Nature.com ಗೆ ಭೇಟಿ ನೀಡಿದ್ದಕ್ಕಾಗಿ ಧನ್ಯವಾದಗಳು. ನೀವು ಬಳಸುತ್ತಿರುವ ಬ್ರೌಸರ್‌ನ ಆವೃತ್ತಿಯು ಸೀಮಿತ CSS ಬೆಂಬಲವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ. ಉತ್ತಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗಾಗಿ, ನಿಮ್ಮ ಬ್ರೌಸರ್‌ನ ಹೊಸ ಆವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಬಳಸಲು ನಾವು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡುತ್ತೇವೆ (ಅಥವಾ ಇಂಟರ್ನೆಟ್ ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ಲೋರರ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೊಂದಾಣಿಕೆ ಮೋಡ್ ಅನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿ). ಈ ಮಧ್ಯೆ, ನಿರಂತರ ಬೆಂಬಲವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು, ನಾವು ಸ್ಟೈಲಿಂಗ್ ಅಥವಾ ಜಾವಾಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಇಲ್ಲದೆ ಸೈಟ್ ಅನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತಿದ್ದೇವೆ.
ಆಟಿಸಂ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್ ಡಿಸಾರ್ಡರ್‌ನಂತಹ ನರ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಅಸ್ವಸ್ಥತೆಗಳಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಪ್ರೊಪಿಯಾನಿಕ್ ಆಮ್ಲ (PPA) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. PPA ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪತ್ತಿ, ಚಯಾಪಚಯ ಮತ್ತು ವಹಿವಾಟನ್ನು ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತಿಳಿದುಬಂದಿದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ಸಂಕೀರ್ಣ ತಾತ್ಕಾಲಿಕ ಸ್ವಭಾವದಿಂದಾಗಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್, ವಿದಳನ ಮತ್ತು ಸಮ್ಮಿಳನದ ಮೇಲೆ PPA ಯ ಪರಿಣಾಮಗಳು ಸಮಸ್ಯಾತ್ಮಕವಾಗಿಯೇ ಉಳಿದಿವೆ. ಇಲ್ಲಿ, ನರಕೋಶದಂತಹ SH-SY5Y ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ PPA ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಲ್ಟ್ರಾಸ್ಟ್ರಕ್ಚರ್, ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ಮತ್ತು ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ಹೇಗೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲು ನಾವು ಪೂರಕ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಚಿತ್ರಣ ತಂತ್ರಗಳನ್ನು ಬಳಸುತ್ತೇವೆ. PPA (5 mM) ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಪ್ರದೇಶ (p < 0.01), ಫೆರೆಟ್ ವ್ಯಾಸ ಮತ್ತು ಸುತ್ತಳತೆ (p < 0.05), ಮತ್ತು ಪ್ರದೇಶ 2 (p < 0.01) ನಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಇಳಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಯಿತು. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಈವೆಂಟ್ ಲೊಕೇಟರ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಒತ್ತಡದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್‌ನ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಕಾಪಾಡಿಕೊಳ್ಳುವಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು (p < 0.05) ತೋರಿಸಿದೆ. ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) ಮತ್ತು OPA1 (p < 0.05) ನ mRNA ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ. ಒತ್ತಡದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ, ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪತ್ತಿ ಮತ್ತು ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್‌ನ ಮರುರೂಪಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಇದು ವಿವರಿಸುತ್ತದೆ. ನಮ್ಮ ಡೇಟಾವು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್‌ನ ಮೇಲೆ PPA ಯ ಪರಿಣಾಮಗಳ ಬಗ್ಗೆ ಹೊಸ ಒಳನೋಟವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಒತ್ತಡ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಸಂಕೀರ್ಣ ನಿಯಂತ್ರಕ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಇಮೇಜಿಂಗ್ ತಂತ್ರಗಳ ಉಪಯುಕ್ತತೆಯನ್ನು ಎತ್ತಿ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.
ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯವು ಶಕ್ತಿ ಉತ್ಪಾದನೆ ಮತ್ತು ಜೈವಿಕ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ಅವುಗಳ ವಿಶಿಷ್ಟ ಪಾತ್ರಗಳನ್ನು ಮೀರಿ ವಿವಿಧ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಕಾರ್ಯಗಳಲ್ಲಿ ಅವಿಭಾಜ್ಯ ಭಾಗವಹಿಸುವವರಾಗಿದ್ದಾರೆ. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯು ಕ್ಯಾಲ್ಸಿಯಂ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್, ಮೆಟಾಬಾಲಿಕ್ ಮತ್ತು ರೆಡಾಕ್ಸ್ ಹೋಮಿಯೋಸ್ಟಾಸಿಸ್, ಉರಿಯೂತದ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್, ಎಪಿಜೆನೆಟಿಕ್ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳು, ಕೋಶ ಪ್ರಸರಣ, ವ್ಯತ್ಯಾಸ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಗ್ರಾಮ್ ಮಾಡಲಾದ ಜೀವಕೋಶದ ಸಾವಿನ ಪ್ರಮುಖ ನಿಯಂತ್ರಕವಾಗಿದೆ. ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯು ನರಕೋಶದ ಬೆಳವಣಿಗೆ, ಬದುಕುಳಿಯುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯಕ್ಕೆ ನಿರ್ಣಾಯಕವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ನರರೋಗಶಾಸ್ತ್ರದ ವಿವಿಧ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಸೂಚಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ2,3,4.
ಕಳೆದ ದಶಕದಲ್ಲಿ, ಚಯಾಪಚಯ ಸ್ಥಿತಿಯು ನರಜನನ, ವ್ಯತ್ಯಾಸ, ಪಕ್ವತೆ ಮತ್ತು ಪ್ಲಾಸ್ಟಿಟಿಯ ಕೇಂದ್ರ ನಿಯಂತ್ರಕವಾಗಿ ಹೊರಹೊಮ್ಮಿದೆ5,6. ಇತ್ತೀಚೆಗೆ, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ಮತ್ತು ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಜೀವಕೋಶಗಳೊಳಗೆ ಆರೋಗ್ಯಕರ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಗುಂಪನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುವ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಾದ ಮೈಟೊಸಿಸ್‌ನ ಪ್ರಮುಖ ಅಂಶಗಳಾಗಿವೆ. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಬಯೋಜೆನೆಸಿಸ್ ಮತ್ತು ಬಯೋಎನರ್ಜೆಟಿಕ್ಸ್‌ನಿಂದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ವಿದಳನ, ಸಮ್ಮಿಳನ, ಸಾಗಣೆ ಮತ್ತು ಕ್ಲಿಯರೆನ್ಸ್‌ವರೆಗಿನ ಸಂಕೀರ್ಣ ಪರಸ್ಪರ ಅವಲಂಬಿತ ಮಾರ್ಗಗಳಿಂದ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ7,8. ಈ ಯಾವುದೇ ಸಂಯೋಜಿತ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ಅಡ್ಡಿ ಆರೋಗ್ಯಕರ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಜಾಲಗಳ ನಿರ್ವಹಣೆಯನ್ನು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನರಗಳ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಗೆ ಆಳವಾದ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಬೀರುತ್ತದೆ9,10. ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್‌ನ ಅನಿಯಂತ್ರಣವನ್ನು ಆಟಿಸಂ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್ ಅಸ್ವಸ್ಥತೆಗಳು (ASD)11,12 ಸೇರಿದಂತೆ ಅನೇಕ ಮನೋವೈದ್ಯಕೀಯ, ನರಕ್ಷೀಣ ಮತ್ತು ನರಗಳ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಅಸ್ವಸ್ಥತೆಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಬಹುದು.
ASD ಸಂಕೀರ್ಣವಾದ ಜೆನೆಟಿಕ್ ಮತ್ತು ಎಪಿಜೆನೆಟಿಕ್ ಆರ್ಕಿಟೆಕ್ಚರ್ ಹೊಂದಿರುವ ವೈವಿಧ್ಯಮಯ ನರ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಅಸ್ವಸ್ಥತೆಯಾಗಿದೆ. ASD ಯ ಆನುವಂಶಿಕತೆಯು ನಿರ್ವಿವಾದವಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ಆಧಾರವಾಗಿರುವ ಆಣ್ವಿಕ ಕಾರಣಶಾಸ್ತ್ರವನ್ನು ಸರಿಯಾಗಿ ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲಾಗಿಲ್ಲ. ಪೂರ್ವಭಾವಿ ಮಾದರಿಗಳು, ಕ್ಲಿನಿಕಲ್ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಮತ್ತು ಮಲ್ಟಿ-ಓಮಿಕ್ಸ್ ಆಣ್ವಿಕ ಡೇಟಾಸೆಟ್‌ಗಳಿಂದ ಡೇಟಾವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸುವುದು ASD13,14 ರಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಹೆಚ್ಚುತ್ತಿರುವ ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ. ನಾವು ಈ ಹಿಂದೆ ASD ಹೊಂದಿರುವ ರೋಗಿಗಳ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿ ಜೀನೋಮ್-ವೈಡ್ DNA ಮೆತಿಲೀಕರಣ ಪರದೆಯನ್ನು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಮೆಟಾಬಾಲಿಕ್ ಮಾರ್ಗಗಳಲ್ಲಿ ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾದ ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿ ಮೀಥೈಲೇಟೆಡ್ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಿದ್ದೇವೆ15. ನಾವು ತರುವಾಯ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಬಯೋಜೆನೆಸಿಸ್ ಮತ್ತು ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್‌ನ ಕೇಂದ್ರ ನಿಯಂತ್ರಕಗಳ ಡಿಫರೆನ್ಷಿಯಲ್ ಮೆತಿಲೀಕರಣವನ್ನು ವರದಿ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ASD16 ರಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿದ mtDNA ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆ ಮತ್ತು ಬದಲಾದ ಮೂತ್ರದ ಮೆಟಾಬಾಲಿಕ್ ಪ್ರೊಫೈಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಮತ್ತು ಹೋಮಿಯೋಸ್ಟಾಸಿಸ್ ASD ಯ ರೋಗಶಾಸ್ತ್ರದಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರ ಪಾತ್ರವನ್ನು ವಹಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬುದಕ್ಕೆ ನಮ್ಮ ಡೇಟಾ ಹೆಚ್ಚುತ್ತಿರುವ ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್, ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯದ ನಡುವಿನ ಸಂಬಂಧದ ಯಾಂತ್ರಿಕ ತಿಳುವಳಿಕೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸುವುದು ದ್ವಿತೀಯ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯಿಂದ ನಿರೂಪಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ನರವೈಜ್ಞಾನಿಕ ಕಾಯಿಲೆಗಳ ಕುರಿತು ನಡೆಯುತ್ತಿರುವ ಸಂಶೋಧನೆಯ ಪ್ರಮುಖ ಗುರಿಯಾಗಿದೆ.
ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಒತ್ತಡದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಜೀನ್‌ಗಳ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಆಣ್ವಿಕ ತಂತ್ರಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ವಿಧಾನವು ಮೈಟೊಟಿಕ್ ನಿಯಂತ್ರಣ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ಬಹುಮುಖಿ ಮತ್ತು ತಾತ್ಕಾಲಿಕ ಸ್ವಭಾವದಿಂದ ಸೀಮಿತವಾಗಿರಬಹುದು. ಇದಲ್ಲದೆ, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಜೀನ್‌ಗಳ ಭೇದಾತ್ಮಕ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಬದಲಾವಣೆಗಳ ಪರೋಕ್ಷ ಸೂಚಕವಾಗಿದೆ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಸೀಮಿತ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಕಾರ್ಯ ಮತ್ತು ಜೈವಿಕ ಶಕ್ತಿಶಾಸ್ತ್ರವನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಹೆಚ್ಚು ನೇರ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸಲಾಗಿದೆ17. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನವು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್‌ಗೆ ನಿಕಟ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿದೆ. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಆಕಾರ, ಸಂಪರ್ಕ ಮತ್ತು ರಚನೆಯು ಶಕ್ತಿ ಉತ್ಪಾದನೆ ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಮತ್ತು ಜೀವಕೋಶದ ಉಳಿವಿಗೆ ನಿರ್ಣಾಯಕವಾಗಿದೆ5,18. ಇದಲ್ಲದೆ, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನದಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳ ಮೇಲೆ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಉಪಯುಕ್ತ ಅಂತಿಮ ಬಿಂದುಗಳಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ನಂತರದ ಯಾಂತ್ರಿಕ ಅಧ್ಯಯನಗಳಿಗೆ ಆಧಾರವನ್ನು ಒದಗಿಸಬಹುದು.
ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮಿಷನ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ (TEM) ಬಳಸಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನವನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ವೀಕ್ಷಿಸಬಹುದು, ಇದು ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಅಲ್ಟ್ರಾಸ್ಟ್ರಕ್ಚರ್‌ನ ವಿವರವಾದ ಅಧ್ಯಯನಕ್ಕೆ ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ. TEM ಜೀವಕೋಶ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿ ಜೀನ್ ಪ್ರತಿಲೇಖನ, ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಅಥವಾ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ನಿಯತಾಂಕಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಅವಲಂಬಿಸುವ ಬದಲು, ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್‌ನಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಕ್ರಿಸ್ಟೇಯ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ, ಆಕಾರ ಮತ್ತು ರಚನೆಯನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸುತ್ತದೆ. ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, TEM ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯ ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಕಾರ್ಯ ಮತ್ತು ಹೋಮಿಯೋಸ್ಟಾಸಿಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರ ವಹಿಸುವ ಎಂಡೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ರೆಟಿಕ್ಯುಲಮ್ ಮತ್ತು ಆಟೋಫಾಗೋಸೋಮ್‌ಗಳಂತಹ ಇತರ ಅಂಗಗಳ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳ ಅಧ್ಯಯನವನ್ನು ಸುಗಮಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ. ಹೀಗಾಗಿ, ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಮಾರ್ಗಗಳು ಅಥವಾ ಜೀನ್‌ಗಳ ಮೇಲೆ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸುವ ಮೊದಲು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಇದು TEM ಅನ್ನು ಉತ್ತಮ ಆರಂಭಿಕ ಹಂತವನ್ನಾಗಿ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಕಾರ್ಯವು ನರರೋಗಶಾಸ್ತ್ರಕ್ಕೆ ಹೆಚ್ಚು ಪ್ರಸ್ತುತವಾಗುತ್ತಿದ್ದಂತೆ, ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ನರಕೋಶ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ಮತ್ತು ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರವನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ಮತ್ತು ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುವ ಸ್ಪಷ್ಟ ಅವಶ್ಯಕತೆಯಿದೆ.
ಈ ಲೇಖನದಲ್ಲಿ, ಆಟಿಸಂ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್ ಅಸ್ವಸ್ಥತೆಯಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ನರಕೋಶದ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ನಾವು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸುತ್ತೇವೆ. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಪ್ರೊಪಿಯೊನೈಲ್-CoA ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿಲೇಸ್ ಕಿಣ್ವ PCC ಯ ಉಪಘಟಕವಾದ ASD15 ನಲ್ಲಿ ಪ್ರೊಪಿಯೊನೈಲ್-CoA ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿಲೇಸ್ ಬೀಟಾ (PCCB) ನ ಡಿಫರೆನ್ಷಿಯಲ್ ಮೀಥೈಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ನಾವು ಈ ಹಿಂದೆ ವರದಿ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ. PCC ಯ ಅನಿಯಂತ್ರಣವು ಪ್ರೊಪಿಯೊನಿಲ್ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ವಿಷಕಾರಿ ಶೇಖರಣೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ತಿಳಿದುಬಂದಿದೆ, ಇದರಲ್ಲಿ ಪ್ರೊಪಿಯೊನಿಕ್ ಆಮ್ಲ (PPA)23,24,25 ಸೇರಿವೆ. PPA ನರಕೋಶದ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಇನ್ ವಿವೋದಲ್ಲಿ ನಡವಳಿಕೆಯನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ASD26,27,28 ನಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ನರ ಅಭಿವೃದ್ಧಿ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಸ್ಥಾಪಿತ ಪ್ರಾಣಿ ಮಾದರಿಯಾಗಿದೆ. ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, PPA ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಪೊರೆಯ ಸಂಭಾವ್ಯತೆ, ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪತ್ತಿ ಮತ್ತು ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಉಸಿರಾಟವನ್ನು ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ವರದಿಯಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ನರಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಮಾದರಿ ಮಾಡಲು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ29,30. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ಮತ್ತು ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಮೇಲೆ PPA-ಪ್ರೇರಿತ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಪ್ರಭಾವವನ್ನು ಸರಿಯಾಗಿ ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲಾಗಿಲ್ಲ.
ಈ ಅಧ್ಯಯನವು SH-SY5Y ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿನ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ, ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರ ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯದ ಮೇಲೆ PPA ಯ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಪರಿಮಾಣೀಕರಿಸಲು ಪೂರಕ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ತಂತ್ರಗಳನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ. ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ಮತ್ತು ಅಲ್ಟ್ರಾಸ್ಟ್ರಕ್ಚರ್‌ನಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲು ನಾವು TEM ವಿಧಾನವನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ 17,31,32. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಸ್ವರೂಪವನ್ನು ಪರಿಗಣಿಸಿ 33, ಪಿಪಿಎ ಒತ್ತಡದಲ್ಲಿ ವಿದಳನ ಮತ್ತು ಸಮ್ಮಿಳನ ಘಟನೆಗಳು, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಸಂಖ್ಯೆ ಮತ್ತು ಪರಿಮಾಣದ ನಡುವಿನ ಸಮತೋಲನದಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಪರಿಮಾಣೀಕರಿಸಲು ನಾವು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಈವೆಂಟ್ ಲೋಕಲೈಜರ್ (MEL) ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಸಹ ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ. ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ಮತ್ತು ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪತ್ತಿ, ವಿದಳನ ಮತ್ತು ಸಮ್ಮಿಳನದಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಜೀನ್‌ಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿವೆಯೇ ಎಂದು ನಾವು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಒಟ್ಟಿಗೆ ತೆಗೆದುಕೊಂಡರೆ, ನಮ್ಮ ಡೇಟಾವು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ಸಂಕೀರ್ಣತೆಯನ್ನು ಸ್ಪಷ್ಟಪಡಿಸುವ ಸವಾಲನ್ನು ವಿವರಿಸುತ್ತದೆ. SH-SY5Y ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಸಿಸ್‌ನ ಅಳೆಯಬಹುದಾದ ಒಮ್ಮುಖ ಅಂತಿಮ ಬಿಂದುವಾಗಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನವನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡುವಲ್ಲಿ TEM ನ ಉಪಯುಕ್ತತೆಯನ್ನು ನಾವು ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ. ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ಚಯಾಪಚಯ ಒತ್ತಡಕ್ಕೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ ಡೈನಾಮಿಕ್ ಘಟನೆಗಳನ್ನು ಸೆರೆಹಿಡಿಯುವ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ತಂತ್ರಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಿದಾಗ TEM ಡೇಟಾವು ಅತ್ಯಂತ ಶ್ರೀಮಂತ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ. ನರಕೋಶ ಕೋಶ ಮೈಟೋಸಿಸ್ ಅನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸುವ ಆಣ್ವಿಕ ನಿಯಂತ್ರಕ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ಮತ್ತಷ್ಟು ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳು ನರಮಂಡಲದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಘಟಕ ಮತ್ತು ನರ ಕ್ಷೀಣಗೊಳ್ಳುವ ಕಾಯಿಲೆಗಳ ಬಗ್ಗೆ ಪ್ರಮುಖ ಒಳನೋಟಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸಬಹುದು.
ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಒತ್ತಡವನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡಲು, SH-SY5Y ಕೋಶಗಳನ್ನು 3 mM ಮತ್ತು 5 mM ಸೋಡಿಯಂ ಪ್ರೊಪಿಯೊನೇಟ್ (NaP) ಬಳಸಿ PPA ಯೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಲಾಯಿತು. TEM ಗಿಂತ ಮೊದಲು, ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿನ ಒತ್ತಡದ ಘನೀಕರಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಘನೀಕರಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಕ್ರಯೋಜೆನಿಕ್ ಮಾದರಿ ತಯಾರಿಕೆಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು (ಚಿತ್ರ 1a). ಮೂರು ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯ ಎಂಟು ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ನಿಯತಾಂಕಗಳನ್ನು ಅಳೆಯಲು ನಾವು ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಿತ್ರ ವಿಶ್ಲೇಷಣಾ ಪೈಪ್‌ಲೈನ್ ಅನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ. PPA ಚಿಕಿತ್ಸೆಯು ನಾಲ್ಕು ನಿಯತಾಂಕಗಳನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಬದಲಾಯಿಸಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ: ಪ್ರದೇಶ 2, ಪ್ರದೇಶ, ಪರಿಧಿ ಮತ್ತು ಫೆರೆಟ್ ವ್ಯಾಸ (ಚಿತ್ರ 1b–e). 3 mM ಮತ್ತು 5 mM PPA ಚಿಕಿತ್ಸೆಯೊಂದಿಗೆ ಪ್ರದೇಶ 2 ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ (ಕ್ರಮವಾಗಿ p = 0.0183 ಮತ್ತು p = 0.002) (ಚಿತ್ರ 1b), ಆದರೆ ಪ್ರದೇಶ (p = 0.003), ಪರಿಧಿ (p = 0.0106) ಮತ್ತು ಫೆರೆಟ್ ವ್ಯಾಸವು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ. ನಿಯಂತ್ರಣ ಗುಂಪಿಗೆ (ಚಿತ್ರ 1c–e) ಹೋಲಿಸಿದರೆ 5 mM ಚಿಕಿತ್ಸಾ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಇಳಿಕೆ (p = 0.0172) ಕಂಡುಬಂದಿದೆ. ವಿಸ್ತೀರ್ಣ ಮತ್ತು ಸುತ್ತಳತೆಯಲ್ಲಿನ ಗಮನಾರ್ಹ ಕಡಿತಗಳು 5 mM PPA ಯೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಪಡೆದ ಜೀವಕೋಶಗಳು ಚಿಕ್ಕದಾದ, ಹೆಚ್ಚು ದುಂಡಗಿನ ಮೈಟೋಕಾಂಡ್ರಿಯಾವನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಮತ್ತು ಈ ಮೈಟೋಕಾಂಡ್ರಿಯಾ ನಿಯಂತ್ರಣ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿರುವುದಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಉದ್ದವಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ. ಇದು ಫೆರೆಟ್ ವ್ಯಾಸದಲ್ಲಿನ ಗಮನಾರ್ಹ ಇಳಿಕೆಗೆ ಸಹ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ, ಇದು ಕಣಗಳ ಅಂಚುಗಳ ನಡುವಿನ ದೊಡ್ಡ ಅಂತರದಲ್ಲಿನ ಇಳಿಕೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುವ ಸ್ವತಂತ್ರ ನಿಯತಾಂಕವಾಗಿದೆ. ಕ್ರಿಸ್ಟೆಯ ಅಲ್ಟ್ರಾಸ್ಟ್ರಕ್ಚರ್‌ನಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ: PPA ಒತ್ತಡದ ಪ್ರಭಾವದ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಕ್ರಿಸ್ಟೆ ಕಡಿಮೆ ಉಚ್ಚರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿತು (ಚಿತ್ರ 1a, ಪ್ಯಾನಲ್ B). ಆದಾಗ್ಯೂ, ಎಲ್ಲಾ ಚಿತ್ರಗಳು ಕ್ರಿಸ್ಟೆಯ ಅಲ್ಟ್ರಾಸ್ಟ್ರಕ್ಚರ್ ಅನ್ನು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿ ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸಲಿಲ್ಲ, ಆದ್ದರಿಂದ ಈ ಬದಲಾವಣೆಗಳ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಕೈಗೊಳ್ಳಲಾಗಿಲ್ಲ. ಈ TEM ಡೇಟಾ ಮೂರು ಸಂಭವನೀಯ ಸನ್ನಿವೇಶಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸಬಹುದು: (1) PPA ವಿದಳನವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ ಅಥವಾ ಸಮ್ಮಿಳನವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಅಸ್ತಿತ್ವದಲ್ಲಿರುವ ಮೈಟೋಕಾಂಡ್ರಿಯಾ ಗಾತ್ರದಲ್ಲಿ ಕುಗ್ಗಲು ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ; (2) ವರ್ಧಿತ ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪತ್ತಿಯು ಹೊಸ, ಸಣ್ಣ ಮೈಟೋಕಾಂಡ್ರಿಯಾವನ್ನು ಸೃಷ್ಟಿಸುತ್ತದೆ ಅಥವಾ (3) ಎರಡೂ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳನ್ನು TEM ನಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗದಿದ್ದರೂ, ಗಮನಾರ್ಹ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ಬದಲಾವಣೆಗಳು PPA ಒತ್ತಡದಲ್ಲಿ ಮೈಟೋಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಹೋಮಿಯೋಸ್ಟಾಸಿಸ್ ಮತ್ತು ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ. ಈ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಆಧಾರವಾಗಿರುವ ಸಂಭಾವ್ಯ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ನಿರೂಪಿಸಲು ನಾವು ತರುವಾಯ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ನಿಯತಾಂಕಗಳನ್ನು ಅನ್ವೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ.
ಪ್ರೊಪಿಯಾನಿಕ್ ಆಮ್ಲ (PPA) ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನವನ್ನು ಮರುರೂಪಿಸುತ್ತದೆ. (a) ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಗಾತ್ರವು ಕಡಿಮೆಯಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯವು ಹೆಚ್ಚುತ್ತಿರುವ PPA ಚಿಕಿತ್ಸೆಯೊಂದಿಗೆ ಚಿಕ್ಕದಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚು ದುಂಡಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುವ ಪ್ರತಿನಿಧಿ ಪ್ರಸರಣ ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ (TEM) ಚಿತ್ರಗಳು; ಕ್ರಮವಾಗಿ 0 mM (ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡದ), 3 mM ಮತ್ತು 5 mM. ಕೆಂಪು ಬಾಣಗಳು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ. (b–e) 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ PPA ಯೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಪಡೆದ SH-SY5Y ಕೋಶಗಳನ್ನು TEM ಗಾಗಿ ಸಿದ್ಧಪಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಫಿಜಿ/ಇಮೇಜ್‌ಜೆ ಬಳಸಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. ಎಂಟು ನಿಯತಾಂಕಗಳಲ್ಲಿ ನಾಲ್ಕು ನಿಯಂತ್ರಣ (ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡದ, 0 mM PPA) ಮತ್ತು ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ (3 mM ಮತ್ತು 5 mM PPA) ಕೋಶಗಳ ನಡುವಿನ ಗಮನಾರ್ಹ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಿವೆ. (b) ಪ್ರದೇಶ 2, (c) ಪ್ರದೇಶ, (d) ಪರಿಧಿ, (e) ಫೆರೆಟ್ ವ್ಯಾಸ. ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಏಕಮುಖ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (ನಿಯಂತ್ರಣ vs. ಚಿಕಿತ್ಸೆ) ಮತ್ತು ಡನೆಟ್‌ನ ಬಹು ಹೋಲಿಕೆ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಬಳಸಲಾಯಿತು (p < 0.05). ಡೇಟಾ ಬಿಂದುಗಳು ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಕೋಶಕ್ಕೆ ಸರಾಸರಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ದೋಷ ಪಟ್ಟಿಗಳು ಸರಾಸರಿ ± SEM ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ. ತೋರಿಸಿರುವ ದತ್ತಾಂಶವು n = 3 ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ, ಪ್ರತಿ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗೆ ಕನಿಷ್ಠ 24 ಕೋಶಗಳು; ಒಟ್ಟು 266 ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ; * p < 0.05 ಅನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ** p < 0.01 ಅನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ PPA ಗೆ ಹೇಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ನಿರೂಪಿಸಲು, ನಾವು ಟೆಟ್ರಾಮೀಥೈಲ್ರೋಡಮೈನ್ ಈಥೈಲ್ ಎಸ್ಟರ್ (TMRE) ನೊಂದಿಗೆ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾವನ್ನು ಬಣ್ಣಿಸಿದೆವು ಮತ್ತು 3 ಮತ್ತು 5 mM PPA ನಲ್ಲಿ 24 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾವನ್ನು ಸ್ಥಳೀಕರಿಸಲು ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲು ಟೈಮ್-ಲ್ಯಾಪ್ಸ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ ಮತ್ತು MEL ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ. ವಿದಳನ ಮತ್ತು ಸಮ್ಮಿಳನ ಘಟನೆಗಳ ಚಿಕಿತ್ಸೆ. (ಚಿತ್ರ 2a). MEL ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ನಂತರ, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ರಚನೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಸರಾಸರಿ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯವನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] ನಲ್ಲಿ ಸಂಭವಿಸುವ ವಿದಳನ ಘಟನೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿ ಸಣ್ಣ ಆದರೆ ಗಮನಾರ್ಹ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ [5.6 ± 0.3 (p < 0.05) )] ಮತ್ತು ಸಮ್ಮಿಳನ [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] ಮತ್ತು ಸಮ್ಮಿಳನ [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] ಘಟನೆಗಳು ನಿಯಂತ್ರಣಕ್ಕೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ 5 mM ನಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿವೆ (ಚಿತ್ರ 3b). 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] ಮತ್ತು 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (ಚಿತ್ರ 3c) ಎರಡರಲ್ಲೂ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾದ ಸಂಖ್ಯೆ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ಪ್ರತಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರಚನೆಯ ಸರಾಸರಿ ಪರಿಮಾಣವು ಬದಲಾಗದೆ ಉಳಿದಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3c). 3d). ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್‌ನ ಮರುರೂಪಿಸುವಿಕೆಯು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಜಾಲದ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಯಶಸ್ವಿಯಾಗಿ ನಿರ್ವಹಿಸುವ ಪರಿಹಾರ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಇದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. 3 mM PPA ನಲ್ಲಿ ವಿದಳನ ಘಟನೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿನ ಹೆಚ್ಚಳವು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿನ ಹೆಚ್ಚಳವು ಭಾಗಶಃ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ವಿದಳನದಿಂದಾಗಿ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಸರಾಸರಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಪರಿಮಾಣವು ಮೂಲಭೂತವಾಗಿ ಬದಲಾಗದೆ ಇರುವುದರಿಂದ, ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪತ್ತಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಪರಿಹಾರ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ ತಳ್ಳಿಹಾಕಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ಡೇಟಾವು TEM ನಿಂದ ಗಮನಿಸಲಾದ ಸಣ್ಣ, ಸುತ್ತಿನ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರಚನೆಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು PPA ನಿಂದ ಪ್ರೇರಿತವಾದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಸಹ ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತದೆ.
ಪ್ರೊಪಿಯಾನಿಕ್ ಆಮ್ಲ (PPA) ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಕಾಪಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು ಡೈನಾಮಿಕ್ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಮರುರೂಪಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ. SH-SY5Y ಕೋಶಗಳನ್ನು ಕಲ್ಚರ್ ಮಾಡಿ, 3 ಮತ್ತು 5 mM PPA ಯೊಂದಿಗೆ 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು TMRE ಮತ್ತು Hoechst 33342 ನೊಂದಿಗೆ ಬಣ್ಣ ಬಳಿಯಲಾಯಿತು, ನಂತರ MEL ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು. (a) ಪ್ರತಿ ಸ್ಥಿತಿಗೆ ಸಮಯ 2 (t2) ನಲ್ಲಿ ಬಣ್ಣ ಮತ್ತು ಬೈನರೈಸ್ಡ್ ಗರಿಷ್ಠ ತೀವ್ರತೆಯ ಪ್ರಕ್ಷೇಪಣಗಳನ್ನು ಚಿತ್ರಿಸುವ ಪ್ರತಿನಿಧಿ ಸಮಯ-ವಿಳಂಬ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕ ಚಿತ್ರಗಳು. ಪ್ರತಿ ಬೈನರಿ ಚಿತ್ರದಲ್ಲಿ ಸೂಚಿಸಲಾದ ಆಯ್ದ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ವರ್ಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕಾಲಾನಂತರದಲ್ಲಿ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ವಿವರಿಸಲು ಮೂರು ವಿಭಿನ್ನ ಸಮಯ ಚೌಕಟ್ಟುಗಳಲ್ಲಿ (t1-t3) 3D ಯಲ್ಲಿ ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ; ಸಮ್ಮಿಳನ ಘಟನೆಗಳನ್ನು ಹಸಿರು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ; ವಿದಳನ ಘಟನೆಗಳನ್ನು ಹಸಿರು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. (b) ಸ್ಥಿತಿಗೆ ಡೈನಾಮಿಕ್ ಘಟನೆಗಳ ಸರಾಸರಿ ಸಂಖ್ಯೆ. (c) ಪ್ರತಿ ಕೋಶಕ್ಕೆ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರಚನೆಗಳ ಸರಾಸರಿ ಸಂಖ್ಯೆ. (d) ಪ್ರತಿ ಕೋಶಕ್ಕೆ ಪ್ರತಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರಚನೆಯ ಸರಾಸರಿ ಪರಿಮಾಣ (µm3). ತೋರಿಸಲಾದ ಡೇಟಾವು ಚಿಕಿತ್ಸಾ ಗುಂಪಿಗೆ n = 15 ಕೋಶಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. ತೋರಿಸಲಾದ ದೋಷ ಬಾರ್‌ಗಳು ಸರಾಸರಿ ± SEM ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ, ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್ = 10 μm, * p < 0.05.
ಪ್ರೊಪಿಯಾನಿಕ್ ಆಮ್ಲ (PPA) ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್‌ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಜೀನ್‌ಗಳ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ನಿಗ್ರಹಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. SH-SY5Y ಕೋಶಗಳನ್ನು 3 ಮತ್ತು 5 mM PPA ಯೊಂದಿಗೆ 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಲಾಯಿತು. RT-qPCR ಬಳಸಿ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಜೀನ್ ಪರಿಮಾಣೀಕರಣವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು B2M ಗೆ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಲಾಯಿತು. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಬಯೋಜೆನೆಸಿಸ್ ಜೀನ್‌ಗಳು (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 ಮತ್ತು (d) NFE2L2. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಸಮ್ಮಿಳನ ಮತ್ತು ವಿದಳನ ಜೀನ್‌ಗಳು (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 ಮತ್ತು (i) DRP1. ಗಮನಾರ್ಹ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳು (p < 0.05) ಅನ್ನು ಏಕ-ಮಾರ್ಗ ANOVA (ನಿಯಂತ್ರಣ vs. ಚಿಕಿತ್ಸೆ) ಮತ್ತು ಡನೆಟ್‌ನ ಬಹು ಹೋಲಿಕೆ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು: * p < 0.05 ಅನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ** p < 0.01 ಅನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು **** p < 0.0001 ಅನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಬಾರ್‌ಗಳು ಸರಾಸರಿ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ± SEM ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ. ತೋರಿಸಲಾದ ದತ್ತಾಂಶವು n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), ಮತ್ತು n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ.
TEM ಮತ್ತು MEL ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳ ದತ್ತಾಂಶವು PPA ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ಮತ್ತು ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರವನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ತಂತ್ರಗಳು ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಚಾಲನೆ ಮಾಡುವ ಆಧಾರವಾಗಿರುವ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ಒಳನೋಟವನ್ನು ಒದಗಿಸುವುದಿಲ್ಲ. ಆದ್ದರಿಂದ PPA ಚಿಕಿತ್ಸೆಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್, ಬಯೋಜೆನೆಸಿಸ್ ಮತ್ತು ಮೈಟೋಸಿಸ್‌ನ ಒಂಬತ್ತು ಪ್ರಮುಖ ನಿಯಂತ್ರಕಗಳ mRNA ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ನಾವು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ. 3 mM ಮತ್ತು 5 mM PPA ಯೊಂದಿಗೆ 24 ಗಂಟೆಗಳ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ನಂತರ ನಾವು ಸೆಲ್ ಮೈಲೋಮಾ ಆಂಕೊಜೀನ್ (cMYC), ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ಉಸಿರಾಟದ ಅಂಶ (NRF1), ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಅಂಶ 1 (TFAM), NFE2-ತರಹದ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಅಂಶ BZIP (NFE2L2), ಗ್ಯಾಸ್ಟ್ರಿನ್-ತರಹದ ಪ್ರೋಟೀನ್ 2 (STOML2), ಆಪ್ಟಿಕ್ ನರ ಕ್ಷೀಣತೆ 1 (OPA1), ಮೈಟೊಫುಸಿನ್ 1 (MFN1), ಮೈಟೊಫುಸಿನ್ 2 (MFN2) ಮತ್ತು ಡೈನಮಿನ್-ಸಂಬಂಧಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್ 1 (DRP1) ಅನ್ನು ಪರಿಮಾಣೀಕರಿಸಿದ್ದೇವೆ. ನಾವು 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 ಮತ್ತು p < 0.0001, ಕ್ರಮವಾಗಿ) ಮತ್ತು 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) PPA ಚಿಕಿತ್ಸೆಯನ್ನು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ. (ಚಿತ್ರ 3a–c). mRNA ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಲ್ಲಿನ ಇಳಿಕೆ ಡೋಸ್-ಅವಲಂಬಿತವಾಗಿತ್ತು: cMYC, NRF1 ಮತ್ತು TFAM ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ 3 mM ನಲ್ಲಿ ಕ್ರಮವಾಗಿ 5.7, 2.6 ಮತ್ತು 1.9 ಬಾರಿ ಮತ್ತು 5 mM ನಲ್ಲಿ 11.2, 3 ಮತ್ತು 2.2 ಬಾರಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ. ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, PPA ಯ ಯಾವುದೇ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರ ರೆಡಾಕ್ಸ್ ಬಯೋಜೆನೆಸಿಸ್ ಜೀನ್ NFE2L2 ಅನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ, ಆದಾಗ್ಯೂ ಕಡಿಮೆಯಾದ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಇದೇ ರೀತಿಯ ಡೋಸ್-ಅವಲಂಬಿತ ಪ್ರವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3d).
ವಿದಳನ ಮತ್ತು ಸಮ್ಮಿಳನದ ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ಜೀನ್‌ಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಸಹ ನಾವು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ. STOML2 ಸಮ್ಮಿಳನ, ಮೈಟೊಫ್ಯಾಜಿ ಮತ್ತು ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪಾದನೆಯಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿಸಿಕೊಂಡಿದೆ ಎಂದು ಭಾವಿಸಲಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಅದರ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ (p < 0.0001) 3 mM (2.4-ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆ) ಮತ್ತು 5 mM (2.8-ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆ) PPA (ಚಿತ್ರ 1). 3d). ಅದೇ ರೀತಿ, OPA1 ಸಮ್ಮಿಳನ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು 3 mM (1.6-ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆ) ಮತ್ತು 5 mM (1.9-ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆ) PPA (ಕ್ರಮವಾಗಿ p = 0.006 ಮತ್ತು p = 0.0024) ನಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3f). ಆದಾಗ್ಯೂ, 24-h PPA ಒತ್ತಡದ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ (ಚಿತ್ರ 3g–i) ಸಮ್ಮಿಳನ ಜೀನ್‌ಗಳು MFN1, MFN2 ಅಥವಾ ವಿದಳನ ಜೀನ್ DRP1 ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಲ್ಲಿ ನಮಗೆ ಗಮನಾರ್ಹ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳು ಕಂಡುಬಂದಿಲ್ಲ. ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ನಾಲ್ಕು ಸಮ್ಮಿಳನ ಮತ್ತು ವಿದಳನ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ (OPA1, MFN1, MFN2 ಮತ್ತು DRP1) ಮಟ್ಟಗಳು ಒಂದೇ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಬದಲಾಗಲಿಲ್ಲ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 4a–d). ಈ ಡೇಟಾವು ಒಂದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಒಂದು ಬಿಂದುವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು PPA ಒತ್ತಡದ ಆರಂಭಿಕ ಹಂತಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಅಥವಾ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸದಿರಬಹುದು ಎಂಬುದನ್ನು ಗಮನಿಸುವುದು ಮುಖ್ಯ. ಆದಾಗ್ಯೂ, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, ಮತ್ತು OPA1 ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಲ್ಲಿನ ಗಮನಾರ್ಹ ಕಡಿತವು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಯಾಪಚಯ, ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪತ್ತಿ ಮತ್ತು ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್‌ನ ಗಮನಾರ್ಹ ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ಅನಿಯಂತ್ರಣವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಈ ಡೇಟಾವು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಕಾರ್ಯದಲ್ಲಿ ಅಂತಿಮ-ಸ್ಥಿತಿಯ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಇಮೇಜಿಂಗ್ ತಂತ್ರಗಳ ಉಪಯುಕ್ತತೆಯನ್ನು ಎತ್ತಿ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.
ಪ್ರೊಪಿಯಾನಿಕ್ ಆಮ್ಲ (PPA) ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ನಂತರ ಸಮ್ಮಿಳನ ಮತ್ತು ವಿದಳನ ಅಂಶ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮಟ್ಟಗಳು ಬದಲಾಗಲಿಲ್ಲ. SH-SY5Y ಕೋಶಗಳನ್ನು 3 ಮತ್ತು 5 mM PPA ಯೊಂದಿಗೆ 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಲಾಯಿತು. ವೆಸ್ಟರ್ನ್ ಬ್ಲಾಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಒಟ್ಟು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗೆ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಲಾಯಿತು. ಸರಾಸರಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮತ್ತು ಗುರಿ ಮತ್ತು ಒಟ್ಟು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಪ್ರತಿನಿಧಿ ಪಾಶ್ಚಿಮಾತ್ಯ ಬ್ಲಾಟ್‌ಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. ಬಾರ್‌ಗಳು ಸರಾಸರಿ ± SEM ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ತೋರಿಸಲಾದ ಡೇಟಾ n = 3 ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಏಕಮುಖ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು ಡನೆಟ್‌ನ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಬಹು ಹೋಲಿಕೆಗಳನ್ನು (p < 0.05) ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಮೂಲ ಜೆಲ್ ಮತ್ತು ಬ್ಲಾಟ್ ಅನ್ನು ಚಿತ್ರ S1 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯು ಚಯಾಪಚಯ, ಹೃದಯರಕ್ತನಾಳ ಮತ್ತು ಸ್ನಾಯು ಕಾಯಿಲೆಗಳಿಂದ ಹಿಡಿದು ನರವೈಜ್ಞಾನಿಕ ಕಾಯಿಲೆಗಳವರೆಗೆ ಬಹುವ್ಯವಸ್ಥೆಯ ಕಾಯಿಲೆಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ1,10. ಅನೇಕ ನರಕ್ಷೀಣ ಮತ್ತು ನರಕ್ಷೀಣ ಕಾಯಿಲೆಗಳು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿವೆ, ಇದು ಮೆದುಳಿನ ಜೀವಿತಾವಧಿಯಲ್ಲಿ ಈ ಅಂಗಕಗಳ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ಎತ್ತಿ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ರೋಗಗಳಲ್ಲಿ ಪಾರ್ಕಿನ್ಸನ್ ಕಾಯಿಲೆ, ಆಲ್ಝೈಮರ್ ಕಾಯಿಲೆ ಮತ್ತು ASD3,4,18 ಸೇರಿವೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ರೋಗಗಳನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಮೆದುಳಿನ ಅಂಗಾಂಶಕ್ಕೆ ಪ್ರವೇಶವು ಕಷ್ಟಕರವಾಗಿದೆ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಯಾಂತ್ರಿಕ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ, ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಮಾದರಿ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳನ್ನು ಅಗತ್ಯ ಪರ್ಯಾಯವನ್ನಾಗಿ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ, ನರಕೋಶದ ಕಾಯಿಲೆಗಳಲ್ಲಿ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಆಟಿಸಂ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್ ಅಸ್ವಸ್ಥತೆಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಮರುಸೃಷ್ಟಿಸಲು ನಾವು PPA-ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಪಡೆದ SH-SY5Y ಕೋಶಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಮಾದರಿ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಬಳಸುತ್ತೇವೆ. ನರಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಈ PPA ಮಾದರಿಯನ್ನು ಬಳಸುವುದರಿಂದ ASD ಯ ಕಾರಣಶಾಸ್ತ್ರದ ಬಗ್ಗೆ ಒಳನೋಟವನ್ನು ಒದಗಿಸಬಹುದು.
ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನದಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ವೀಕ್ಷಿಸಲು TEM ಅನ್ನು ಬಳಸುವ ಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ನಾವು ಅನ್ವೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಅದರ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿತ್ವವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು TEM ಅನ್ನು ಸರಿಯಾಗಿ ಬಳಸಬೇಕು ಎಂಬುದನ್ನು ಗಮನಿಸುವುದು ಮುಖ್ಯ. ಕ್ರಯೋ-ಮಾದರಿಗಳ ತಯಾರಿಕೆಯು ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಘಟಕಗಳನ್ನು ಸರಿಪಡಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು ಕಲಾಕೃತಿಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ನರಕೋಶದ ರಚನೆಗಳ ಉತ್ತಮ ಸಂರಕ್ಷಣೆಗೆ ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ34. ಇದಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, ನರಕೋಶದಂತಹ SH-SY5Y ಜೀವಕೋಶಗಳು ಅಖಂಡ ಉಪಕೋಶೀಯ ಅಂಗಕಗಳು ಮತ್ತು ಉದ್ದವಾದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾವನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 1a). ನರಕೋಶದ ಕೋಶ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನವನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಕ್ರಯೋಜೆನಿಕ್ ತಯಾರಿ ತಂತ್ರಗಳ ಉಪಯುಕ್ತತೆಯನ್ನು ಇದು ಎತ್ತಿ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. TEM ಡೇಟಾದ ವಸ್ತುನಿಷ್ಠ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಅಳತೆಗಳು ನಿರ್ಣಾಯಕವಾಗಿದ್ದರೂ, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸಲು ಯಾವ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ನಿಯತಾಂಕಗಳನ್ನು ಅಳೆಯಬೇಕು ಎಂಬುದರ ಕುರಿತು ಇನ್ನೂ ಒಮ್ಮತವಿಲ್ಲ. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನವನ್ನು ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಅಧ್ಯಯನಗಳ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ, ನಾವು ಎಂಟು ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ನಿಯತಾಂಕಗಳನ್ನು ಅಳೆಯುವ ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಿತ್ರ ವಿಶ್ಲೇಷಣಾ ಪೈಪ್‌ಲೈನ್ ಅನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಅವುಗಳೆಂದರೆ: ಪ್ರದೇಶ, ಪ್ರದೇಶ2, ಆಕಾರ ಅನುಪಾತ, ಪರಿಧಿ, ವೃತ್ತಾಕಾರತೆ, ಪದವಿ, ಫೆರೆಟ್ ವ್ಯಾಸ. ಮತ್ತು ಸುತ್ತಳತೆ.
ಅವುಗಳಲ್ಲಿ, PPA ಪ್ರದೇಶ 2, ವಿಸ್ತೀರ್ಣ, ಪರಿಧಿ ಮತ್ತು ಫೆರೆಟ್ ವ್ಯಾಸವನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿತು (ಚಿತ್ರ 1b–e). ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚು ದುಂಡಾಗಿದೆ ಎಂದು ಇದು ತೋರಿಸಿದೆ, ಇದು PPA30-ಪ್ರೇರಿತ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಒತ್ತಡದ 72 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಇಳಿಕೆಯನ್ನು ತೋರಿಸುವ ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ. ಈ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನದ ಲಕ್ಷಣಗಳು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ವಿದಳನವನ್ನು ಸೂಚಿಸಬಹುದು, ಇದು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್‌ನಿಂದ ಹಾನಿಗೊಳಗಾದ ಘಟಕಗಳನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸಲು ಮೈಟೊಫ್ಯಾಜಿ 35,36,37 ಮೂಲಕ ಅವುಗಳ ಅವನತಿಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಲು ಅಗತ್ಯವಾದ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿದೆ. ಮತ್ತೊಂದೆಡೆ, ಸರಾಸರಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಗಾತ್ರದಲ್ಲಿನ ಇಳಿಕೆ ಹೆಚ್ಚಿದ ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪತ್ತಿಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿರಬಹುದು, ಇದು ಸಣ್ಣ ಹೊಸ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ರಚನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. ಹೆಚ್ಚಿದ ವಿದಳನ ಅಥವಾ ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪತ್ತಿಯು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಒತ್ತಡದ ವಿರುದ್ಧ ಮೈಟೊಸಿಸ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ಸರಿದೂಗಿಸುವ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಕಡಿಮೆಯಾದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಬೆಳವಣಿಗೆ, ದುರ್ಬಲಗೊಂಡ ಸಮ್ಮಿಳನ ಅಥವಾ ಇತರ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳನ್ನು ಹೊರಗಿಡಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ.
TEM ನಿಂದ ರಚಿಸಲಾದ ಹೆಚ್ಚಿನ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ಚಿತ್ರಗಳು ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆಯಾದರೂ, ಈ ವಿಧಾನವು ಒಂದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಎರಡು ಆಯಾಮದ ಸ್ನ್ಯಾಪ್‌ಶಾಟ್‌ಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ. ಚಯಾಪಚಯ ಒತ್ತಡಕ್ಕೆ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು, ನಾವು TMRE ಯೊಂದಿಗೆ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾವನ್ನು ಬಣ್ಣಿಸಿದೆ ಮತ್ತು MEL ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯೊಂದಿಗೆ ಟೈಮ್-ಲ್ಯಾಪ್ಸ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿಯನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಕಾಲಾನಂತರದಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್‌ನಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳ ಹೆಚ್ಚಿನ-ಥ್ರೂಪುಟ್ 3D ದೃಶ್ಯೀಕರಣವನ್ನು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ33,38. PPA ಒತ್ತಡದ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಸೂಕ್ಷ್ಮವಾದ ಆದರೆ ಗಮನಾರ್ಹ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 2). 3 mM ನಲ್ಲಿ, ವಿದಳನ ಘಟನೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಾಯಿತು, ಆದರೆ ಸಮ್ಮಿಳನ ಘಟನೆಗಳು ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿದ್ದಂತೆಯೇ ಉಳಿದವು. 5 mM PPA ನಲ್ಲಿ ವಿದಳನ ಮತ್ತು ಸಮ್ಮಿಳನ ಘಟನೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಯಿತು, ಆದರೆ ಈ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಸರಿಸುಮಾರು ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿದ್ದವು, ವಿದಳನ ಮತ್ತು ಸಮ್ಮಿಳನ ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರವು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ ಸಮತೋಲನವನ್ನು ತಲುಪುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 2b). ಸರಾಸರಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಪರಿಮಾಣವು 3 ಮತ್ತು 5 mM PPA ಎರಡರಲ್ಲೂ ಬದಲಾಗದೆ ಉಳಿಯಿತು, ಇದು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್‌ನ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಸಂರಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 2d). ಇದು ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಜಾಲಗಳು ಸೌಮ್ಯವಾದ ಚಯಾಪಚಯ ಒತ್ತಡಕ್ಕೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಜಾಲ ವಿಭಜನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗದೆ ಹೋಮಿಯೋಸ್ಟಾಸಿಸ್ ಅನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ. 3 mM PPA ನಲ್ಲಿ, ವಿದಳನದಲ್ಲಿನ ಹೆಚ್ಚಳವು ಹೊಸ ಸಮತೋಲನಕ್ಕೆ ಪರಿವರ್ತನೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಲು ಸಾಕಾಗುತ್ತದೆ, ಆದರೆ PPA ಯ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ಒತ್ತಡಕ್ಕೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ ಹೆಚ್ಚು ಆಳವಾದ ಚಲನಶೀಲ ಮರುರೂಪಿಸುವಿಕೆಯ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.
PPA ಒತ್ತಡ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾದ ಸಂಖ್ಯೆ ಹೆಚ್ಚಾಯಿತು, ಆದರೆ ಸರಾಸರಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಪರಿಮಾಣವು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಬದಲಾಗಲಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 2c). ಇದು ಹೆಚ್ಚಿದ ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪತ್ತಿ ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿದ ವಿಭಜನೆಯಿಂದಾಗಿರಬಹುದು; ಆದಾಗ್ಯೂ, ಸರಾಸರಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಪರಿಮಾಣದಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಇಳಿಕೆ ಇಲ್ಲದಿದ್ದಾಗ, ಜೈವಿಕ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ ಹೆಚ್ಚಾಗುವ ಸಾಧ್ಯತೆ ಹೆಚ್ಚು. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಚಿತ್ರ 2 ರಲ್ಲಿನ ದತ್ತಾಂಶವು ಎರಡು ಪರಿಹಾರಕ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ಅಸ್ತಿತ್ವವನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತದೆ: ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ವಿದಳನದ ಅಪ್‌ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್‌ಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ವಿದಳನ ಘಟನೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿನ ಹೆಚ್ಚಳ ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪತ್ತಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಘಟನೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿನ ಹೆಚ್ಚಳ. ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಸೌಮ್ಯ ಒತ್ತಡಕ್ಕೆ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಪರಿಹಾರವು ವಿದಳನ, ಸಮ್ಮಿಳನ, ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪತ್ತಿ ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡ ಏಕಕಾಲಿಕ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರಬಹುದು. ಹಿಂದಿನ ಲೇಖಕರು PPA ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ವಿದಳನವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದ್ದರೂ 30,39 ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ಕುರಿತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಒಳನೋಟವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.
TEM ಅಥವಾ MEL ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಗಮನಿಸಿದ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ಬದಲಾವಣೆಗಳಿಗೆ ಆಧಾರವಾಗಿರುವ ಜೀನ್ ನಿಯಂತ್ರಕ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ನೇರ ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸದ ಕಾರಣ, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಯಾಪಚಯ, ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪತ್ತಿ ಮತ್ತು ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರದಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಜೀನ್‌ಗಳ RNA ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ನಾವು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ. cMYC ಪ್ರೋಟೋ-ಆಂಕೋಜೀನ್ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯ, ಗ್ಲೈಕೋಲಿಸಿಸ್, ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ಮತ್ತು ಕೊಬ್ಬಿನಾಮ್ಲ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಅಂಶವಾಗಿದೆ. ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, NRF1 ಮತ್ತು TFAM41 ಸೇರಿದಂತೆ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಪ್ರತಿಲೇಖನ, ಅನುವಾದ ಮತ್ತು ಸಂಕೀರ್ಣ ಜೋಡಣೆಯಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಸುಮಾರು 600 ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಜೀನ್‌ಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು cMYC ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತಿಳಿದುಬಂದಿದೆ. NRF1 ಮತ್ತು TFAM ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಪ್ರತಿಲೇಖನವನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲು PGC-1α ನ ಕೆಳಗೆ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುವ ಮೈಟೊಸಿಸ್‌ನ ಎರಡು ಕೇಂದ್ರ ನಿಯಂತ್ರಕಗಳಾಗಿವೆ. ಈ ಮಾರ್ಗವನ್ನು cAMP ಮತ್ತು AMPK ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ನಿಂದ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಶಕ್ತಿಯ ಖರ್ಚು ಮತ್ತು ಚಯಾಪಚಯ ಒತ್ತಡಕ್ಕೆ ಸೂಕ್ಷ್ಮವಾಗಿರುತ್ತದೆ. PPA ಯ ಪರಿಣಾಮಗಳು ಆಕ್ಸಿಡೇಟಿವ್ ಒತ್ತಡದಿಂದ ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ವಹಿಸಬಹುದೇ ಎಂದು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪತ್ತಿಯ ರೆಡಾಕ್ಸ್ ನಿಯಂತ್ರಕ NFE2L2 ಅನ್ನು ಸಹ ನಾವು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ.
NFE2L2 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಬದಲಾಗದೆ ಇದ್ದರೂ, 3 mM ಮತ್ತು 5 mM PPA ಯೊಂದಿಗೆ 24 ಗಂಟೆಗಳ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ನಂತರ cMYC, NRF1 ಮತ್ತು TFAM ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಲ್ಲಿ ಸ್ಥಿರವಾದ ಡೋಸ್-ಅವಲಂಬಿತ ಇಳಿಕೆ ಕಂಡುಬಂದಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3a–c). ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಒತ್ತಡಕ್ಕೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ cMYC ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಡೌನ್‌ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ಈ ಹಿಂದೆ ವರದಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ 42, ಮತ್ತು ಇದಕ್ಕೆ ವಿರುದ್ಧವಾಗಿ, cMYC ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಡೌನ್‌ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಯಾಪಚಯ, ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್ ಸಂಪರ್ಕ ಮತ್ತು ಪೊರೆಯ ಧ್ರುವೀಕರಣವನ್ನು ಮರುರೂಪಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು 43. ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, cMYC ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ವಿದಳನ ಮತ್ತು ಸಮ್ಮಿಳನದ ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿಯೂ ತೊಡಗಿಸಿಕೊಂಡಿದೆ 42,43 ಮತ್ತು ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ DRP1 ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಸ್ಥಳೀಕರಣವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತಿಳಿದುಬಂದಿದೆ, ಜೊತೆಗೆ ನರಕೋಶದ ಕಾಂಡಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನದ ಮರುರೂಪಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ವಹಿಸುತ್ತದೆ 45. ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, cMYC-ಕೊರತೆಯ ಫೈಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟ್‌ಗಳು PPA43 ಒತ್ತಡದಿಂದ ಪ್ರೇರಿತವಾದ ಬದಲಾವಣೆಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಗಾತ್ರವನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತವೆ. ಈ ಡೇಟಾವು cMYC ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ನಡುವಿನ ಆಸಕ್ತಿದಾಯಕ ಆದರೆ ಇನ್ನೂ ಅಸ್ಪಷ್ಟ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ವಿವರಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು PPA ಒತ್ತಡ-ಪ್ರೇರಿತ ಮರುರೂಪಿಸುವಿಕೆಯ ಭವಿಷ್ಯದ ಅಧ್ಯಯನಗಳಿಗೆ ಆಸಕ್ತಿದಾಯಕ ಗುರಿಯನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.
NRF1 ಮತ್ತು TFAM ನ ಕಡಿತವು ಪ್ರಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಆಕ್ಟಿವೇಟರ್ ಆಗಿ cMYC ಯ ಪಾತ್ರಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿದೆ. ಈ ಡೇಟಾವು ಮಾನವ ಕೊಲೊನ್ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿನ ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ, ಇದು PPA 22 ಗಂಟೆಗಳಲ್ಲಿ NRF1 mRNA ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ATP ಸವಕಳಿ ಮತ್ತು ROS46 ಹೆಚ್ಚಳಕ್ಕೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ. ಈ ಲೇಖಕರು TFAM ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ 8.5 ಗಂಟೆಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ ಆದರೆ 22 ಗಂಟೆಗಳಲ್ಲಿ ಮೂಲ ಮಟ್ಟಕ್ಕೆ ಮರಳಿದೆ ಎಂದು ವರದಿ ಮಾಡಿದ್ದಾರೆ. ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, ಕಿಮ್ ಮತ್ತು ಇತರರು (2019) SH-SY5Y ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ 4 ಗಂಟೆಗಳ PPA ಒತ್ತಡದ ನಂತರ TFAM mRNA ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದರು; ಆದಾಗ್ಯೂ, 72 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ, TFAM ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ ಮತ್ತು mtDNA ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ. ಹೀಗಾಗಿ, 24 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿನ ಇಳಿಕೆಯು ಹಿಂದಿನ ಸಮಯದ ಹಂತಗಳಲ್ಲಿ ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪಾದನೆಯ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿನ ಹೆಚ್ಚಳವು ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ ಎಂಬ ಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸುವುದಿಲ್ಲ. ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳು PPA 4 ಗಂಟೆ 30 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ SH-SY5Y ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ PGC-1α mRNA ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿವೆ, ಆದರೆ ಪ್ರೊಪಿಯಾನಿಕ್ ಆಮ್ಲವು 12 ಗಂಟೆ 39 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ PGC-1α ಮೂಲಕ ಕರು ಹೆಪಟೊಸೈಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪತ್ತಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ. ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, PGC-1α NRF1 ಮತ್ತು TFAM ನ ನೇರ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ನಿಯಂತ್ರಕ ಮಾತ್ರವಲ್ಲದೆ, ವಿದಳನ ಮತ್ತು ಸಮ್ಮಿಳನವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಮೂಲಕ MFN2 ಮತ್ತು DRP1 ನ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಒಟ್ಟಿಗೆ ತೆಗೆದುಕೊಂಡರೆ, ಇದು PPA ನಿಂದ ಪ್ರೇರಿತವಾದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಪರಿಹಾರ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ನಿಕಟ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು ಎತ್ತಿ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಇದಲ್ಲದೆ, ನಮ್ಮ ಡೇಟಾವು PPA ಒತ್ತಡದಲ್ಲಿ ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪತ್ತಿ ಮತ್ತು ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ನಿಯಂತ್ರಣದ ಗಮನಾರ್ಹ ಅನಿಯಂತ್ರಣವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆ.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 ಮತ್ತು DRP1 ಜೀನ್‌ಗಳು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ವಿದಳನ, ಸಮ್ಮಿಳನ ಮತ್ತು ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್‌ನ ಕೇಂದ್ರ ನಿಯಂತ್ರಕಗಳಲ್ಲಿ ಸೇರಿವೆ37,48,49. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಇತರ ಅನೇಕ ಜೀನ್‌ಗಳಿವೆ, ಆದಾಗ್ಯೂ, STOML2, OPA1 ಮತ್ತು MFN2 ಗಳು ASD ಸಮೂಹಗಳಲ್ಲಿ ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿ ಮೀಥೈಲೇಟೆಡ್ ಆಗಿರುವುದು ಈ ಹಿಂದೆ ಕಂಡುಬಂದಿದೆ,16 ಮತ್ತು ಹಲವಾರು ಸ್ವತಂತ್ರ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಒತ್ತಡಕ್ಕೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ ಈ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಅಂಶಗಳಲ್ಲಿ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ವರದಿ ಮಾಡಿವೆ50,51. 52. OPA1 ಮತ್ತು STOML2 ಎರಡರ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು 3 mM ಮತ್ತು 5 mM PPA ಚಿಕಿತ್ಸೆಯಿಂದ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3e, f). OPA1 MFN1 ಮತ್ತು 2 ರೊಂದಿಗಿನ ನೇರ ಸಂವಹನದ ಮೂಲಕ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಸಮ್ಮಿಳನದ ಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ನಿಯಂತ್ರಕಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಕ್ರಿಸ್ಟೇ ಮರುರೂಪಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನದಲ್ಲಿ ಪಾತ್ರವನ್ನು ವಹಿಸುತ್ತದೆ53. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ STOML2 ನ ನಿಖರವಾದ ಪಾತ್ರವು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿಲ್ಲ, ಆದರೆ ಪುರಾವೆಗಳು ಇದು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಸಮ್ಮಿಳನ, ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪಾದನೆ ಮತ್ತು ಮೈಟೊಫ್ಯಾಜಿಯಲ್ಲಿ ಪಾತ್ರವನ್ನು ವಹಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
STOML2 ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಉಸಿರಾಟದ ಜೋಡಣೆ ಮತ್ತು ಉಸಿರಾಟದ ಸರಪಳಿ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುವಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿಸಿಕೊಂಡಿದೆ54,55 ಮತ್ತು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳ ಚಯಾಪಚಯ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಆಳವಾಗಿ ಬದಲಾಯಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ56. BAN ಮತ್ತು ಕಾರ್ಡಿಯೋಲಿಪಿನ್ 55, 57, 58 ರೊಂದಿಗಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯ ಮೂಲಕ STOML2 ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಪೊರೆಯ ಸಾಮರ್ಥ್ಯ ಮತ್ತು ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಅಧ್ಯಯನಗಳು ತೋರಿಸಿವೆ. ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, STOML2 ಮತ್ತು PINK1 ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯು ಮೈಟೊಫೇಜಿಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸ್ವತಂತ್ರ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ತೋರಿಸಿವೆ59,60. ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, STOML2 MFN2 ನೊಂದಿಗೆ ನೇರವಾಗಿ ಸಂವಹನ ನಡೆಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ವರದಿಯಾಗಿದೆ ಮತ್ತು OPA1 ಅವನತಿಗೆ ಕಾರಣವಾದ ಪ್ರೋಟಿಯೇಸ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುವ ಮೂಲಕ ದೀರ್ಘ OPA1 ಐಸೋಫಾರ್ಮ್‌ಗಳನ್ನು ಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸುವಲ್ಲಿ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರ ವಹಿಸುತ್ತದೆ53,61,62. PPA ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ STOML2 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಲ್ಲಿನ ಕಡಿತವು ಈ ಸಮ್ಮಿಳನ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಯುಬಿಕ್ವಿಟಿನ್- ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟಿಯೋಸೋಮ್-ಅವಲಂಬಿತ ಮಾರ್ಗಗಳ ಮೂಲಕ ಅವನತಿಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಒಳಗಾಗುವಂತೆ ಮಾಡಬಹುದು48. PPA ಗೆ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ STOML2 ಮತ್ತು OPA1 ಗಳ ನಿಖರವಾದ ಪಾತ್ರವು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿಲ್ಲವಾದರೂ, ಈ ಸಮ್ಮಿಳನ ಜೀನ್‌ಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗುವುದರಿಂದ (ಚಿತ್ರ 3) ವಿದಳನ ಮತ್ತು ಸಮ್ಮಿಳನದ ನಡುವಿನ ಸಮತೋಲನವನ್ನು ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಗಾತ್ರ ಕಡಿಮೆಯಾಗಲು ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು (ಚಿತ್ರ 3). 1).
ಮತ್ತೊಂದೆಡೆ, 24 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ OPA1 ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಬದಲಾಗದೆ ಉಳಿಯಿತು, ಆದರೆ PPA ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ನಂತರ MFN1, MFN2 ಅಥವಾ DRP1 ನ mRNA ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮಟ್ಟಗಳು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಬದಲಾಗಲಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 3g-i, ಚಿತ್ರ 4). ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಸಮ್ಮಿಳನ ಮತ್ತು ವಿದಳನದಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಈ ಅಂಶಗಳ ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಬದಲಾವಣೆಗಳಿಲ್ಲ ಎಂದು ಇದು ಸೂಚಿಸಬಹುದು. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ನಾಲ್ಕು ಜೀನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಯೊಂದನ್ನು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಪೋಸ್ಟ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಷನಲ್ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳು (PTM ಗಳು) ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತವೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಗಮನಿಸಬೇಕಾದ ಸಂಗತಿ. OPA1 ಎಂಟು ಪರ್ಯಾಯ ಸ್ಪ್ಲೈಸ್ ರೂಪಾಂತರಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದು, ಅವು ಎರಡು ವಿಭಿನ್ನ ಐಸೋಫಾರ್ಮ್‌ಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟಿಯೋಲೈಟಿಕಲ್ ಆಗಿ ಸೀಳಲ್ಪಟ್ಟಿವೆ 63. ದೀರ್ಘ ಮತ್ತು ಸಣ್ಣ ಐಸೋಫಾರ್ಮ್‌ಗಳ ನಡುವಿನ ಸಮತೋಲನವು ಅಂತಿಮವಾಗಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಸಮ್ಮಿಳನ ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್‌ನ ನಿರ್ವಹಣೆಯಲ್ಲಿ OPA1 ಪಾತ್ರವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುತ್ತದೆ64. DRP1 ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಕ್ಯಾಲ್ಸಿಯಂ/ಕ್ಯಾಲ್ಮೊಡ್ಯುಲಿನ್-ಅವಲಂಬಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕೈನೇಸ್ II (CaMKII) ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಮೂಲಕ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಆದರೆ DRP1 ಅವನತಿಯನ್ನು ಯುಬಿಕ್ವಿಟಿನೇಷನ್ ಮತ್ತು SUMOylation65 ಮೂಲಕ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಅಂತಿಮವಾಗಿ, DRP1 ಮತ್ತು MFN1/2 ಎರಡೂ GTPases ಆಗಿರುತ್ತವೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಚಟುವಟಿಕೆಯು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾದಲ್ಲಿನ GTP ಉತ್ಪಾದನೆಯ ದರದಿಂದ ಪ್ರಭಾವಿತವಾಗಿರುತ್ತದೆ 66. ಆದ್ದರಿಂದ, ಈ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದ್ದರೂ, ಇದು ಬದಲಾಗದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಚಟುವಟಿಕೆ ಅಥವಾ ಸ್ಥಳೀಕರಣವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸದಿರಬಹುದು67,68. ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ಅಸ್ತಿತ್ವದಲ್ಲಿರುವ PTM ಪ್ರೋಟೀನ್ ರೆಪರ್ಟರಿಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ತೀವ್ರವಾದ ಒತ್ತಡದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ವಹಿಸುವ ಜವಾಬ್ದಾರಿಯುತ ಮೊದಲ ಸಾಲಿನ ರಕ್ಷಣೆಯಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತವೆ. ನಮ್ಮ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಮಧ್ಯಮ ಚಯಾಪಚಯ ಒತ್ತಡದ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ, mRNA ಅಥವಾ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ಈ ಜೀನ್‌ಗಳ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯ ಅಗತ್ಯವಿಲ್ಲದೆ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಸಮಗ್ರತೆಯನ್ನು ಸಾಕಷ್ಟು ಪುನಃಸ್ಥಾಪಿಸಲು PTM ಸಮ್ಮಿಳನ ಮತ್ತು ವಿದಳನ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಹೆಚ್ಚಿದ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುವ ಸಾಧ್ಯತೆಯಿದೆ.
ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ಮೇಲಿನ ದತ್ತಾಂಶವು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನದ ಸಂಕೀರ್ಣ ಮತ್ತು ಸಮಯ-ಅವಲಂಬಿತ ನಿಯಂತ್ರಣ ಮತ್ತು ಈ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಸ್ಪಷ್ಟಪಡಿಸುವ ಸವಾಲುಗಳನ್ನು ಎತ್ತಿ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು, ಮೊದಲು ಮಾರ್ಗದಲ್ಲಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಗುರಿ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವುದು ಅವಶ್ಯಕ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಒಂದೇ ಮಾರ್ಗದಲ್ಲಿರುವ ಜೀನ್‌ಗಳು ಒಂದೇ ಒತ್ತಡಕ್ಕೆ ಒಂದೇ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ನಮ್ಮ ದತ್ತಾಂಶ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ಒಂದೇ ಮಾರ್ಗದಲ್ಲಿರುವ ವಿಭಿನ್ನ ಜೀನ್‌ಗಳು ವಿಭಿನ್ನ ತಾತ್ಕಾಲಿಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಪ್ರೊಫೈಲ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ತೋರಿಸಿವೆ30,46. ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಮತ್ತು ಜೀನ್ ಕಾರ್ಯದ ನಡುವಿನ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸುವ ಸಂಕೀರ್ಣವಾದ ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ನಂತರದ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳಿವೆ. ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ ಅಧ್ಯಯನಗಳು PTM ಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕಾರ್ಯದ ಪ್ರಭಾವದ ಬಗ್ಗೆ ಒಳನೋಟವನ್ನು ಒದಗಿಸಬಹುದು, ಆದರೆ ಅವು ಕಡಿಮೆ-ಥ್ರೂಪುಟ್ ವಿಧಾನಗಳು, ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಿಗ್ನಲ್-ಟು-ಶಬ್ದ ಅನುಪಾತಗಳು ಮತ್ತು ಕಳಪೆ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ಸೇರಿದಂತೆ ಸವಾಲುಗಳನ್ನು ಸಹ ಒಡ್ಡುತ್ತವೆ.
ಈ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, TEM ಮತ್ತು MEL ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನವನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡುವುದರಿಂದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯದ ನಡುವಿನ ಸಂಬಂಧ ಮತ್ತು ಇದು ರೋಗದ ಮೇಲೆ ಹೇಗೆ ಪ್ರಭಾವ ಬೀರುತ್ತದೆ ಎಂಬುದರ ಕುರಿತು ಮೂಲಭೂತ ಪ್ರಶ್ನೆಗಳನ್ನು ಪರಿಹರಿಸಲು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವಿದೆ. ಬಹು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ, TEM ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆ ಮತ್ತು ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್‌ನ ಒಮ್ಮುಖ ಅಂತಿಮ ಬಿಂದುವಾಗಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನವನ್ನು ಅಳೆಯಲು ನೇರ ವಿಧಾನವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ. ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಲ್ಲಿ ಬದಲಾವಣೆಗಳ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿಯೂ ಸಹ ಡೈನಾಮಿಕ್ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಮರುರೂಪಿಸುವಿಕೆಯ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವನ್ನು ಅನುಮತಿಸುವ ಮೂರು ಆಯಾಮದ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಪರಿಸರದಲ್ಲಿ ವಿದಳನ ಮತ್ತು ಸಮ್ಮಿಳನ ಘಟನೆಗಳನ್ನು ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲು MEL ನೇರ ವಿಧಾನವನ್ನು ಸಹ ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ. ದ್ವಿತೀಯ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಕಾಯಿಲೆಗಳಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ತಂತ್ರಗಳ ಉಪಯುಕ್ತತೆಯನ್ನು ನಾವು ಇಲ್ಲಿ ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ. ಈ ರೋಗಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ತೀವ್ರವಾದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಹಾನಿಗಿಂತ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಜಾಲಗಳ ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಮರುರೂಪಿಸುವಿಕೆಯಿಂದ ನಿರೂಪಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ದೀರ್ಘಕಾಲದ ಸೌಮ್ಯ ಚಯಾಪಚಯ ಒತ್ತಡದಿಂದ ನಿರೂಪಿಸಲ್ಪಡುತ್ತವೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ದೀರ್ಘಕಾಲದ ಒತ್ತಡದಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಪರಿಹಾರವನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಪರಿಹಾರವು ಆಳವಾದ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ. ನರವಿಜ್ಞಾನದ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ಈ ಸರಿದೂಗಿಸುವ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ಉತ್ತಮ ತಿಳುವಳಿಕೆಯು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಪ್ಲಿಯೋಟ್ರೋಪಿಕ್ ನರರೋಗಶಾಸ್ತ್ರದ ಬಗ್ಗೆ ಪ್ರಮುಖ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಒದಗಿಸಬಹುದು.
ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ನಮ್ಮ ದತ್ತಾಂಶವು ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ, ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳು ಮತ್ತು ನರಕೋಶದ ಮೈಟೋಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ನಡುವಿನ ಸಂಕೀರ್ಣ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು ಇಮೇಜಿಂಗ್ ತಂತ್ರಗಳ ಉಪಯುಕ್ತತೆಯನ್ನು ಎತ್ತಿ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ASD ಯ ಮೈಟೋಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಘಟಕದ ಬಗ್ಗೆ ಒಳನೋಟವನ್ನು ಪಡೆಯಲು ನರಕೋಶದ ಕೋಶ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಮೈಟೋಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಮಾದರಿ ಮಾಡಲು ನಾವು PPA ಅನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ. PPA ಯೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಪಡೆದ SH-SY5Y ಕೋಶಗಳು ಮೈಟೋಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನದಲ್ಲಿ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಿದವು: ಮೈಟೋಕಾಂಡ್ರಿಯಾ ಚಿಕ್ಕದಾಯಿತು ಮತ್ತು ದುಂಡಾಯಿತು, ಮತ್ತು TEM ಗಮನಿಸಿದಾಗ ಕ್ರಿಸ್ಟೇಗಳನ್ನು ಕಳಪೆಯಾಗಿ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸೌಮ್ಯವಾದ ಚಯಾಪಚಯ ಒತ್ತಡಕ್ಕೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ ಮೈಟೋಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ವಿದಳನ ಮತ್ತು ಸಮ್ಮಿಳನ ಘಟನೆಗಳ ಹೆಚ್ಚಳದೊಂದಿಗೆ ಈ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ಸಂಭವಿಸುತ್ತವೆ ಎಂದು MEL ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಇದಲ್ಲದೆ, ಮೈಟೋಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಯಾಪಚಯ ಮತ್ತು ಹೋಮಿಯೋಸ್ಟಾಸಿಸ್‌ನ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ನಿಯಂತ್ರಣವನ್ನು PPA ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸುತ್ತದೆ. PPA ಒತ್ತಡದಿಂದ ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸಲಾದ ಪ್ರಮುಖ ಮೈಟೋಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ನಿಯಂತ್ರಕಗಳಾಗಿ ನಾವು cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, ಮತ್ತು OPA1 ಅನ್ನು ಗುರುತಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಮೈಟೋಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯದಲ್ಲಿ PPA-ಪ್ರೇರಿತ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ವಹಿಸುವಲ್ಲಿ ಪಾತ್ರವಹಿಸಬಹುದು. ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಚಟುವಟಿಕೆ, ಸ್ಥಳೀಕರಣ ಮತ್ತು ಅನುವಾದದ ನಂತರದ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳಲ್ಲಿ PPA-ಪ್ರೇರಿತ ತಾತ್ಕಾಲಿಕ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಉತ್ತಮವಾಗಿ ನಿರೂಪಿಸಲು ಭವಿಷ್ಯದ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಅಗತ್ಯವಿದೆ. ನಮ್ಮ ದತ್ತಾಂಶವು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಒತ್ತಡದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ವಹಿಸುವ ನಿಯಂತ್ರಕ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ಸಂಕೀರ್ಣತೆ ಮತ್ತು ಪರಸ್ಪರ ಅವಲಂಬನೆಯನ್ನು ಎತ್ತಿ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚು ಉದ್ದೇಶಿತ ಯಾಂತ್ರಿಕ ಅಧ್ಯಯನಗಳಿಗೆ TEM ಮತ್ತು ಇತರ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ತಂತ್ರಗಳ ಉಪಯುಕ್ತತೆಯನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತದೆ.
SH-SY5Y ಕೋಶ ರೇಖೆಯನ್ನು (ECACC, 94030304-1VL) ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್‌ನಿಂದ ಖರೀದಿಸಲಾಗಿದೆ. SH-SY5Y ಕೋಶಗಳನ್ನು ಡಲ್ಬೆಕೊದ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಈಗಲ್ಸ್ ಮೀಡಿಯಂ/F-12 ಪೌಷ್ಟಿಕ ಮಿಶ್ರಣದಲ್ಲಿ (DMEM/F-12) ಮತ್ತು L-ಗ್ಲುಟಾಮಿನ್ (SC09411, ScienCell) 25 cm2 ಫ್ಲಾಸ್ಕ್‌ಗಳಲ್ಲಿ 20% ಭ್ರೂಣದ ಗೋವಿನ ಸೀರಮ್ (FBS) (10493106, ಥರ್ಮೋಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಮತ್ತು 1% ಪೆನ್ಸಿಲಿನ್-ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟೊಮೈಸಿನ್ (P4333-20ML, ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) 37 °C, 5% CO2 ನಲ್ಲಿ ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು. ಕೋಶಗಳನ್ನು 0.05% ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್-EDTA (15400054, ಥರ್ಮೋಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಬಳಸಿ 80% ಸಂಗಮಕ್ಕೆ ಉಪಸಂಸ್ಕೃತಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು, 300 ಗ್ರಾಂನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸರಿಸುಮಾರು 7 × 105 ಕೋಶಗಳು/ಮಿಲಿ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಲೇಪಿಸಲಾಗಿದೆ. ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಪ್ಯಾಸೇಜ್ 19–22 ರ ನಡುವೆ ವ್ಯತ್ಯಾಸವಿಲ್ಲದ SH-SY5Y ಕೋಶಗಳ ಮೇಲೆ ನಡೆಸಲಾಯಿತು. PPA ಅನ್ನು NaP ಆಗಿ ನೀಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಬೆಚ್ಚಗಿನ MilliQ ನೀರಿನಲ್ಲಿ NaP ಪುಡಿಯನ್ನು (CAS ಸಂಖ್ಯೆ 137-40-6, ರಾಸಾಯನಿಕ ಸೂತ್ರ C3H5NaO2, P5436-100G, ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) 1 M ಸಾಂದ್ರತೆಗೆ ಕರಗಿಸಿ 4 °C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ. ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ದಿನದಂದು, ಈ ದ್ರಾವಣವನ್ನು 1 M PPA ಯೊಂದಿಗೆ 3 mM ಗೆ ಮತ್ತು 5 mM PPA ಯೊಂದಿಗೆ ಸೀರಮ್-ಮುಕ್ತ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ (DMEM/F-12 ಜೊತೆಗೆ L-ಗ್ಲುಟಾಮಿನ್) ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿ. ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸಾ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳು PPA ಇಲ್ಲ (0 mM, ನಿಯಂತ್ರಣ), 3 mM, ಮತ್ತು 5 mM PPA ಆಗಿದ್ದವು. ಕನಿಷ್ಠ ಮೂರು ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
SH-SY5Y ಕೋಶಗಳನ್ನು 25 cm5 ಫ್ಲಾಸ್ಕ್‌ಗಳಾಗಿ 5.5 × 105 ಕೋಶಗಳು/ಮಿಲಿ ದರದಲ್ಲಿ ಬೀಜಗಳಾಗಿ ಬಿತ್ತಿ 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು. PPA ಚಿಕಿತ್ಸೆಯನ್ನು 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡುವ ಮೊದಲು ಫ್ಲಾಸ್ಕ್‌ಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ಸಾಮಾನ್ಯ ಸಸ್ತನಿ ಅಂಗಾಂಶ ಉಪಸಂಸ್ಕೃತಿ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್‌ಗಳನ್ನು ಅನುಸರಿಸಿ ಕೋಶದ ಉಂಡೆಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ (ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಲಾಗಿದೆ). ಕೋಶದ ಉಂಡೆಯನ್ನು 100 µl 2.5% ಗ್ಲುಟರಾಲ್ಡಿಹೈಡ್, 1× PBS ನಲ್ಲಿ ಮತ್ತೆ ಇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಸಂಸ್ಕರಿಸುವವರೆಗೆ 4 °C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ. SH-SY5Y ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ಉಂಡೆಗಳಾಗಿ ಮತ್ತು 2.5% ಗ್ಲುಟರಾಲ್ಡಿಹೈಡ್, 1× PBS ದ್ರಾವಣವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು. ಬಟ್ಟಿ ಇಳಿಸಿದ ನೀರಿನಲ್ಲಿ ತಯಾರಿಸಿದ 4% ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಕೆಸರನ್ನು ಮತ್ತೆ ಇರಿಸಿ (ಅಗರೋಸ್ ಮತ್ತು ಸೆಡಿಮೆಂಟ್ ಪರಿಮಾಣದ ಅನುಪಾತವು 1:1). ಅಗರೋಸ್ ತುಂಡುಗಳನ್ನು ಫ್ಲಾಟ್ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳ ಮೇಲೆ ಗ್ರಿಡ್‌ಗಳ ಮೇಲೆ ಇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಒತ್ತಡದ ಘನೀಕರಣದ ಮೊದಲು 1-ಹೆಕ್ಸಾಡೆಸೀನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಲೇಪಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮಾದರಿಗಳನ್ನು 100% ಒಣ ಅಸಿಟೋನ್‌ನಲ್ಲಿ -90°C ನಲ್ಲಿ 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ನಂತರ ತಾಪಮಾನವನ್ನು -80°C ಗೆ ಹೆಚ್ಚಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 1% ಆಸ್ಮಿಯಮ್ ಟೆಟ್ರಾಕ್ಸೈಡ್ ಮತ್ತು 0.1% ಗ್ಲುಟರಾಲ್ಡಿಹೈಡ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ಮಾದರಿಗಳನ್ನು -80°C ನಲ್ಲಿ 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು. ಇದರ ನಂತರ, ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಹಲವಾರು ದಿನಗಳಲ್ಲಿ ಕ್ರಮೇಣ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶಕ್ಕೆ ಹೆಚ್ಚಿಸಲಾಯಿತು: 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ – 80°C ನಿಂದ – 50°C ಗೆ, 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ – 30°C ಗೆ, 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ – 10°C ಗೆ ಮತ್ತು ಅಂತಿಮವಾಗಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶಕ್ಕೆ. ತಾಪಮಾನ.
ಕ್ರಯೋಜೆನಿಕ್ ತಯಾರಿಕೆಯ ನಂತರ, ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ರಾಳದಿಂದ ತುಂಬಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಲೈಕಾ ರೀಚರ್ಟ್ ಅಲ್ಟ್ರಾಕಟ್ಸ್ ಅಲ್ಟ್ರಾಮೈಕ್ರೋಟೋಮ್ (ಲೈಕಾ ಮೈಕ್ರೋಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್) ಬಳಸಿ ಅಲ್ಟ್ರಾಥಿನ್ ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು (~100 nm) ತಯಾರಿಸಲಾಯಿತು. ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು 2% ಯುರೇನಿಲ್ ಅಸಿಟೇಟ್ ಮತ್ತು ಸೀಸದ ಸಿಟ್ರೇಟ್‌ನಿಂದ ಬಣ್ಣಿಸಲಾಗಿದೆ. 200 kV (ಲ್ಯಾಬ್6 ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮಿಟರ್) ನಲ್ಲಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುವ FEI ಟೆಕ್ನೈ 20 ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮಿಷನ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್ (ಥರ್ಮೋಫಿಶರ್ (ಹಿಂದೆ FEI), ಐಂಡ್‌ಹೋವನ್, ನೆದರ್‌ಲ್ಯಾಂಡ್ಸ್) ಮತ್ತು ಟ್ರೈಡಿಯಮ್ ಎನರ್ಜಿ ಫಿಲ್ಟರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸಜ್ಜುಗೊಂಡ ಗ್ಯಾಟನ್ CCD ಕ್ಯಾಮೆರಾ (ಗ್ಯಾಟನ್, ಯುಕೆ) ಬಳಸಿ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಯಿತು.
ಪ್ರತಿ ತಾಂತ್ರಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಯಲ್ಲಿ, ಒಟ್ಟು 266 ಚಿತ್ರಗಳಿಗೆ ಕನಿಷ್ಠ 24 ಏಕ ಕೋಶ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ. ಎಲ್ಲಾ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಆಸಕ್ತಿಯ ಪ್ರದೇಶ (ROI) ಮ್ಯಾಕ್ರೋ ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾ ಮ್ಯಾಕ್ರೋ ಬಳಸಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಮ್ಯಾಕ್ರೋ ಪ್ರಕಟಿತ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಆಧರಿಸಿದೆ 17,31,32 ಮತ್ತು ಫಿಜಿ/ಇಮೇಜ್‌ಜೆ 69 ನಲ್ಲಿ TEM ಚಿತ್ರಗಳ ಅರೆ-ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಬ್ಯಾಚ್ ಸಂಸ್ಕರಣೆಯನ್ನು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ: ರೋಲಿಂಗ್ ಬಾಲ್ ಹಿನ್ನೆಲೆ ವ್ಯವಕಲನ (60 ಪಿಕ್ಸೆಲ್ ತ್ರಿಜ್ಯ) ಮತ್ತು ಎಫ್‌ಎಫ್‌ಟಿ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಪಾಸ್ ಫಿಲ್ಟರ್ (ಕ್ರಮವಾಗಿ 60 ಮತ್ತು 8 ಪಿಕ್ಸೆಲ್ ಮೇಲಿನ ಮತ್ತು ಕೆಳಗಿನ ಗಡಿಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ) ಮತ್ತು 5% ಓರಿಯಂಟೇಶನ್ ಸಹಿಷ್ಣುತೆಯೊಂದಿಗೆ ಲಂಬ ರೇಖೆಯ ನಿಗ್ರಹವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಚಿತ್ರವನ್ನು ತಲೆಕೆಳಗಾಗಿ ಮತ್ತು ತಲೆಕೆಳಗಾಗಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಚಿತ್ರವನ್ನು ಗರಿಷ್ಠ ಎಂಟ್ರೊಪಿ ಅಲ್ಗಾರಿದಮ್ ಬಳಸಿ ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತವಾಗಿ ಮಿತಿಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಬೈನರಿ ಮಾಸ್ಕ್ ಅನ್ನು ರಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಕಚ್ಚಾ TEM ಚಿತ್ರಗಳಲ್ಲಿ ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿದ ROI ಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಚಿತ್ರ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಯಿತು, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾವನ್ನು ನಿರೂಪಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಮೆಂಬರೇನ್ ಮತ್ತು ಇತರ ಹೆಚ್ಚಿನ-ವ್ಯತಿರಿಕ್ತ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸಿ. ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ROI ಗೆ, 600 ಪಿಕ್ಸೆಲ್‌ಗಳಿಗಿಂತ ದೊಡ್ಡದಾದ ಬೈನರಿ ಕಣಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಫಿಜಿ/ಇಮೇಜ್‌ಜೆಯ ಅಂತರ್ನಿರ್ಮಿತ ಮಾಪನ ಕಾರ್ಯಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಕಣ ವಿಸ್ತೀರ್ಣ, ಪರಿಧಿ, ಪ್ರಮುಖ ಮತ್ತು ಸಣ್ಣ ಅಕ್ಷಗಳು, ಫೆರೆಟ್ ವ್ಯಾಸ, ದುಂಡಗಿನತೆ ಮತ್ತು ವೃತ್ತಾಕಾರವನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. ಮೆರಿಲ್, ಫ್ಲಿಪ್ಪೊ ಮತ್ತು ಸ್ಟ್ರಾಕ್ (2017) ನಂತರ, ಪ್ರದೇಶ 2, ಕಣ ಆಕಾರ ಅನುಪಾತ (ಪ್ರಮುಖ ಮತ್ತು ಸಣ್ಣ ಅಕ್ಷ ಅನುಪಾತ), ಮತ್ತು ಆಕಾರ ಅಂಶ (FF) ಅನ್ನು ಈ ಡೇಟಾದಿಂದ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಯಿತು, ಅಲ್ಲಿ FF = ಪರಿಧಿ 2/4pi x ಪ್ರದೇಶ. ಪ್ಯಾರಾಮೆಟ್ರಿಕ್ ಸೂತ್ರದ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನವನ್ನು ಮೆರಿಲ್, ಫ್ಲಿಪ್ಪೊ ಮತ್ತು ಸ್ಟ್ರಾಕ್ (2017) ನಲ್ಲಿ ಕಾಣಬಹುದು. ಉಲ್ಲೇಖಿಸಲಾದ ಮ್ಯಾಕ್ರೋಗಳು GitHub ನಲ್ಲಿ ಲಭ್ಯವಿದೆ (ಡೇಟಾ ಲಭ್ಯತೆ ಹೇಳಿಕೆಯನ್ನು ನೋಡಿ). ಸರಾಸರಿ, ಪ್ರತಿ PPA ಚಿಕಿತ್ಸೆಗೆ ಸರಿಸುಮಾರು 5,600 ಕಣಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ, ಒಟ್ಟು ಸುಮಾರು 17,000 ಕಣಗಳಿಗೆ (ಡೇಟಾವನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ).
SH-SH5Y ಕೋಶಗಳನ್ನು ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಅಂಟಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಅನುಮತಿಸಲು 8-ಚೇಂಬರ್ ಕಲ್ಚರ್ ಡಿಶ್‌ಗಳಲ್ಲಿ (ಥರ್ಮೋಫಿಶರ್, #155411) ಇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ TMRE 1:1000 (ಥರ್ಮೋಫಿಶರ್, #T669) ಮತ್ತು ಹೋಚ್‌ಸ್ಟ್ 33342 1:200 (ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್, H6024) ನೊಂದಿಗೆ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಡೈಯಿಂಗ್. 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಪರಿಸರದಲ್ಲಿ 405 nm ಮತ್ತು 561 nm ಲೇಸರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಕಚ್ಚಾ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು 12 ನಂತರದ ಸಮಯ ಬಿಂದುಗಳಲ್ಲಿ ಚಿತ್ರ ಚೌಕಟ್ಟುಗಳ ನಡುವೆ 0.2 μm ನ az ಹಂತದೊಂದಿಗೆ 10 ಚಿತ್ರ ಮೈಕ್ರೋಗ್ರಾಫ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ z-ಸ್ಟ್ಯಾಕ್‌ಗಳಾಗಿ ಪಡೆಯಲಾಯಿತು. LCI ಪ್ಲಾನ್ ಅಪೋಕ್ರೊಮೇಟ್ 100x/1.4 ಆಯಿಲ್ DIC M27 ಲೆನ್ಸ್ ಬಳಸಿ ಕಾರ್ಲ್ ಝೈಸ್ LSM780 ELYRA PS.1 ಸೂಪರ್-ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ಪ್ಲಾಟ್‌ಫಾರ್ಮ್ (ಕಾರ್ಲ್ ಝೈಸ್, ಒಬೆರ್ಕೋಚೆನ್, ಜರ್ಮನಿ) ಬಳಸಿ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು. ಸಮ್ಮಿಳನ ಮತ್ತು ವಿದಳನ ಘಟನೆಗಳು, ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ರಚನೆಗಳ ಸರಾಸರಿ ಸಂಖ್ಯೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಕೋಶಕ್ಕೆ ಸರಾಸರಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ಅಳೆಯಲು ಇಮೇಜ್‌ಜೆ ಪ್ಲಗಿನ್ ಮತ್ತು ಇಮೇಜ್‌ಜೆ ಪ್ಲಗಿನ್ ಬಳಸಿ ಇಮೇಜ್‌ಜೆಯಲ್ಲಿ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ33. MEL ಮ್ಯಾಕ್ರೋಗಳು GitHub ನಲ್ಲಿ ಲಭ್ಯವಿದೆ (ಡೇಟಾ ಲಭ್ಯತೆ ಹೇಳಿಕೆಯನ್ನು ನೋಡಿ).
ಚಿಕಿತ್ಸೆಗೆ 24 ಗಂಟೆಗಳ ಮೊದಲು SH-SY5Y ಕೋಶಗಳನ್ನು ಆರು-ಬಾವಿ ಫಲಕಗಳಲ್ಲಿ 0.3 × 106 ಜೀವಕೋಶಗಳು/mL ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು. ಕ್ವಿಕ್-ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ™ ಮಿನಿಪ್ರೆಪ್ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ (ZR R1055, ಝೈಮೋ ರಿಸರ್ಚ್) ಬಳಸಿ ಸ್ವಲ್ಪ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳೊಂದಿಗೆ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಯಿತು: ತೆಗೆದುಹಾಕುವ ಮೊದಲು ಪ್ರತಿ ಬಾವಿಗೆ 300 μl ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಯನ್ನು 30 μl ಡಿಎನ್‌ಎಎಸ್/ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಎಸ್ ಎಲ್ಯೂಷನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಅಂತಿಮ ಹಂತವಾಗಿ ಲೈಸ್ ಮಾಡಿ. - ಉಚಿತ ನೀರು. ನ್ಯಾನೊಡ್ರಾಪ್ ND-1000 UV-Vis ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೀಟರ್ ಬಳಸಿ ಎಲ್ಲಾ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಪ್ರಮಾಣ ಮತ್ತು ಗುಣಮಟ್ಟಕ್ಕಾಗಿ ಪರಿಶೀಲಿಸಲಾಯಿತು. ಸೆಲ್ ಲೈಸೇಟ್‌ಗಳಿಂದ ಒಟ್ಟು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು 200 μl RIPA ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್ ಬಳಸಿ ಪಡೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಬ್ರಾಡ್‌ಫೋರ್ಡ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಸ್ಸೇ70 ಬಳಸಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲಾಯಿತು.
ತಯಾರಕರ ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಕೆಲವು ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳೊಂದಿಗೆ ಟೆಟ್ರೋ™ cDNA ಸಿಂಥೆಸಿಸ್ ಕಿಟ್ (BIO-65043, ಮೆರಿಡಿಯನ್ ಬಯೋಸೈನ್ಸ್) ಬಳಸಿ cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಒಟ್ಟು RNA ಯ 0.7 ರಿಂದ 1 μg ಬಳಸಿ cDNA ಅನ್ನು 20-μl ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. ಈ ಹಿಂದೆ ಪ್ರಕಟವಾದ ಪತ್ರಿಕೆಗಳು 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (ಟೇಬಲ್ S1) ನಿಂದ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಅದರ ಜೊತೆಗಿನ ಪ್ರೋಬ್‌ಗಳನ್ನು ಇಂಟಿಗ್ರೇಟೆಡ್ DNA ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್‌ನಿಂದ ಪ್ರೈಮರ್‌ಕ್ವೆಸ್ಟ್ ಉಪಕರಣವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ. ಆಸಕ್ತಿಯ ಎಲ್ಲಾ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ B2M ಜೀನ್‌ಗೆ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಲಾಯಿತು. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC ಮತ್ತು OPA1 ನ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು RT-qPCR ನಿಂದ ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. ಮಾಸ್ಟರ್ ಮಿಶ್ರಣವು LUNA Taq ಪಾಲಿಮರೇಸ್ (M3003L, ನ್ಯೂ ಇಂಗ್ಲೆಂಡ್ ಬಯೋಲಾಬ್ಸ್), 10 μM ಫಾರ್ವರ್ಡ್ ಮತ್ತು ರಿವರ್ಸ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು, cDNA ಮತ್ತು PCR-ಗ್ರೇಡ್ ನೀರನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದ್ದು, ಪ್ರತಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗೆ 10 μL ಅಂತಿಮ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ನೀಡುತ್ತದೆ. ವಿಭಾಗ ಮತ್ತು ವಿದಳನ ಜೀನ್‌ಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು (DRP1, MFN1/2) TaqMan ಮಲ್ಟಿಪ್ಲೆಕ್ಸ್ ಅಸ್ಸೇಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. ಲೂನಾ ಯೂನಿವರ್ಸಲ್ ಪ್ರೋಬ್ qPCR ಮಾಸ್ಟರ್ ಮಿಕ್ಸ್ (M3004S, ನ್ಯೂ ಇಂಗ್ಲೆಂಡ್ ಬಯೋಲಾಬ್ಸ್) ಅನ್ನು ತಯಾರಕರ ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಸಣ್ಣ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳೊಂದಿಗೆ ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಮಲ್ಟಿಪ್ಲೆಕ್ಸ್ RT-qPCR ಮಾಸ್ಟರ್ ಮಿಶ್ರಣವು 1X LUNA Taq ಪಾಲಿಮರೇಸ್, 10 μM ಫಾರ್ವರ್ಡ್ ಮತ್ತು ರಿವರ್ಸ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು, 10 μM ಪ್ರೋಬ್, cDNA ಮತ್ತು PCR-ಗ್ರೇಡ್ ನೀರನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಪ್ರತಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗೆ 20 μL ಅಂತಿಮ ಪರಿಮಾಣ ದೊರೆಯುತ್ತದೆ. RT-qPCR ಅನ್ನು ರೋಟರ್-ಜೀನ್ Q 6-ಪ್ಲೆಕ್ಸ್ (QIAGEN RG—ಸರಣಿ ಸಂಖ್ಯೆ: R0618110) ಬಳಸಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಸೈಕ್ಲಿಂಗ್ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳನ್ನು ಕೋಷ್ಟಕ S1 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಎಲ್ಲಾ ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ತ್ರಿಗುಣಗಳಲ್ಲಿ ವರ್ಧಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಹತ್ತು ಪಟ್ಟು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆಗಳ ಸರಣಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರರೇಖೆಯನ್ನು ರಚಿಸಲಾಯಿತು. ಡೇಟಾ ಪುನರುತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಸೈಕಲ್ ಮಿತಿ ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನ (ಸಿಟಿ) >0.5 ಹೊಂದಿರುವ ತ್ರಿಗುಣ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿನ ಹೊರವಲಯಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು30,72. ಸಾಪೇಕ್ಷ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು 2-ΔΔಸಿಟಿ79 ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಯಿತು.
ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು (60 μg) 2:1 ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ಲೇಮ್ಲಿ ಲೋಡಿಂಗ್ ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಬೆರೆಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 12% ಬಣ್ಣರಹಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಜೆಲ್ (ಬಯೋ-ರಾಡ್ #1610184) ಮೇಲೆ ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಟ್ರಾನ್ಸ್-ಬ್ಲಾಟ್ ಟರ್ಬೊ ಸಿಸ್ಟಮ್ (#170-4155, ಬಯೋ-ರಾಡ್) ಬಳಸಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು PVDF (ಪಾಲಿವಿನೈಲಿಡೀನ್ ಫ್ಲೋರೈಡ್) ಮೆಂಬರೇನ್‌ಗೆ (#170-84156, ಬಯೋ-ರಾಡ್) ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು. ಪೊರೆಯನ್ನು ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 48 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಸೂಕ್ತವಾದ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳೊಂದಿಗೆ (OPA1, MFN1, MFN2, ಮತ್ತು DRP1) (1:1000 ರಷ್ಟು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು) ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು, ನಂತರ 1 ಗಂಟೆಯ ಕಾಲ ದ್ವಿತೀಯ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳೊಂದಿಗೆ (1:10,000) ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಪೊರೆಗಳನ್ನು ಕ್ಲಾರಿಟಿ ವೆಸ್ಟರ್ನ್ ECL ಸಬ್‌ಸ್ಟ್ರೇಟ್ (#170-5061, ಬಯೋ-ರಾಡ್) ಬಳಸಿ ಚಿತ್ರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಬಯೋ-ರಾಡ್ ಕೆಮಿಡಾಕ್ MP ಸಿಸ್ಟಮ್ ಬಳಸಿ ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಇಮೇಜ್‌ಲ್ಯಾಬ್ ಆವೃತ್ತಿ 6.1 ಅನ್ನು ವೆಸ್ಟರ್ನ್ ಬ್ಲಾಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ. ಮೂಲ ಜೆಲ್ ಮತ್ತು ಬ್ಲಾಟ್ ಅನ್ನು ಚಿತ್ರ S1 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಪ್ರತಿಕಾಯದ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಕೋಷ್ಟಕ S2 ರಲ್ಲಿ ನೀಡಲಾಗಿದೆ.
ಕನಿಷ್ಠ ಮೂರು ಸ್ವತಂತ್ರ ಮಾದರಿಗಳ ಸರಾಸರಿ (SEM) ನ ಸರಾಸರಿ ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣಿತ ದೋಷವಾಗಿ ಡೇಟಾ ಸೆಟ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರಸ್ತುತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಗೌಸಿಯನ್ ವಿತರಣೆ ಮತ್ತು ಸಮಾನ ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನಗಳನ್ನು ಊಹಿಸುವ ಮೊದಲು ಮತ್ತು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳೊಂದಿಗೆ ಮುಂದುವರಿಯುವ ಮೊದಲು ಶಾಪಿರೊ-ವಿಲ್ಕ್ಸ್ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು (ಬೇರೆ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಹೇಳದ ಹೊರತು) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಡೇಟಾ ಸೆಟ್‌ಗಳನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯತೆಗಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು. ಫಿಶರ್‌ನ MEL LSD (p < 0.05), ಏಕಮುಖ ANOVA (ಚಿಕಿತ್ಸೆ vs. ನಿಯಂತ್ರಣ ಸರಾಸರಿ) ಮತ್ತು ಮಹತ್ವವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಡನೆಟ್‌ನ ಬಹು ಹೋಲಿಕೆ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಡೇಟಾ ಸೆಟ್ ಅನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸುವುದರ ಜೊತೆಗೆ (p < 0.05). ಗಮನಾರ್ಹವಾದ p ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಗ್ರಾಫ್‌ನಲ್ಲಿ *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಎಲ್ಲಾ ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳು ಮತ್ತು ಗ್ರಾಫ್‌ಗಳನ್ನು ಗ್ರಾಫ್‌ಪ್ಯಾಡ್ ಪ್ರಿಸಂ 9.4.0 ಬಳಸಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ರಚಿಸಲಾಗಿದೆ.
TEM ಇಮೇಜ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಫಿಜಿ/ಇಮೇಜ್‌ಜೆ ಮ್ಯಾಕ್ರೋಗಳು GitHub ನಲ್ಲಿ ಸಾರ್ವಜನಿಕವಾಗಿ ಲಭ್ಯವಿದೆ: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಈವೆಂಟ್ ಲೊಕೇಟರ್ (MEL) ಮ್ಯಾಕ್ರೋ GitHub ನಲ್ಲಿ ಸಾರ್ವಜನಿಕವಾಗಿ ಲಭ್ಯವಿದೆ: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
ಮೈಲಿಯಾನಾ ಎ., ದೇವಿ ಎನ್ಎಂ ಮತ್ತು ವಿಜಯಾ ಎ. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾ: ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆ, ಹೋಮಿಯೋಸ್ಟಾಸಿಸ್, ಒತ್ತಡ, ವಯಸ್ಸಾಗುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಎಪಿಜೆನೆಟಿಕ್ಸ್‌ನ ಮಾಸ್ಟರ್ ನಿಯಂತ್ರಕರು. ಇಂಡೋನೇಷಿಯನ್. ಬಯೋಮೆಡಿಕಲ್ ಸೈನ್ಸ್. ಜೆ. 13, 221–241 (2021).
ಬೆನ್-ಶಾಚರ್, ಡಿ. ಸ್ಕಿಜೋಫ್ರೇನಿಯಾದಲ್ಲಿ ಬಹುಮುಖಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆ, ಸಂಭಾವ್ಯ ರೋಗಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ಗುರಿಯಾಗಿ ಸಂಕೀರ್ಣ I. ಸ್ಕಿಜೋಫ್ರೇನಿಯಾ. ಸಂಪನ್ಮೂಲ. 187, 3–10 (2017).
ಬೋಸ್, ಎ. ಮತ್ತು ಬೀಲ್, ಎಮ್ಎಫ್ ಪಾರ್ಕಿನ್ಸನ್ ಕಾಯಿಲೆಯಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆ. ಜೆ. ನರರಸಾಯನಶಾಸ್ತ್ರ. 139, 216–231 (2016).
ಶರ್ಮಾ ವಿಕೆ, ಸಿಂಗ್ ಟಿಜಿ ಮತ್ತು ಮೆಹ್ತಾ ವಿ. ಒತ್ತಡಕ್ಕೊಳಗಾದ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾ: ಆಲ್ಝೈಮರ್ ಕಾಯಿಲೆಯಲ್ಲಿ ಆಕ್ರಮಣದ ಗುರಿಗಳು. ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾ 59, 48–57 (2021).
ಬೆಲೆಂಗರ್ ಪಿ., ಡುವಾರ್ಟೆ ಜೆಎಂಎನ್, ಶೂಕ್ ಪಿಎಫ್ ಮತ್ತು ಫೆರೀರಾ ಜಿಕೆ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾ ಮತ್ತು ಮೆದುಳು: ಜೈವಿಕ ಶಕ್ತಿಶಾಸ್ತ್ರ ಮತ್ತು ಇನ್ನಷ್ಟು. ನ್ಯೂರೋಟಾಕ್ಸಿನ್‌ಗಳು. ಸಂಪನ್ಮೂಲ. 36, 219–238 (2019).
ರಂಗರಾಜು, ವಿ. ಮತ್ತು ಇತರರು. ಪ್ಲಿಯೋಟ್ರೋಪಿಕ್ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾ: ನರಕೋಶದ ಬೆಳವಣಿಗೆ ಮತ್ತು ರೋಗದ ಮೇಲೆ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಾದ ಪ್ರಭಾವ. ಜೆ. ನರವಿಜ್ಞಾನ. 39, 8200–8208 (2019).
ಕಾರ್ಡಾನೊ-ರಾಮೋಸ್, ಸಿ. ಮತ್ತು ಮೊರೈಸ್, ವಿಎ. ನರಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯದ ಜೈವಿಕ ಉತ್ಪತ್ತಿ: ಹೇಗೆ ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಿ. ಅಂತರರಾಷ್ಟ್ರೀಯತೆ. ಜೆ. ಮೊಹರ್. ವಿಜ್ಞಾನ. 22, 13059 (2021).
ಯು, ಆರ್., ಲೆಂಡಾಲ್, ಯು., ನಿಸ್ಟರ್, ಎಂ. ಮತ್ತು ಝಾವೋ, ಜೆ. ಸಸ್ತನಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ನಿಯಂತ್ರಣ: ಅವಕಾಶಗಳು ಮತ್ತು ಸವಾಲುಗಳು. ಮುಂಭಾಗ. ಅಂತಃಸ್ರಾವಕ. (ಲೌಸೇನ್) 11, 374 (2020).
ಖಚೊ, ಎಂ. ಮತ್ತು ಸ್ಲಾಕ್, ಆರ್‌ಎಸ್ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಇನ್ ದಿ ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್ ಆಫ್ ನ್ಯೂರೋಜೆನೆಸಿಸ್: ಫ್ರಮ್ ದಿ ಡೆವಲಪಿಂಗ್ ಟು ದಿ ಡೆವಲಪಿಂಗ್ ಟು ವಯಸ್ಕ ಮಿದುಳು. ಡೆವಲಪ್ಮೆಂಟ್. ಡೈನಾಮಿಕ್. 247, 47–53 (2018).