ಯೆ Hs99999901_s1) ಜೀನ್‌ಗಳು.
ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್ ಮಾದರಿ ತಯಾರಿಕೆ. ದ್ರಾವಣವನ್ನು 95°C ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಬಿಸಿ ಮಾಡಿ ಸೋನಿಕೇಟಿಂಗ್ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ, ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ [6 M ಗ್ವಾನಿಡಿನ್ ಕ್ಲೋರೈಡ್, 10 mM ಟ್ರಿಸ್(2-ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿಥೈಲ್) ಫಾಸ್ಫೈನ್ ಹೈಡ್ರೋಕ್ಲೋರೈಡ್, 10 mM ಕ್ಲೋರೋಅಸೆಟಮೈಡ್ ಮತ್ತು 100 mM ಟ್ರಿಸ್-ಲೈಸ್ ಹೆಪ್ಪುಗಟ್ಟಿದ ನ್ಯೂರಾನ್ ಪೆಲೆಟ್‌ಗಳು HCl ನಲ್ಲಿ]. ಬಯೋರಪ್ಟರ್ (ಡಯಾಜೆನೋಡ್) ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ (30 ಸೆಕೆಂಡುಗಳ ಪಲ್ಸ್ / 30 ಸೆಕೆಂಡುಗಳ ವಿರಾಮ ಅವಧಿ). ಮಾದರಿಯನ್ನು 20 mM ಟ್ರಿಸ್-HCl (pH 8.0) ನಲ್ಲಿ 1:10 ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, 300 ng ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್ ಗೋಲ್ಡ್ (ಪ್ರೊಮೆಗಾ) ನೊಂದಿಗೆ ಬೆರೆಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸಂಪೂರ್ಣ ಜೀರ್ಣಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಸಾಧಿಸಲು ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ 37°C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. ಎರಡನೇ ದಿನ, ಮಾದರಿಯನ್ನು 20,000 ಗ್ರಾಂ ನಲ್ಲಿ 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಸೂಪರ್ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು 0.1% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲದೊಂದಿಗೆ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಸ್ವಯಂ-ನಿರ್ಮಿತ ಸ್ಟೇಜ್‌ಟಿಪ್ಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಉಪ್ಪು ತೆಗೆಯಲಾಯಿತು. ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸ್ಪೀಡ್‌ವ್ಯಾಕ್ ಉಪಕರಣದಲ್ಲಿ (ಎಪ್ಪೆಂಡಾರ್ಫ್ ಸಾಂದ್ರಕ ಪ್ಲಸ್ 5305) 45°C ನಲ್ಲಿ ಒಣಗಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನ್ನು 0.1% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲದಲ್ಲಿ ಅಮಾನತುಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. ಎಲ್ಲಾ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಒಂದೇ ವ್ಯಕ್ತಿ ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ತಯಾರಿಸಿದರು. ಆಸ್ಟ್ರೋಸೈಟ್ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು, 4 μg ಉಪ್ಪುರಹಿತ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು 1:20 ರ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನಿಂದ TMT ಕಾರಕ ಅನುಪಾತದೊಂದಿಗೆ ಟಂಡೆಮ್ ಮಾಸ್ ಟ್ಯಾಗ್ (TMT10plex, ಕ್ಯಾಟಲಾಗ್ ಸಂಖ್ಯೆ 90110, ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ನೊಂದಿಗೆ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. TMT ಲೇಬಲಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ, 0.8 mg TMT ಕಾರಕವನ್ನು 70 μl ಅನ್‌ಹೈಡ್ರಸ್ ACN ನಲ್ಲಿ ಮರುಹೊಂದಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಒಣಗಿದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನ್ನು 0.1 M TEAB (ಟ್ರೈಥೈಲಾಮೋನಿಯಮ್ ಬೈಕಾರ್ಬನೇಟ್) ನ 9 μl ಆಗಿ ಮರುಸಂಘಟಿಸಲಾಯಿತು, ಇದಕ್ಕೆ ACN ನಲ್ಲಿ 7 μl TMT ಕಾರಕವನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ಸಾಂದ್ರತೆಯು 43.75% ಆಗಿತ್ತು. 60 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾವು ನಂತರ, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು 5% ಹೈಡ್ರಾಕ್ಸಿಲಾಮೈನ್‌ನ 2 μl ನೊಂದಿಗೆ ತಣಿಸಲಾಯಿತು. ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ, ಒಣಗಿಸಿ, 200μl 0.1% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲದಲ್ಲಿ (FA) ಮರುಹೊಂದಿಸಿ, ಎರಡಾಗಿ ವಿಂಗಡಿಸಿ, ನಂತರ ಸ್ವಯಂ-ನಿರ್ಮಿತ ಸ್ಟೇಜ್‌ಟಿಪ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಉಪ್ಪು ತೆಗೆಯಲಾಯಿತು. ಅಲ್ಟಿಮೇಟ್ 3000 ಅಲ್ಟ್ರಾ ಹೈ ಪರ್ಫಾರ್ಮೆನ್ಸ್ ಲಿಕ್ವಿಡ್ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಾಫ್ (ಅಲ್ಟಿಮೇಟ್ 3000 ಅಲ್ಟ್ರಾ ಹೈ ಪರ್ಫಾರ್ಮೆನ್ಸ್ ಲಿಕ್ವಿಡ್ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಾಫ್) ಬಳಸಿ, ಎರಡು ಭಾಗಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದನ್ನು 1mm x 150mm ಅಕ್ವಿಟಿ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಾಫಿಕ್ ಕಾಲಮ್‌ನಲ್ಲಿ 130Å1.7μm C18 ಕಣಗಳಿಂದ ತುಂಬಿಸಲಾಯಿತು (ವಾಟರ್ಸ್, ಕ್ಯಾಟಲಾಗ್ ಸಂಖ್ಯೆ. SKU: 186006935). ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್). 30μl/ನಿಮಿಷದ ಹರಿವಿನ ದರದಲ್ಲಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಿ, 1% ರಿಂದ 50% ಬಫರ್ B ವರೆಗೆ 85 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 96 ನಿಮಿಷಗಳ ಹಂತ ಹಂತದ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್‌ನೊಂದಿಗೆ, 50% ರಿಂದ 95% ಬಫರ್ B ವರೆಗೆ 3 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ, ನಂತರ 95% ಬಫರ್ B ಗೆ 8 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ; ಬಫರ್ A 5% ACN ಮತ್ತು 10 mM ಅಮೋನಿಯಂ ಬೈಕಾರ್ಬನೇಟ್ (ABC), ಮತ್ತು ಬಫರ್ B 80% ACN ಮತ್ತು 10 mM ABC ಆಗಿದೆ. ಪ್ರತಿ 3 ನಿಮಿಷಗಳಿಗೊಮ್ಮೆ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ ಎರಡು ಗುಂಪುಗಳಾಗಿ (1 + 17, 2 + 18, ಇತ್ಯಾದಿ) ಸಂಯೋಜಿಸಿ ಮತ್ತು ನಿರ್ವಾತ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಯಲ್ಲಿ ಒಣಗಿಸಿ.
LC-MS/MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿಗಾಗಿ, ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು (ಸಂಖ್ಯೆ r119.aq) 25 ಸೆಂ.ಮೀ., 75 μm ಒಳ ವ್ಯಾಸದ ಪಿಕೊಫ್ರಿಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣಾತ್ಮಕ ಕಾಲಮ್ (ಹೊಸ ವಸ್ತುನಿಷ್ಠ ಲೆನ್ಸ್, ಭಾಗ ಸಂಖ್ಯೆ PF7508250) ನಲ್ಲಿ 1.9 μm ರೆಪ್ರೊಸಿಲ್-ಪುರ್ 120 C18-AQ ಮಾಧ್ಯಮ (ಡಾ. ಮೈಷ್, ಮ್ಯಾಟ್), ಯೂಸ್ EASY-nLC 1200 (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, ಜರ್ಮನಿ) ಹೊಂದಿದ ಮೇಲೆ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಕಾಲಮ್ ಅನ್ನು 50°C ನಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಯಿತು. ಬಫರ್‌ಗಳು A ಮತ್ತು B ಕ್ರಮವಾಗಿ ನೀರಿನಲ್ಲಿ 0.1% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲ ಮತ್ತು 80% ACN ನಲ್ಲಿ 0.1% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲ. ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು 65 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 6% ರಿಂದ 31% ಬಫರ್ B ಗೆ ಮತ್ತು 200 nl/min ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್‌ನೊಂದಿಗೆ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 31% ರಿಂದ 50% ಬಫರ್ B ಗೆ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಆರ್ಬಿಟ್ರಾಪ್ ಫ್ಯೂಷನ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ನಲ್ಲಿ ಎಲ್ಯುಟೆಡ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಪೂರ್ವಗಾಮಿ m/z ಮಾಪನವನ್ನು 350 ರಿಂದ 1500 m/z ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿ 120,000 ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ. 27% ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಿದ ಘರ್ಷಣೆ ಶಕ್ತಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, 2 ರಿಂದ 6 ರ ಚಾರ್ಜ್ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಪ್ರಬಲ ಪೂರ್ವಗಾಮಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿನ ಶಕ್ತಿಯ C ಬಲೆ ವಿಘಟನೆ (HCD) ಸೀಳುವಿಕೆಗೆ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಚಕ್ರದ ಸಮಯವನ್ನು 1 ಸೆಕೆಂಡಿಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ. ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ತುಣುಕಿನ m/z ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಅಯಾನು ಬಲೆಗೆ 5×104 ರ ಚಿಕ್ಕ AGC ಗುರಿ ಮತ್ತು 86 ms ನ ಗರಿಷ್ಠ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಸಮಯವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ವಿಘಟನೆಯ ನಂತರ, ಪೂರ್ವಗಾಮಿಯನ್ನು 45 ಸೆಕೆಂಡುಗಳ ಕಾಲ ಡೈನಾಮಿಕ್ ಹೊರಗಿಡುವ ಪಟ್ಟಿಯಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಯಿತು. TMT-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು 50 cm, 75 μm ಅಕ್ಲೈಮ್ ಪೆಪ್‌ಮ್ಯಾಪ್ ಕಾಲಮ್‌ನಲ್ಲಿ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, ಕ್ಯಾಟಲಾಗ್ ಸಂಖ್ಯೆ 164942) ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ವಲಸೆ ವರ್ಣಪಟಲವನ್ನು ಆರ್ಬಿಟ್ರಾಪ್ ಲುಮೋಸ್ ಟ್ರೈಬ್ರಿಡ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ನಲ್ಲಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು, ಇದು ಹೈ-ಫೀಲ್ಡ್ ಅಸಮ್ಮಿತ ತರಂಗರೂಪ ಅಯಾನುಗಳು (FAIMS) ಉಪಕರಣಗಳೊಂದಿಗೆ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) −50 ಮತ್ತು −70 V ನ ಎರಡು ಪರಿಹಾರ ವೋಲ್ಟೇಜ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ. ಸಿಂಕ್ರೊನೈಸೇಶನ್ ಪೂರ್ವಗಾಮಿಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾದ MS3 ಅನ್ನು TMT ವರದಿ ಅಯಾನು ಸಿಗ್ನಲ್ ಮಾಪನಕ್ಕಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆಯನ್ನು EASY-nLC 1200 ನಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು, 90% ರೇಖೀಯ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಎಲ್ಯೂಷನ್ ಬಳಸಿ, 6% ರಿಂದ 31% ಬಫರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ; ಬಫರ್ A 0.1% FA ಆಗಿತ್ತು, ಮತ್ತು ಬಫರ್ B 0.1% FA ಮತ್ತು 80% ACN ಆಗಿತ್ತು. ವಿಶ್ಲೇಷಣಾತ್ಮಕ ಕಾಲಮ್ ಅನ್ನು 50°C ನಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. FAIMS ಪರಿಹಾರ ವೋಲ್ಟೇಜ್ ಪ್ರಕಾರ ಮೂಲ ಫೈಲ್ ಅನ್ನು ವಿಭಜಿಸಲು ಫ್ರೀಸ್ಟೈಲ್ (ಆವೃತ್ತಿ 1.6, ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಬಳಸಿ.
ಪ್ರೋಟೀನ್ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ. ಸಂಯೋಜಿತ ಆಂಡ್ರೊಮಿಡಾ ಸರ್ಚ್ ಎಂಜಿನ್ ಬಳಸಿ, ಮೂಲ ಡೇಟಾವನ್ನು ಮ್ಯಾಕ್ಸ್‌ಕ್ವಾಂಟ್ ಆವೃತ್ತಿ 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) ಬಳಸಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಅಕ್ವೋರಿಯಾ ವಿಕ್ಟೋರಿಯಾದಿಂದ ಪಡೆದ ಕ್ರೆ ರಿಕಾಂಬಿನೇಸ್ ಮತ್ತು ವೈಎಫ್‌ಪಿ ಅನುಕ್ರಮಗಳ ಜೊತೆಗೆ, ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಫ್ರಾಗ್ಮೆಂಟ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾವನ್ನು ಮೌಸ್ ಉಲ್ಲೇಖ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್‌ನ ಕ್ಯಾನೊನಿಕಲ್ ಅನುಕ್ರಮ ಮತ್ತು ಐಸೋಫಾರ್ಮ್ ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕಾಗಿ ಹುಡುಕಲಾಯಿತು (ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್ ಐಡಿ UP000000589, ಮೇ 2017 ರಲ್ಲಿ ಯುನಿಪ್ರೋಟ್‌ನಿಂದ ಡೌನ್‌ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ). ಮೆಥಿಯೋನಿನ್ ಆಕ್ಸಿಡೀಕರಣ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಎನ್-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಅಸಿಟೈಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ವೇರಿಯಬಲ್ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳಾಗಿ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ; ಸಿಸ್ಟೀನ್ ಕಾರ್ಬಮೊಯ್ಲ್ ಮೀಥೈಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ಸ್ಥಿರ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳಾಗಿ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ. ಜೀರ್ಣಕ್ರಿಯೆಯ ನಿಯತಾಂಕಗಳನ್ನು "ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ" ಮತ್ತು "ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್/ಪಿ" ಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ. ಪ್ರೋಟೀನ್ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಗಾಗಿ ಬಳಸುವ ಕನಿಷ್ಠ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ರೇಜರ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು 1; ಅನನ್ಯ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಕನಿಷ್ಠ ಸಂಖ್ಯೆ 0. ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ನಕ್ಷೆ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ, ಪ್ರೋಟೀನ್ ಗುರುತಿನ ದರ 0.01 ಆಗಿತ್ತು. "ಎರಡನೇ ಪೆಪ್ಟೈಡ್" ಆಯ್ಕೆಯನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ. ವಿಭಿನ್ನ ಮೂಲ ಫೈಲ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ಯಶಸ್ವಿ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಗಳನ್ನು ವರ್ಗಾಯಿಸಲು "ರನ್‌ಗಳ ನಡುವಿನ ಹೊಂದಾಣಿಕೆ" ಆಯ್ಕೆಯನ್ನು ಬಳಸಿ. ಲೇಬಲ್-ಮುಕ್ತ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ (LFQ) LFQ ಕನಿಷ್ಠ ಅನುಪಾತ ಎಣಿಕೆ 1 ಅನ್ನು ಬಳಸಿ (60). ಪ್ರತಿ ಸಮಯದ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಕನಿಷ್ಠ ಒಂದು ಜೀನೋಟೈಪ್ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿ ಕನಿಷ್ಠ ಎರಡು ಮಾನ್ಯ ಮೌಲ್ಯಗಳಿಗೆ LFQ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅಗಲವಿರುವ ಸಾಮಾನ್ಯ ವಿತರಣೆಯಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. 0.3 ಮತ್ತು ಕೆಳಗೆ 1.8. LFQ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಪರ್ಸಿಯಸ್ ಕಂಪ್ಯೂಟಿಂಗ್ ಪ್ಲಾಟ್‌ಫಾರ್ಮ್ (https://maxquant.net/perseus/) ಮತ್ತು R (https://r-project.org/) ಅನ್ನು ಬಳಸಿ. ಡಿಫರೆನ್ಷಿಯಲ್ ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ರೆಶನ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಲಿಮ್ಮಾ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಪ್ಯಾಕೇಜ್‌ನಿಂದ ದ್ವಿಮುಖ ಮಧ್ಯಮ ಟಿ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು (61). ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally ಮತ್ತು pheatmap ಬಳಸಿ ಪರಿಶೋಧನಾ ದತ್ತಾಂಶ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ. TMT-ಆಧಾರಿತ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ಸ್ ದತ್ತಾಂಶವನ್ನು MaxQuant ಆವೃತ್ತಿ 1.6.10.43 ಬಳಸಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸೆಪ್ಟೆಂಬರ್ 2018 ರಲ್ಲಿ ಡೌನ್‌ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾದ ಯುನಿಪ್ರೋಟ್‌ನ ಮಾನವ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ಸ್ ಡೇಟಾಬೇಸ್‌ನಿಂದ ಕಚ್ಚಾ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ಸ್ ಡೇಟಾವನ್ನು ಹುಡುಕಿ. ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ತಯಾರಕರು ಒದಗಿಸಿದ ಐಸೊಟೋಪ್ ಶುದ್ಧತೆಯ ತಿದ್ದುಪಡಿ ಅಂಶವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ. ಡಿಫರೆನ್ಷಿಯಲ್ ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ರೆಶನ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ R ನಲ್ಲಿ ಲಿಮ್ಮಾ ಬಳಸಿ. ಮೂಲ ಡೇಟಾ, ಡೇಟಾಬೇಸ್ ಹುಡುಕಾಟ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಮತ್ತು ಡೇಟಾ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ವರ್ಕ್‌ಫ್ಲೋ ಮತ್ತು ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು PRIDE ಪಾಲುದಾರ ರೆಪೊಸಿಟರಿಯ ಮೂಲಕ ಡೇಟಾ ಸೆಟ್ ಐಡೆಂಟಿಫೈಯರ್ PXD019690 ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್‌ಎಕ್ಸ್‌ಚೇಂಜ್ ಮೈತ್ರಿಕೂಟದಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಟಿಪ್ಪಣಿಗಳು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಉತ್ಕೃಷ್ಟಗೊಳಿಸುತ್ತವೆ. 8 ವಾರಗಳಲ್ಲಿ ಡೇಟಾ ಸೆಟ್‌ನ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಟಿಪ್ಪಣಿ ಪದಗಳ ಶ್ರೀಮಂತಿಕೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಇಂಜೆನ್ಯೂಟಿ ಪಾತ್‌ವೇ ಅನಾಲಿಸಿಸ್ (QIAGEN) ಉಪಕರಣವನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು (ಚಿತ್ರ 1). ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, LC-MS/MS (ಟ್ಯಾಂಡೆಮ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ) ಡೇಟಾ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ಪಡೆದ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪಟ್ಟಿಯನ್ನು ಈ ಕೆಳಗಿನ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾನದಂಡಗಳೊಂದಿಗೆ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ: ಮಸ್ ಮಸ್ಕ್ಯುಲಸ್ ಅನ್ನು ಜಾತಿಗಳು ಮತ್ತು ಹಿನ್ನೆಲೆಯಾಗಿ ಆಯ್ಕೆಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ವರ್ಗವು ಬೆಂಜಮಿನಿ 0.05 ಅಥವಾ ಅದಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಪುಷ್ಟೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ ಹೊಂದಿಸಲಾದ P ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವೆಂದು ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ಗ್ರಾಫ್‌ಗಾಗಿ, ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ P ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಆಧರಿಸಿ ಪ್ರತಿ ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ನಲ್ಲಿನ ಅಗ್ರ ಐದು ಹೆಚ್ಚುವರಿ ವರ್ಗಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಬಹು ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, ಬೆಂಜಮಿನಿ, ಕ್ರೀಗರ್ ಮತ್ತು ಯೆಕುಟಿಯೆಲಿ (Q = 5%) ರ ಎರಡು-ಹಂತದ ರೇಖೀಯ ವರ್ಧಕ ಕಾರ್ಯಕ್ರಮವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, ಪ್ರತಿ ವರ್ಗದಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಪ್ರಮುಖ ಅಭ್ಯರ್ಥಿಗಳ ಮೇಲೆ ಸಮಯ-ಕೋರ್ಸ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಸಾಲನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸ್ಥಿರವಾದ SD ಅನ್ನು ಅಳವಡಿಸಿಕೊಳ್ಳುವ ಅಗತ್ಯವಿಲ್ಲ.
ಈ ಅಧ್ಯಯನದ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಪ್ರಕಟಿತ ಡೇಟಾಬೇಸ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಲು ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ 1 ರಲ್ಲಿ ವೆನ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರವನ್ನು ರಚಿಸಲು, ನಾವು ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪಟ್ಟಿಯನ್ನು ಮಿಟೊಕಾರ್ಟಾ 2.0 ಟಿಪ್ಪಣಿಗಳೊಂದಿಗೆ (24) ಸಂಯೋಜಿಸಿದ್ದೇವೆ. ರೇಖಾಚಿತ್ರವನ್ನು ರಚಿಸಲು ಆನ್‌ಲೈನ್ ಪರಿಕರವಾದ ಡ್ರಾ ವೆನ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರವನ್ನು (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) ಬಳಸಿ.
ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ಸ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ಬಳಸುವ ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ಕುರಿತು ವಿವರವಾದ ಮಾಹಿತಿಗಾಗಿ, ದಯವಿಟ್ಟು ಮೆಟೀರಿಯಲ್ಸ್ ಮತ್ತು ಮೆಥಡ್ಸ್‌ನ ಅನುಗುಣವಾದ ವಿಭಾಗವನ್ನು ನೋಡಿ. ಎಲ್ಲಾ ಇತರ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗೆ, ವಿವರವಾದ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಅನುಗುಣವಾದ ಲೆಜೆಂಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಕಾಣಬಹುದು. ಬೇರೆ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟಪಡಿಸದ ಹೊರತು, ಎಲ್ಲಾ ಡೇಟಾವನ್ನು ಸರಾಸರಿ ± SEM ಆಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಾ ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳನ್ನು ಗ್ರಾಫ್‌ಪ್ಯಾಡ್ ಪ್ರಿಸಮ್ 8.1.2 ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಬಳಸಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
ಈ ಲೇಖನಕ್ಕೆ ಪೂರಕ ಸಾಮಗ್ರಿಗಳಿಗಾಗಿ, ದಯವಿಟ್ಟು http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 ನೋಡಿ.
ಇದು ಕ್ರಿಯೇಟಿವ್ ಕಾಮನ್ಸ್ ಅಟ್ರಿಬ್ಯೂಷನ್-ವಾಣಿಜ್ಯೇತರ ಪರವಾನಗಿಯ ನಿಯಮಗಳ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ವಿತರಿಸಲಾದ ಮುಕ್ತ ಪ್ರವೇಶ ಲೇಖನವಾಗಿದ್ದು, ಅಂತಿಮ ಬಳಕೆಯು ವಾಣಿಜ್ಯ ಲಾಭಕ್ಕಾಗಿ ಅಲ್ಲದಿರುವವರೆಗೆ ಮತ್ತು ಮೂಲ ಕೃತಿ ಸರಿಯಾಗಿದೆ ಎಂಬ ಪ್ರಮೇಯವಿರುವವರೆಗೆ ಯಾವುದೇ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಬಳಕೆ, ವಿತರಣೆ ಮತ್ತು ಪುನರುತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ. ಉಲ್ಲೇಖ.
ಗಮನಿಸಿ: ನೀವು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಿದ ವ್ಯಕ್ತಿಗೆ ನೀವು ಇಮೇಲ್ ಅನ್ನು ನೋಡಬೇಕೆಂದು ಬಯಸುತ್ತೀರಿ ಮತ್ತು ಅದು ಸ್ಪ್ಯಾಮ್ ಅಲ್ಲ ಎಂದು ತಿಳಿಯುವಂತೆ ನಿಮ್ಮ ಇಮೇಲ್ ವಿಳಾಸವನ್ನು ಒದಗಿಸುವಂತೆ ಮಾತ್ರ ನಾವು ಕೇಳುತ್ತೇವೆ. ನಾವು ಯಾವುದೇ ಇಮೇಲ್ ವಿಳಾಸಗಳನ್ನು ಸೆರೆಹಿಡಿಯುವುದಿಲ್ಲ.
ನೀವು ಸಂದರ್ಶಕರೇ ಎಂಬುದನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ಮತ್ತು ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಸ್ಪ್ಯಾಮ್ ಸಲ್ಲಿಕೆಯನ್ನು ತಡೆಯಲು ಈ ಪ್ರಶ್ನೆಯನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಇ. ಮೋಟೋರಿ, ಐ. ಅಟನಾಸೊವ್, ಎಸ್‌ಎಂವಿ ಕೊಚನ್, ಕೆ. ಫೋಲ್ಜ್-ಡೊನಾಹು, ವಿ. ಶಕ್ತಿವೇಲು, ಪಿ. ಗಿಯಾವಲಿಸ್ಕೋ, ಎನ್. ಟೋನಿ, ಜೆ. ಪುಯಲ್, ಎನ್.-ಜಿ. ಲಾರ್ಸನ್
ನಿಷ್ಕ್ರಿಯ ನರಕೋಶಗಳ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ಸ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ನರಗಳ ಅವನತಿಯನ್ನು ಎದುರಿಸಲು ಚಯಾಪಚಯ ಕಾರ್ಯಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿದೆ.
ಇ. ಮೋಟೋರಿ, ಐ. ಅಟನಾಸೊವ್, ಎಸ್‌ಎಂವಿ ಕೊಚನ್, ಕೆ. ಫೋಲ್ಜ್-ಡೊನಾಹು, ವಿ. ಶಕ್ತಿವೇಲು, ಪಿ. ಗಿಯಾವಲಿಸ್ಕೋ, ಎನ್. ಟೋನಿ, ಜೆ. ಪುಯಲ್, ಎನ್.-ಜಿ. ಲಾರ್ಸನ್
ನಿಷ್ಕ್ರಿಯ ನರಕೋಶಗಳ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ಸ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ನರಗಳ ಅವನತಿಯನ್ನು ಎದುರಿಸಲು ಚಯಾಪಚಯ ಕಾರ್ಯಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿದೆ.
©2020 ಅಮೇರಿಕನ್ ಅಸೋಸಿಯೇಷನ್ ​​ಫಾರ್ ದಿ ಅಡ್ವಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಟ್ ಆಫ್ ಸೈನ್ಸ್. ಎಲ್ಲಾ ಹಕ್ಕುಗಳನ್ನು ಕಾಯ್ದಿರಿಸಲಾಗಿದೆ. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ಮತ್ತು COUNTER ನ ಪಾಲುದಾರ. ಸೈನ್ಸ್ ಅಡ್ವಾನ್ಸ್ ISSN 2375-2548.