ಈ ಲೇಖನವು "ರೋಗಕಾರಕಗಳು ಮತ್ತು ಕೀಟಗಳಿಗೆ ದ್ವಿದಳ ಧಾನ್ಯಗಳ ಪ್ರತಿರೋಧವನ್ನು ಸುಧಾರಿಸುವುದು" ಎಂಬ ಸಂಶೋಧನಾ ವಿಷಯದ ಭಾಗವಾಗಿದೆ, ಎಲ್ಲಾ 5 ಲೇಖನಗಳನ್ನು ವೀಕ್ಷಿಸಿ.
ಶಿಲೀಂಧ್ರ ಸಸ್ಯ ರೋಗದ ನೆಕ್ರೋಸಿಸ್‌ಗೆ ಕಾರಣವಾಗುವ ಅಂಶವೆಂದರೆ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿನಿಯಾ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೋರಮ್ (ಲಿಬ್.) ಡಿ ಬ್ಯಾರಿ ವಿವಿಧ ಆತಿಥೇಯ ಸಸ್ಯಗಳಿಗೆ ಸೋಂಕು ತಗುಲಿಸಲು ಬಹು-ಶ್ರೇಣೀಕೃತ ತಂತ್ರವನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ. ಈ ಅಧ್ಯಯನವು ಸ್ಯೂಡೋಮೊನಾಸ್ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೋರಮ್‌ನಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ಬಿಳಿ ಅಚ್ಚಿಗೆ ಫಾಸಿಯೋಲಸ್ ವಲ್ಗ್ಯಾರಿಸ್ ಎಲ್ ನ ಆಣ್ವಿಕ, ಶಾರೀರಿಕ ಮತ್ತು ಜೀವರಾಸಾಯನಿಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಪರ್ಯಾಯ ನಿರ್ವಹಣಾ ತಂತ್ರವಾಗಿ, ಇತರ ಅಗತ್ಯ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಲ್ಲದ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲವಾದ ಡೈಅಮೈನ್ ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲು ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸುತ್ತದೆ. ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಪ್ರಯೋಗಗಳು ಎಸ್. ಪೈರೆನಾಯ್ಡೋಸಾದ ಕವಕಜಾಲದ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಡೋಸ್-ಅವಲಂಬಿತ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ. ಇದಲ್ಲದೆ, ಇದು ಹಸಿರುಮನೆ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಬಿಳಿ ಅಚ್ಚಿನ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಇದಲ್ಲದೆ, ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಸಸ್ಯಗಳ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಿತು, ಇದು ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳು ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಸಸ್ಯಗಳಿಗೆ ಫೈಟೊಟಾಕ್ಸಿಕ್ ಅಲ್ಲ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಕಿಣ್ವಕವಲ್ಲದ ಉತ್ಕರ್ಷಣ ನಿರೋಧಕಗಳು (ಒಟ್ಟು ಕರಗುವ ಫೀನಾಲಿಕ್ಸ್ ಮತ್ತು ಫ್ಲೇವನಾಯ್ಡ್‌ಗಳು) ಮತ್ತು ಕಿಣ್ವಕ ಉತ್ಕರ್ಷಣ ನಿರೋಧಕಗಳು (ಕ್ಯಾಟಲೇಸ್ (CAT), ಪೆರಾಕ್ಸಿಡೇಸ್ (POX), ಮತ್ತು ಪಾಲಿಫಿನಾಲ್ ಆಕ್ಸಿಡೇಸ್ (PPO)) ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿತು ಮತ್ತು ಮೂರು ಉತ್ಕರ್ಷಣ ನಿರೋಧಕ-ಸಂಬಂಧಿತ ಜೀನ್‌ಗಳ (PvCAT1, PvSOD, ಮತ್ತು PvGR) ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿತು. ಇದಲ್ಲದೆ, ಸಿಲಿಕೋ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಜೀನೋಮ್‌ನಲ್ಲಿ ಒಂದು ಕಲ್ಪಿತ ಆಕ್ಸಲೋಸಿಟೇಟ್ ಅಸಿಟೈಲ್ಹೈಡ್ರೋಲೇಸ್ (SsOAH) ಪ್ರೋಟೀನ್ ಇರುವಿಕೆಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು, ಇದು ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ, ಸಂರಕ್ಷಿತ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಸ್ಥಳಶಾಸ್ತ್ರದ ವಿಷಯದಲ್ಲಿ ಆಸ್ಪರ್ಜಿಲಸ್ ಫಿಜಿಯೆನ್ಸಿಸ್ (AfOAH) ಮತ್ತು ಪೆನಿಸಿಲಿಯಮ್ sp. (PlOAH) ನ ಆಕ್ಸಲೋಸಿಟೇಟ್ ಅಸಿಟೈಲ್ಹೈಡ್ರೋಲೇಸ್ (SsOAH) ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಹೋಲುತ್ತದೆ. ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ಆಲೂಗಡ್ಡೆ ಡೆಕ್ಸ್ಟ್ರೋಸ್ ಸಾರು (PDB) ಮಾಧ್ಯಮಕ್ಕೆ L-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವುದರಿಂದ S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಮೈಸಿಲಿಯಾದಲ್ಲಿ SsOAH ಜೀನ್‌ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಯಿತು. ಅದೇ ರೀತಿ, ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಸಸ್ಯಗಳಿಂದ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾದ ಶಿಲೀಂಧ್ರ ಮೈಸಿಲಿಯಾದಲ್ಲಿ L-ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನ ಬಾಹ್ಯ ಅನ್ವಯವು SsOAH ಜೀನ್‌ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿತು. ಅಂತಿಮವಾಗಿ, PDB ಮಾಧ್ಯಮ ಮತ್ತು ಸೋಂಕಿತ ಎಲೆಗಳಲ್ಲಿ L-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಅನ್ವಯವು ಆಕ್ಸಲಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಸ್ರವಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿತು. ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ, ಸೋಂಕಿತ ಸಸ್ಯಗಳ ರಕ್ಷಣಾ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುವುದರ ಜೊತೆಗೆ ರೆಡಾಕ್ಸ್ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಕಾಪಾಡಿಕೊಳ್ಳುವಲ್ಲಿ L-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರ ವಹಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ಅಧ್ಯಯನದ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಬಿಳಿ ಅಚ್ಚನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಲು ಮತ್ತು ಬೀನ್ಸ್ ಉತ್ಪಾದನೆ ಮತ್ತು ಇತರ ಬೆಳೆಗಳ ಮೇಲೆ ಅದರ ಪ್ರಭಾವವನ್ನು ತಗ್ಗಿಸಲು ನವೀನ, ಪರಿಸರ ಸ್ನೇಹಿ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸುವಲ್ಲಿ ಸಹಾಯ ಮಾಡಬಹುದು.
ನೆಕ್ರೋಟ್ರೋಫಿಕ್ ಶಿಲೀಂಧ್ರವಾದ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿನಿಯಾ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ (ಲಿಬ್.) ಡಿ ಬ್ಯಾರಿಯಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ಬಿಳಿ ಅಚ್ಚು, ವಿನಾಶಕಾರಿ, ಇಳುವರಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವ ಕಾಯಿಲೆಯಾಗಿದ್ದು, ಇದು ಜಾಗತಿಕ ಬೀನ್ (ಫಾಸಿಯೋಲಸ್ ವಲ್ಗ್ಯಾರಿಸ್ ಎಲ್.) ಉತ್ಪಾದನೆಗೆ ಗಂಭೀರ ಅಪಾಯವನ್ನುಂಟುಮಾಡುತ್ತದೆ (ಬೋಲ್ಟನ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2006). ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿನಿಯಾ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲು ಅತ್ಯಂತ ಕಷ್ಟಕರವಾದ ಮಣ್ಣಿನಿಂದ ಹರಡುವ ಶಿಲೀಂಧ್ರ ಸಸ್ಯ ರೋಗಕಾರಕಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದಾಗಿದೆ, 600 ಕ್ಕೂ ಹೆಚ್ಚು ಸಸ್ಯ ಪ್ರಭೇದಗಳ ವಿಶಾಲ ಆತಿಥೇಯ ಶ್ರೇಣಿ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಆತಿಥೇಯ ಅಂಗಾಂಶಗಳನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಮೆಸೆರೇಟ್ ಮಾಡುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ (ಲಿಯಾಂಗ್ ಮತ್ತು ರೋಲಿನ್ಸ್, 2018). ಪ್ರತಿಕೂಲ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ, ಇದು ತನ್ನ ಜೀವನ ಚಕ್ರದ ನಿರ್ಣಾಯಕ ಹಂತಕ್ಕೆ ಒಳಗಾಗುತ್ತದೆ, ಮಣ್ಣಿನಲ್ಲಿ 'ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯಾ' ಎಂದು ಕರೆಯಲ್ಪಡುವ ಕಪ್ಪು, ಗಟ್ಟಿಯಾದ, ಬೀಜದಂತಹ ರಚನೆಗಳಾಗಿ ಅಥವಾ ಸೋಂಕಿತ ಸಸ್ಯಗಳ ಕವಕಜಾಲ ಅಥವಾ ಕಾಂಡದ ತಿರುಳಿನಲ್ಲಿ ಬಿಳಿ, ತುಪ್ಪುಳಿನಂತಿರುವ ಬೆಳವಣಿಗೆಗಳಾಗಿ ದೀರ್ಘಕಾಲದವರೆಗೆ ಸುಪ್ತವಾಗಿರುತ್ತದೆ (ಶ್ವಾರ್ಟ್ಜ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2005). ಎಸ್. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯಾವನ್ನು ರೂಪಿಸುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಇದು ಸೋಂಕಿತ ಹೊಲಗಳಲ್ಲಿ ದೀರ್ಘಕಾಲದವರೆಗೆ ಬದುಕಲು ಮತ್ತು ರೋಗದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಉಳಿಯಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ (ಶ್ವಾರ್ಟ್ಜ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2005). ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯಾ ಪೋಷಕಾಂಶಗಳಲ್ಲಿ ಸಮೃದ್ಧವಾಗಿದೆ, ದೀರ್ಘಕಾಲದವರೆಗೆ ಮಣ್ಣಿನಲ್ಲಿ ಉಳಿಯಬಹುದು ಮತ್ತು ನಂತರದ ಸೋಂಕುಗಳಿಗೆ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಇನಾಕ್ಯುಲಮ್ ಆಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ (ಶ್ವಾರ್ಟ್ಜ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2005). ಅನುಕೂಲಕರ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ, ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯಾ ಮೊಳಕೆಯೊಡೆಯುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಗಾಳಿಯಲ್ಲಿ ಹರಡುವ ಬೀಜಕಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಹೂವುಗಳು, ಕಾಂಡಗಳು ಅಥವಾ ಬೀಜಕೋಶಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಂತೆ ಆದರೆ ಅವುಗಳಿಗೆ ಸೀಮಿತವಾಗಿರದೆ ಸಸ್ಯದ ಎಲ್ಲಾ ನೆಲದ ಮೇಲಿನ ಭಾಗಗಳಿಗೆ ಸೋಂಕು ತರುತ್ತದೆ (ಶ್ವಾರ್ಟ್ಜ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2005).
ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿನಿಯಾ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ತನ್ನ ಆತಿಥೇಯ ಸಸ್ಯಗಳಿಗೆ ಸೋಂಕು ತಗುಲಿಸಲು ಬಹು-ಶ್ರೇಣಿಯ ತಂತ್ರವನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯಲ್ ಮೊಳಕೆಯೊಡೆಯುವಿಕೆಯಿಂದ ರೋಗಲಕ್ಷಣದ ಬೆಳವಣಿಗೆಯವರೆಗೆ ಸಂಘಟಿತ ಘಟನೆಗಳ ಸರಣಿಯನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ. ಆರಂಭದಲ್ಲಿ, ಎಸ್. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಅಪೋಥೆಸಿಯಾ ಎಂಬ ಅಣಬೆ ತರಹದ ರಚನೆಗಳಿಂದ ಅಮಾನತುಗೊಂಡ ಬೀಜಕಗಳನ್ನು (ಆಸ್ಕೋಸ್ಪೋರ್‌ಗಳು ಎಂದು ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ) ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ವಾಯುಗಾಮಿಯಾಗಿ ಪರಿಣಮಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸೋಂಕಿತ ಸಸ್ಯ ಶಿಲಾಖಂಡರಾಶಿಗಳ ಮೇಲೆ ಚಲನಶೀಲವಲ್ಲದ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯಾ ಆಗಿ ಬೆಳೆಯುತ್ತದೆ (ಬೋಲ್ಟನ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2006). ನಂತರ ಶಿಲೀಂಧ್ರವು ಸಸ್ಯ ಕೋಶ ಗೋಡೆಯ pH ಅನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಲು, ಕಿಣ್ವದ ಅವನತಿ ಮತ್ತು ಅಂಗಾಂಶ ಆಕ್ರಮಣವನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಲು (ಹೆಗೆಡಸ್ ಮತ್ತು ರಿಮ್ಮರ್, 2005) ಮತ್ತು ಆತಿಥೇಯ ಸಸ್ಯದ ಆಕ್ಸಿಡೇಟಿವ್ ಸ್ಫೋಟವನ್ನು ನಿಗ್ರಹಿಸಲು ವಿಷಕಾರಿ ಅಂಶವಾದ ಆಕ್ಸಲಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು ಸ್ರವಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ಆಮ್ಲೀಕರಣ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ಸಸ್ಯ ಕೋಶ ಗೋಡೆಯನ್ನು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ, ಶಿಲೀಂಧ್ರ ಕೋಶ ಗೋಡೆಯ ಅವನತಿ ಕಿಣ್ವಗಳ (CWDEs) ಸಾಮಾನ್ಯ ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆಗೆ ಅನುಕೂಲಕರ ವಾತಾವರಣವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ, ರೋಗಕಾರಕವು ಭೌತಿಕ ತಡೆಗೋಡೆಯನ್ನು ನಿವಾರಿಸಲು ಮತ್ತು ಆತಿಥೇಯ ಅಂಗಾಂಶಗಳನ್ನು ಭೇದಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ (ಮಾರ್ಸಿಯಾನೊ ಮತ್ತು ಇತರರು, 1983). ಒಮ್ಮೆ ಒಳಗೆ ಪ್ರವೇಶಿಸಿದ ನಂತರ, ಎಸ್. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಪಾಲಿಗ್ಯಾಲಕ್ಟುರೋನೇಸ್ ಮತ್ತು ಸೆಲ್ಯುಲೇಸ್‌ನಂತಹ ಹಲವಾರು CWDE ಗಳನ್ನು ಸ್ರವಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಸೋಂಕಿತ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿ ಅದರ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ಸುಗಮಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅಂಗಾಂಶ ನೆಕ್ರೋಸಿಸ್‌ಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. ಗಾಯಗಳು ಮತ್ತು ಹೈಫಲ್ ಮ್ಯಾಟ್‌ಗಳ ಪ್ರಗತಿಯು ಬಿಳಿ ಅಚ್ಚಿನ ವಿಶಿಷ್ಟ ಲಕ್ಷಣಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ (ಹೆಗೆಡಸ್ ಮತ್ತು ರಿಮ್ಮರ್, 2005). ಏತನ್ಮಧ್ಯೆ, ಆತಿಥೇಯ ಸಸ್ಯಗಳು ಪ್ಯಾಟರ್ನ್ ರೆಕಗ್ನಿಷನ್ ರಿಸೆಪ್ಟರ್‌ಗಳ (PRRs) ಮೂಲಕ ರೋಗಕಾರಕ-ಸಂಬಂಧಿತ ಆಣ್ವಿಕ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು (PAMPs) ಗುರುತಿಸುತ್ತವೆ, ಇದು ಅಂತಿಮವಾಗಿ ರಕ್ಷಣಾ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಘಟನೆಗಳ ಸರಣಿಯನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸುತ್ತದೆ.
ದಶಕಗಳ ರೋಗ ನಿಯಂತ್ರಣ ಪ್ರಯತ್ನಗಳ ಹೊರತಾಗಿಯೂ, ರೋಗಕಾರಕದ ಪ್ರತಿರೋಧ, ಬದುಕುಳಿಯುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯಿಂದಾಗಿ, ಇತರ ವಾಣಿಜ್ಯ ಬೆಳೆಗಳಂತೆ ಬೀನ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿಯೂ ಸಾಕಷ್ಟು ನಿರೋಧಕ ಜರ್ಮ್‌ಪ್ಲಾಸಂ ಕೊರತೆ ಉಳಿದಿದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ ರೋಗ ನಿರ್ವಹಣೆ ಅತ್ಯಂತ ಸವಾಲಿನದ್ದಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಸಾಂಸ್ಕೃತಿಕ ಅಭ್ಯಾಸಗಳು, ಜೈವಿಕ ನಿಯಂತ್ರಣ ಮತ್ತು ರಾಸಾಯನಿಕ ಶಿಲೀಂಧ್ರನಾಶಕಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಸಮಗ್ರ, ಬಹುಮುಖಿ ತಂತ್ರದ ಅಗತ್ಯವಿದೆ (ಒ'ಸುಲ್ಲಿವನ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2021). ಬಿಳಿ ಅಚ್ಚಿನ ರಾಸಾಯನಿಕ ನಿಯಂತ್ರಣವು ಅತ್ಯಂತ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಶಿಲೀಂಧ್ರನಾಶಕಗಳನ್ನು ಸರಿಯಾಗಿ ಮತ್ತು ಸರಿಯಾದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಅನ್ವಯಿಸಿದಾಗ, ರೋಗದ ಹರಡುವಿಕೆಯನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ನಿಯಂತ್ರಿಸಬಹುದು, ಸೋಂಕಿನ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಬಹುದು ಮತ್ತು ಇಳುವರಿ ನಷ್ಟವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಬಹುದು. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಶಿಲೀಂಧ್ರನಾಶಕಗಳ ಮೇಲಿನ ಅತಿಯಾದ ಬಳಕೆ ಮತ್ತು ಅತಿಯಾದ ಅವಲಂಬನೆಯು ಎಸ್. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್‌ನ ನಿರೋಧಕ ತಳಿಗಳ ಹೊರಹೊಮ್ಮುವಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು ಮತ್ತು ಗುರಿಯಿಲ್ಲದ ಜೀವಿಗಳು, ಮಣ್ಣಿನ ಆರೋಗ್ಯ ಮತ್ತು ನೀರಿನ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ಋಣಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ (ಲೆ ಕೊಯಿಂಟೆ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2016; ಸೆರೆಸಿನಿ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2024). ಆದ್ದರಿಂದ, ಪರಿಸರ ಸ್ನೇಹಿ ಪರ್ಯಾಯಗಳನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯುವುದು ಪ್ರಮುಖ ಆದ್ಯತೆಯಾಗಿದೆ.
ಪುಟ್ರೆಸಿನ್, ಸ್ಪೆರ್ಮಿಡಿನ್, ಸ್ಪೆರ್ಮೈನ್ ಮತ್ತು ಕ್ಯಾಡವೆರಿನ್ ನಂತಹ ಪಾಲಿಅಮೈನ್‌ಗಳು (PAಗಳು) ಮಣ್ಣಿನಿಂದ ಹರಡುವ ಸಸ್ಯ ರೋಗಕಾರಕಗಳ ವಿರುದ್ಧ ಭರವಸೆಯ ಪರ್ಯಾಯಗಳಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತವೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಅಪಾಯಕಾರಿ ರಾಸಾಯನಿಕ ಶಿಲೀಂಧ್ರನಾಶಕಗಳ ಬಳಕೆಯನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಅಥವಾ ಭಾಗಶಃ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ (ನೆಹೆಲಾ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2024; ಯಿ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2024). ಉನ್ನತ ಸಸ್ಯಗಳಲ್ಲಿ, PAಗಳು ಕೋಶ ವಿಭಜನೆ, ವ್ಯತ್ಯಾಸ ಮತ್ತು ಅಜೀವಕ ಮತ್ತು ಜೈವಿಕ ಒತ್ತಡಗಳಿಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಸೇರಿದಂತೆ ಆದರೆ ಅವುಗಳಿಗೆ ಸೀಮಿತವಾಗಿರದೆ ಅನೇಕ ಶಾರೀರಿಕ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿಸಿಕೊಂಡಿವೆ (ಕಿಲ್ಲಿನಿ ಮತ್ತು ನೆಹೆಲಾ, 2020). ಅವು ಉತ್ಕರ್ಷಣ ನಿರೋಧಕಗಳಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಆಮ್ಲಜನಕ ಪ್ರಭೇದಗಳನ್ನು (ROS) ಹೊರಹಾಕಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡಬಹುದು, ರೆಡಾಕ್ಸ್ ಹೋಮಿಯೋಸ್ಟಾಸಿಸ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು (ನೆಹೆಲಾ ಮತ್ತು ಕಿಲ್ಲಿನಿ, 2023), ರಕ್ಷಣೆಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸಬಹುದು (ರೊಮೆರೊ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2018), ವಿವಿಧ ಚಯಾಪಚಯ ಮಾರ್ಗಗಳನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಬಹುದು (ನೆಹೆಲಾ ಮತ್ತು ಕಿಲ್ಲಿನಿ, 2023), ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ ಫೈಟೊಹಾರ್ಮೋನ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾಡ್ಯುಲೇಟ್ ಮಾಡಬಹುದು (ನೆಹೆಲಾ ಮತ್ತು ಕಿಲ್ಲಿನಿ, 2019), ವ್ಯವಸ್ಥಿತ ಸ್ವಾಧೀನಪಡಿಸಿಕೊಂಡ ಪ್ರತಿರೋಧವನ್ನು (SAR) ಸ್ಥಾಪಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಸಸ್ಯ-ರೋಗಕಾರಕ ಸಂವಹನಗಳನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಬಹುದು (ನೆಹೆಲಾ ಮತ್ತು ಕಿಲ್ಲಿನಿ, 2020; ಅಸಿಜಾ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2022; ಸೆರ್ವೊನಿಕ್, 2022). ಸಸ್ಯ ರಕ್ಷಣೆಯಲ್ಲಿ PA ಗಳ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳು ಮತ್ತು ಪಾತ್ರಗಳು ಸಸ್ಯ ಪ್ರಭೇದಗಳು, ರೋಗಕಾರಕಗಳು ಮತ್ತು ಪರಿಸರ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿ ಬದಲಾಗುತ್ತವೆ ಎಂಬುದು ಗಮನಿಸಬೇಕಾದ ಸಂಗತಿ. ಸಸ್ಯಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಹೇರಳವಾಗಿರುವ PA ಅನ್ನು ಅಗತ್ಯವಾದ ಪಾಲಿಮೈನ್ L-ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನಿಂದ ಜೈವಿಕ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (ಕಿಲ್ಲಿನಿ ಮತ್ತು ನೆಹೆಲಾ, 2020).
ಸಸ್ಯಗಳ ಬೆಳವಣಿಗೆ ಮತ್ತು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯಲ್ಲಿ ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಬಹು ಪಾತ್ರಗಳನ್ನು ವಹಿಸುತ್ತದೆ. ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಅಕ್ಕಿಯಲ್ಲಿ (ಒರಿಜಾ ಸಟಿವಾ), ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಸಾರಜನಕ ಮರುಬಳಕೆ (ಲಿಯು ಮತ್ತು ಇತರರು, 2018), ಅಕ್ಕಿ ಇಳುವರಿ, ಗುಣಮಟ್ಟ ಮತ್ತು ಸುವಾಸನೆ (ಲು ಮತ್ತು ಇತರರು, 2020), ಮತ್ತು ನೀರಿನ ಒತ್ತಡದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ (ಯಾಂಗ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2000) ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿರಬಹುದು ಎಂದು ತೋರಿಸಿವೆ. ಇದಲ್ಲದೆ, ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನ ಬಾಹ್ಯ ಅನ್ವಯಿಕೆಯು ಸಕ್ಕರೆ ಬೀಟ್‌ನಲ್ಲಿ (ಬೀಟಾ ವಲ್ಗ್ಯಾರಿಸ್) ಬರ ಸಹಿಷ್ಣುತೆಯನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿಸಿತು (ಹುಸೇನ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2019) ಮತ್ತು ಈರುಳ್ಳಿಯಲ್ಲಿ (ಅಲಿಯಮ್ ಸೆಪಾ) (Çavuşoǧlu ಮತ್ತು Çavuşoǧlu, 2021) ಮತ್ತು ಗೋಡಂಬಿ (ಅನಾಕಾರ್ಡಿಯಂ ಆಕ್ಸಿಡೆಂಟೇಲ್) ಸಸ್ಯಗಳಲ್ಲಿ (ಡಾ ರೋಚಾ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2012) ಉಪ್ಪಿನ ಒತ್ತಡವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿತು. ಅಜೀವಕ ಒತ್ತಡ ರಕ್ಷಣೆಯಲ್ಲಿ ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನ ಸಂಭಾವ್ಯ ಪಾತ್ರವು ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಸಸ್ಯಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಲಿನ್ ಸಂಗ್ರಹಣೆಯಲ್ಲಿ ಅದರ ಒಳಗೊಳ್ಳುವಿಕೆಯಿಂದಾಗಿರಬಹುದು. ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಡೆಲ್ಟಾ ಅಮಿನೊಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫರೇಸ್ (ಡೆಲ್ಟಾ-OAT) ಮತ್ತು ಪ್ರೊಲಿನ್ ಡಿಹೈಡ್ರೋಜಿನೇಸ್ (ProDH1 ಮತ್ತು ProDH2) ಜೀನ್‌ಗಳಂತಹ ಪ್ರೋಲಿನ್ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಜೀನ್‌ಗಳು, ನಿಕೋಟಿಯಾನಾ ಬೆಂಥಾಮಿಯಾನಾ ಮತ್ತು ಅರಬಿಡೋಪ್ಸಿಸ್ ಥಾಲಿಯಾನಾಗಳನ್ನು ಹೋಸ್ಟ್ ಅಲ್ಲದ ಸ್ಯೂಡೋಮೊನಾಸ್ ಸಿರಿಂಗೆ ತಳಿಗಳ ವಿರುದ್ಧ ರಕ್ಷಿಸುವಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿಸಿಕೊಂಡಿವೆ ಎಂದು ಈ ಹಿಂದೆ ವರದಿಯಾಗಿದೆ (ಸೆಂತಿಲ್-ಕುಮಾರ್ ಮತ್ತು ಮೈಸೂರು, 2012). ಮತ್ತೊಂದೆಡೆ, ರೋಗಕಾರಕ ಬೆಳವಣಿಗೆಗೆ ಶಿಲೀಂಧ್ರ ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಡೆಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿಲೇಸ್ (ODC) ಅಗತ್ಯವಿದೆ (ಸಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2020). ಹೋಸ್ಟ್-ಪ್ರೇರಿತ ಜೀನ್ ಸೈಲೆನ್ಸಿಂಗ್ (HIGS) ಮೂಲಕ ಫ್ಯುಸಾರಿಯಮ್ ಆಕ್ಸಿಸ್ಪೋರಮ್ f. sp. ಲೈಕೋಪೆರ್ಸಿಸಿಯ ODC ಅನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸಿಕೊಳ್ಳುವುದು ಫ್ಯುಸಾರಿಯಮ್ ವಿಲ್ಟ್‌ಗೆ ಟೊಮೆಟೊ ಸಸ್ಯಗಳ ಪ್ರತಿರೋಧವನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿಸಿದೆ (ಸಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2020). ಆದಾಗ್ಯೂ, ಫೈಟೊಪಾಥೋಜೆನ್‌ಗಳಂತಹ ಜೈವಿಕ ಒತ್ತಡಗಳ ವಿರುದ್ಧ ಬಾಹ್ಯ ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಅನ್ವಯದ ಸಂಭಾವ್ಯ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಚೆನ್ನಾಗಿ ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲಾಗಿಲ್ಲ. ಇನ್ನೂ ಮುಖ್ಯವಾಗಿ, ರೋಗ ನಿರೋಧಕತೆಯ ಮೇಲೆ ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನ ಪರಿಣಾಮಗಳು ಮತ್ತು ಅದಕ್ಕೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಜೀವರಾಸಾಯನಿಕ ಮತ್ತು ಶಾರೀರಿಕ ವಿದ್ಯಮಾನಗಳು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಅನ್ವೇಷಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿಲ್ಲ.
ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ನಿಯಂತ್ರಣ ತಂತ್ರಗಳ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಗೆ ದ್ವಿದಳ ಧಾನ್ಯಗಳ ಎಸ್. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೋರಮ್ ಸೋಂಕಿನ ಸಂಕೀರ್ಣತೆಯನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳುವುದು ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ. ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ, ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿನಿಯಾ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೋರಮ್ ಸೋಂಕಿಗೆ ದ್ವಿದಳ ಧಾನ್ಯ ಸಸ್ಯಗಳ ರಕ್ಷಣಾ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರತಿರೋಧವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುವಲ್ಲಿ ಪ್ರಮುಖ ಅಂಶವಾಗಿ ಡೈಮೈನ್ ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನ ಸಂಭಾವ್ಯ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಗುರುತಿಸುವ ಗುರಿಯನ್ನು ನಾವು ಹೊಂದಿದ್ದೇವೆ. ಸೋಂಕಿತ ಸಸ್ಯಗಳ ರಕ್ಷಣಾ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುವುದರ ಜೊತೆಗೆ, ರೆಡಾಕ್ಸ್ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಕಾಪಾಡಿಕೊಳ್ಳುವಲ್ಲಿ ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಸಹ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರ ವಹಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಊಹಿಸುತ್ತೇವೆ. ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನ ಸಂಭಾವ್ಯ ಪರಿಣಾಮಗಳು ಕಿಣ್ವಕ ಮತ್ತು ಕಿಣ್ವಕವಲ್ಲದ ಉತ್ಕರ್ಷಣ ನಿರೋಧಕ ರಕ್ಷಣಾ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ನಿಯಂತ್ರಣ ಮತ್ತು ಶಿಲೀಂಧ್ರ ರೋಗಕಾರಕತೆ/ವೈರಲೆನ್ಸ್ ಅಂಶಗಳು ಮತ್ತು ಸಂಬಂಧಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳೊಂದಿಗಿನ ಹಸ್ತಕ್ಷೇಪಕ್ಕೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿವೆ ಎಂದು ನಾವು ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸುತ್ತೇವೆ. ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನ ಈ ದ್ವಿಮುಖ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಣೆಯು ಬಿಳಿ ಅಚ್ಚಿನ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ತಗ್ಗಿಸಲು ಮತ್ತು ಈ ಪ್ರಬಲ ಶಿಲೀಂಧ್ರ ರೋಗಕಾರಕಕ್ಕೆ ಸಾಮಾನ್ಯ ದ್ವಿದಳ ಧಾನ್ಯ ಬೆಳೆಗಳ ಪ್ರತಿರೋಧವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಸುಸ್ಥಿರ ತಂತ್ರಕ್ಕೆ ಭರವಸೆಯ ಅಭ್ಯರ್ಥಿಯನ್ನಾಗಿ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಪ್ರಸ್ತುತ ಅಧ್ಯಯನದ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಬಿಳಿ ಅಚ್ಚನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಲು ಮತ್ತು ದ್ವಿದಳ ಧಾನ್ಯ ಉತ್ಪಾದನೆಯ ಮೇಲೆ ಅದರ ಪ್ರಭಾವವನ್ನು ತಗ್ಗಿಸಲು ನವೀನ, ಪರಿಸರ ಸ್ನೇಹಿ ವಿಧಾನಗಳ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯಲ್ಲಿ ಸಹಾಯ ಮಾಡಬಹುದು.
ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ, ಸಾಮಾನ್ಯ ಬೀನ್ಸ್‌ನ ಒಂದು ಸೂಕ್ಷ್ಮ ವಾಣಿಜ್ಯ ವಿಧವಾದ ಗಿಜಾ 3 (ಫಾಸಿಯೋಲಸ್ ವಲ್ಗ್ಯಾರಿಸ್ ಎಲ್. ಸಿವಿ. ಗಿಜಾ 3) ಅನ್ನು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ವಸ್ತುವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಈಜಿಪ್ಟ್‌ನ ದ್ವಿದಳ ಧಾನ್ಯ ಸಂಶೋಧನಾ ಇಲಾಖೆ, ಕ್ಷೇತ್ರ ಬೆಳೆ ಸಂಶೋಧನಾ ಸಂಸ್ಥೆ (ಎಫ್‌ಸಿಆರ್‌ಐ), ಕೃಷಿ ಸಂಶೋಧನಾ ಕೇಂದ್ರ (ಎಆರ್‌ಸಿ) ಆರೋಗ್ಯಕರ ಬೀಜಗಳನ್ನು ದಯೆಯಿಂದ ಒದಗಿಸಲಾಯಿತು. ಹಸಿರುಮನೆ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ (25 ± 2 °C, ಸಾಪೇಕ್ಷ ಆರ್ದ್ರತೆ 75 ± 1%, 8 ಗಂಟೆ ಬೆಳಕು/16 ಗಂಟೆ ಕತ್ತಲೆ) ಎಸ್. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್-ಸೋಂಕಿತ ಮಣ್ಣಿನಿಂದ ತುಂಬಿದ ಪ್ಲಾಸ್ಟಿಕ್ ಮಡಕೆಗಳಲ್ಲಿ (ಒಳಗಿನ ವ್ಯಾಸ 35 ಸೆಂ.ಮೀ, ಆಳ 50 ಸೆಂ.ಮೀ) ಐದು ಬೀಜಗಳನ್ನು ಬಿತ್ತಲಾಯಿತು. ಬಿತ್ತನೆ ಮಾಡಿದ 7-10 ದಿನಗಳಲ್ಲಿ (ಡಿಪಿಎಸ್), ಪ್ರತಿ ಮಡಕೆಯಲ್ಲಿ ಏಕರೂಪದ ಬೆಳವಣಿಗೆ ಮತ್ತು ಮೂರು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ವಿಸ್ತರಿಸಿದ ಎಲೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಎರಡು ಮೊಳಕೆಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಬಿಡಲು ಸಸಿಗಳನ್ನು ತೆಳುಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. ಎಲ್ಲಾ ಮಡಕೆ ಸಸ್ಯಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿ ಎರಡು ವಾರಗಳಿಗೊಮ್ಮೆ ನೀರಿಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವೈವಿಧ್ಯಕ್ಕೆ ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಿದ ದರದಲ್ಲಿ ಮಾಸಿಕ ಫಲವತ್ತಾಗಿಸಲಾಯಿತು.
500 mg/L ಸಾಂದ್ರತೆಯ L-ಆರ್ನಿಥಿನೆಡಿಯಾಮೈನ್ ((+)-(S)-2,5-ಡೈಅಮಿನೊಪೆಂಟಾನೊಯಿಕ್ ಆಮ್ಲ ಎಂದೂ ಕರೆಯುತ್ತಾರೆ; ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್, ಡಾರ್ಮ್‌ಸ್ಟಾಡ್ಟ್, ಜರ್ಮನಿ) ತಯಾರಿಸಲು, 50 mg ಅನ್ನು ಮೊದಲು 100 mL ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ಬಟ್ಟಿ ಇಳಿಸಿದ ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಕರಗಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಸ್ಟಾಕ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರದ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, ಆರು ಸರಣಿಯ L-ಆರ್ನಿಥಿನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳನ್ನು (12.5, 25, 50, 75, 100, ಮತ್ತು 125 mg/L) ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು. ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ಬಟ್ಟಿ ಇಳಿಸಿದ ನೀರನ್ನು ನಕಾರಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ (ಮಾಕ್) ಮತ್ತು ವಾಣಿಜ್ಯ ಶಿಲೀಂಧ್ರನಾಶಕ "ರಿಜೋಲೆಕ್ಸ್-ಟಿ" 50% ತೇವಗೊಳಿಸಬಹುದಾದ ಪುಡಿ (ಟೋಕ್ಲೋಫೋಸ್-ಮೀಥೈಲ್ 20% + ಥಿರಮ್ 30%; KZ-ಕಾಫ್ರ್ ಎಲ್ ಜಯಾತ್ ಕೀಟನಾಶಕಗಳು ಮತ್ತು ರಾಸಾಯನಿಕಗಳು ಕಂಪನಿ, ಕಾಫ್ರ್ ಎಲ್ ಜಯಾತ್, ಘರ್ಬಿಯಾ ಗವರ್ನರೇಟ್, ಈಜಿಪ್ಟ್) ಧನಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು. ವಾಣಿಜ್ಯ ಶಿಲೀಂಧ್ರನಾಶಕ "ರಿಜೋಲೆಕ್ಸ್-ಟಿ" ಅನ್ನು ಐದು ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ (2, 4, 6, 8 ಮತ್ತು 10 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಲೀ) ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು.
ಬಿಳಿ ಅಚ್ಚಿನ ವಿಶಿಷ್ಟ ಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುವ ಸಾಮಾನ್ಯ ಹುರುಳಿ ಕಾಂಡಗಳು ಮತ್ತು ಬೀಜಕೋಶಗಳ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು (ಸೋಂಕಿನ ಪ್ರಮಾಣ: 10–30%) ವಾಣಿಜ್ಯ ತೋಟಗಳಿಂದ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸೋಂಕಿತ ಸಸ್ಯ ಸಾಮಗ್ರಿಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನವುಗಳನ್ನು ಜಾತಿಗಳು/ವೈವಿಧ್ಯದಿಂದ (ಸೂಕ್ಷ್ಮ ವಾಣಿಜ್ಯ ಪ್ರಭೇದ ಗಿಜಾ 3) ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದ್ದರೂ, ಇತರವುಗಳು, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಸ್ಥಳೀಯ ಮಾರುಕಟ್ಟೆಗಳಿಂದ ಪಡೆದವುಗಳು, ಅಪರಿಚಿತ ಜಾತಿಗಳಾಗಿದ್ದವು. ಸಂಗ್ರಹಿಸಿದ ಸೋಂಕಿತ ವಸ್ತುಗಳನ್ನು ಮೊದಲು 0.5% ಸೋಡಿಯಂ ಹೈಪೋಕ್ಲೋರೈಟ್ ದ್ರಾವಣದಿಂದ 3 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಮೇಲ್ಮೈಯಲ್ಲಿ ಸೋಂಕುರಹಿತಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, ನಂತರ ಸ್ಟೆರೈಲ್ ಡಿಸ್ಟಿಲ್ಡ್ ವಾಟರ್‌ನಿಂದ ಹಲವಾರು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚುವರಿ ನೀರನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಸ್ಟೆರೈಲ್ ಫಿಲ್ಟರ್ ಪೇಪರ್‌ನಿಂದ ಒಣಗಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಸೋಂಕಿತ ಅಂಗಗಳನ್ನು ಮಧ್ಯದ ಅಂಗಾಂಶದಿಂದ (ಆರೋಗ್ಯಕರ ಮತ್ತು ಸೋಂಕಿತ ಅಂಗಾಂಶಗಳ ನಡುವೆ) ಸಣ್ಣ ತುಂಡುಗಳಾಗಿ ಕತ್ತರಿಸಲಾಯಿತು, ಆಲೂಗಡ್ಡೆ ಡೆಕ್ಸ್ಟ್ರೋಸ್ ಅಗರ್ (ಪಿಡಿಎ) ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯಾ ರಚನೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಲು 25 ± 2 °C ನಲ್ಲಿ 12 ಗಂಟೆಗಳ ಬೆಳಕು/12 ಗಂಟೆಗಳ ಡಾರ್ಕ್ ಸೈಕಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ 5 ದಿನಗಳವರೆಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. ಮಿಶ್ರ ಅಥವಾ ಕಲುಷಿತ ಸಂಸ್ಕೃತಿಗಳಿಂದ ಶಿಲೀಂಧ್ರ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಗಳನ್ನು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲು ಮೈಸಿಲಿಯಲ್ ತುದಿ ವಿಧಾನವನ್ನು ಸಹ ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಶಿಲೀಂಧ್ರ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯನ್ನು ಮೊದಲು ಅದರ ಸಾಂಸ್ಕೃತಿಕ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಗುರುತಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕ ವೈಶಿಷ್ಟ್ಯಗಳ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಎಸ್. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಎಂದು ದೃಢಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಎಲ್ಲಾ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಗಳನ್ನು ಕೋಚ್‌ನ ನಿಲುವುಗಳನ್ನು ಪೂರೈಸಲು ಒಳಗಾಗುವ ಸಾಮಾನ್ಯ ಬೀನ್ ತಳಿ ಗಿಜಾ 3 ನಲ್ಲಿ ರೋಗಕಾರಕತೆಗಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು.
ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ವೈಟ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 1990; ಬಟುರೊ-ಸಿಸ್ನಿವ್ಸ್ಕಾ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2017 ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಆಂತರಿಕ ಲಿಪ್ಯಂತರ ಸ್ಪೇಸರ್ (ITS) ಅನುಕ್ರಮದ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಅತ್ಯಂತ ಆಕ್ರಮಣಕಾರಿ S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಐಸೊಲೇಟ್ (ಐಸೊಲೇಟ್ #3) ಅನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ದೃಢಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಐಸೊಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಆಲೂಗಡ್ಡೆ ಡೆಕ್ಸ್ಟ್ರೋಸ್ ಸಾರು (PDB) ನಲ್ಲಿ ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 25 ± 2 °C ನಲ್ಲಿ 5–7 ದಿನಗಳವರೆಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಶಿಲೀಂಧ್ರದ ಮೈಸಿಲಿಯಮ್ ಅನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ, ಚೀಸ್‌ಕ್ಲಾತ್ ಮೂಲಕ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಿ, ಎರಡು ಬಾರಿ ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ನೀರಿನಿಂದ ತೊಳೆದು, ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ಫಿಲ್ಟರ್ ಪೇಪರ್‌ನಿಂದ ಒಣಗಿಸಲಾಯಿತು. ಕ್ವಿಕ್-ಡಿಎನ್‌ಎ™ ಶಿಲೀಂಧ್ರ/ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಮಿನಿಪ್ರೆಪ್ ಕಿಟ್ (ಕುರಾಮೇ-ಇಜಿಯೋಕಾ, 1997; ಅಟಲ್ಲಾ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2022, 2024) ಬಳಸಿ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ITS rDNA ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್ ಜೋಡಿ ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; ನಿರೀಕ್ಷಿತ ಗಾತ್ರ: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017) ಬಳಸಿ ವರ್ಧಿಸಲಾಯಿತು. ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ PCR ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕಾಗಿ ಸಲ್ಲಿಸಲಾಯಿತು (ಬೀಜಿಂಗ್ ಅಯೋಕೆ ಡಿಂಗ್‌ಶೆಂಗ್ ಬಯೋಟೆಕ್ನಾಲಜಿ ಕಂ., ಲಿಮಿಟೆಡ್). ITS rDNA ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಸ್ಯಾಂಗರ್ ಅನುಕ್ರಮ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ದ್ವಿಮುಖವಾಗಿ ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಜೋಡಿಸಲಾದ ಪ್ರಶ್ನೆ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು BLASTn ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಬಳಸಿ ಜೆನ್‌ಬ್ಯಾಂಕ್ ಮತ್ತು ರಾಷ್ಟ್ರೀಯ ಜೈವಿಕ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನ ಮಾಹಿತಿ ಕೇಂದ್ರ (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) ದಲ್ಲಿನ ಇತ್ತೀಚಿನ ಡೇಟಾದೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರಶ್ನೆ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಆಣ್ವಿಕ ವಿಕಸನ ಜೆನೆಟಿಕ್ಸ್ ಅನಾಲಿಸಿಸ್ ಪ್ಯಾಕೇಜ್ (MEGA-11; ಆವೃತ್ತಿ 11) ನಲ್ಲಿ ಕ್ಲಸ್ಟಲ್‌ಡಬ್ಲ್ಯೂ ಬಳಸಿ NCBI ಜೆನ್‌ಬ್ಯಾಂಕ್ (ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ S1) ನಲ್ಲಿನ ಇತ್ತೀಚಿನ ಡೇಟಾದಿಂದ ಪಡೆಯಲಾದ 20 ಇತರ S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ತಳಿಗಳು/ಐಸೊಲೇಟ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಲಾಯಿತು (ಕುಮಾರ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2024). ಗರಿಷ್ಠ ಸಾಧ್ಯತೆ ವಿಧಾನ ಮತ್ತು ಸಾಮಾನ್ಯ ಸಮಯ-ಹಿಂತಿರುಗಿಸಬಹುದಾದ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್ ಪರ್ಯಾಯ ಮಾದರಿಯನ್ನು (ನೀ ಮತ್ತು ಕುಮಾರ್, 2000) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ವಿಕಸನೀಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಹೆಚ್ಚಿನ ಲಾಗ್-ಸಂಭವನೀಯತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಮರವನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ನೆರೆಹೊರೆಯ-ಸೇರುವ (NJ) ಮರ (ಕುಮಾರ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2024) ಮತ್ತು ಗರಿಷ್ಠ ಪಾರ್ಸಿಮೋನಿ (MP) ಮರದ ನಡುವಿನ ಹೆಚ್ಚಿನ ಲಾಗ್-ಸಂಭವನೀಯತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಮರವನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಹ್ಯೂರಿಸ್ಟಿಕ್ ಹುಡುಕಾಟಕ್ಕಾಗಿ ಆರಂಭಿಕ ಮರವನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸಾಮಾನ್ಯ ಸಮಯ-ಹಿಂತಿರುಗಿಸಬಹುದಾದ ಮಾದರಿಯನ್ನು (ನೀ ಮತ್ತು ಕುಮಾರ್, 2000) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿದ ಜೋಡಿಯಾಗಿ ದೂರ ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು NJ ಮರವನ್ನು ನಿರ್ಮಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಮತ್ತು ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾನಾಶಕ "ರಿಜೋಲೆಕ್ಸ್-ಟಿ" ಯ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾ ವಿರೋಧಿ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಅಗರ್ ಪ್ರಸರಣ ವಿಧಾನದಿಂದ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು. ವಿಧಾನ: ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್ (500 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಲೀ) ನ ಸ್ಟಾಕ್ ದ್ರಾವಣದ ಸೂಕ್ತ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಂಡು ಅದನ್ನು 10 ಮಿಲಿ ಪಿಡಿಎ ಪೌಷ್ಟಿಕ ಮಾಧ್ಯಮದೊಂದಿಗೆ ಚೆನ್ನಾಗಿ ಬೆರೆಸಿ ಕ್ರಮವಾಗಿ 12.5, 25, 50, 75, 100 ಮತ್ತು 125 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಲೀ ಅಂತಿಮ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳೊಂದಿಗೆ ದ್ರಾವಣಗಳನ್ನು ತಯಾರಿಸಿ. ಐದು ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಶಿಲೀಂಧ್ರನಾಶಕ "ರಿಜೋಲೆಕ್ಸ್-ಟಿ" (2, 4, 6, 8 ಮತ್ತು 10 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಲೀ) ಮತ್ತು ಸ್ಟೆರೈಲ್ ಡಿಸ್ಟಿಲ್ಡ್ ವಾಟರ್ ಅನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಮಾಧ್ಯಮವು ಘನೀಕರಿಸಿದ ನಂತರ, 4 ಮಿಮೀ ವ್ಯಾಸದ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿನಿಯಾ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯ ಹೊಸದಾಗಿ ತಯಾರಿಸಿದ ಮೈಸಿಲಿಯಲ್ ಪ್ಲಗ್ ಅನ್ನು ಪೆಟ್ರಿ ಭಕ್ಷ್ಯದ ಮಧ್ಯಭಾಗಕ್ಕೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮೈಸಿಲಿಯಮ್ ಸಂಪೂರ್ಣ ನಿಯಂತ್ರಣ ಪೆಟ್ರಿ ಭಕ್ಷ್ಯವನ್ನು ಆವರಿಸುವವರೆಗೆ 25±2°C ನಲ್ಲಿ ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು, ನಂತರ ಶಿಲೀಂಧ್ರದ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ದಾಖಲಿಸಲಾಯಿತು. ಸಮೀಕರಣ 1 ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್‌ನ ರೇಡಿಯಲ್ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಶೇಕಡಾವಾರು ಪ್ರತಿಬಂಧವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿ:
ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಎರಡು ಬಾರಿ ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲಾಯಿತು, ಪ್ರತಿ ನಿಯಂತ್ರಣ/ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಗುಂಪಿಗೆ ಆರು ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗೆ ಐದು ಮಡಕೆಗಳು (ಪ್ರತಿ ಮಡಕೆಗೆ ಎರಡು ಸಸ್ಯಗಳು). ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ನಿಖರತೆ, ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹತೆ ಮತ್ತು ಪುನರುತ್ಪಾದನಾ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಪ್ರತಿ ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಯನ್ನು ಎರಡು ಬಾರಿ (ಎರಡು ತಾಂತ್ರಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳು) ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಅರ್ಧ-ಗರಿಷ್ಠ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಸಾಂದ್ರತೆ (IC50) ಮತ್ತು IC99 (ಪ್ರೆಂಟಿಸ್, 1976) ಅನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಲು ಪ್ರೋಬಿಟ್ ರಿಗ್ರೆಷನ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು.
ಹಸಿರುಮನೆ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲು, ಸತತ ಎರಡು ಮಡಕೆ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, ಮಡಕೆಗಳನ್ನು ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ಜೇಡಿಮಣ್ಣು-ಮರಳು ಮಣ್ಣಿನಿಂದ ತುಂಬಿಸಿ (3:1) ಮತ್ತು ಹೊಸದಾಗಿ ತಯಾರಿಸಿದ ಎಸ್. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯಿಂದ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದು ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, ಎಸ್. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ (ಐಸೋಲೇಟ್ #3) ನ ಅತ್ಯಂತ ಆಕ್ರಮಣಕಾರಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯನ್ನು ಒಂದು ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯಂ ಅನ್ನು ಅರ್ಧದಷ್ಟು ಕತ್ತರಿಸಿ, ಅದನ್ನು ಪಿಡಿಎ ಮೇಲೆ ಮುಖಾಮುಖಿಯಾಗಿ ಇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಕವಕಜಾಲದ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಲು 25 ° C ನಲ್ಲಿ ನಿರಂತರ ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ (24 ಗಂಟೆಗಳು) 4 ದಿನಗಳವರೆಗೆ ಕಾವುಕೊಡುವ ಮೂಲಕ ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ನಾಲ್ಕು 5 ಮಿಮೀ ವ್ಯಾಸದ ಅಗರ್ ಪ್ಲಗ್‌ಗಳನ್ನು ಮುಂಚೂಣಿಯಿಂದ ತೆಗೆದುಕೊಂಡು ಗೋಧಿ ಮತ್ತು ಅಕ್ಕಿ ಹೊಟ್ಟಿನ 100 ಗ್ರಾಂ ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ಮಿಶ್ರಣದಿಂದ (1:1, v/v) ಚುಚ್ಚುಮದ್ದು ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯಾ ರಚನೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಲು ಎಲ್ಲಾ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್‌ಗಳನ್ನು 25 ± 2 ° C ನಲ್ಲಿ 5 ದಿನಗಳವರೆಗೆ 12 ಗಂಟೆಗಳ ಬೆಳಕು/12 ಗಂಟೆಗಳ ಡಾರ್ಕ್ ಚಕ್ರದಲ್ಲಿ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದು ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಮಣ್ಣನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೊದಲು ಏಕರೂಪತೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಎಲ್ಲಾ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್‌ಗಳ ವಿಷಯಗಳನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಬೆರೆಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ, ರೋಗಕಾರಕಗಳ ನಿರಂತರ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಪ್ರತಿ ಮಡಕೆಗೆ 100 ಗ್ರಾಂ ವಸಾಹತು ಹೊಟ್ಟು ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ಶಿಲೀಂಧ್ರಗಳ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲು ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ಮಡಕೆಗಳಿಗೆ ನೀರುಣಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 7 ದಿನಗಳವರೆಗೆ ಹಸಿರುಮನೆ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಯಿತು.
ನಂತರ ಪ್ರತಿ ಮಡಕೆಯಲ್ಲಿ ಗಿಜಾ 3 ವಿಧದ ಐದು ಬೀಜಗಳನ್ನು ಬಿತ್ತಲಾಯಿತು. ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಮತ್ತು ಶಿಲೀಂಧ್ರನಾಶಕ ರೈಜೋಲೆಕ್ಸ್-ಟಿ ಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಮಡಕೆಗಳಿಗೆ, ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ಬೀಜಗಳನ್ನು ಮೊದಲು ಕ್ರಮವಾಗಿ ಸುಮಾರು 250 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಲೀ ಮತ್ತು 50 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಲೀ ಅಂತಿಮ IC99 ಸಾಂದ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ ಎರಡು ಸಂಯುಕ್ತಗಳ ಜಲೀಯ ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ ಎರಡು ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ನೆನೆಸಿ, ನಂತರ ಬಿತ್ತನೆ ಮಾಡುವ ಮೊದಲು ಒಂದು ಗಂಟೆ ಗಾಳಿಯಲ್ಲಿ ಒಣಗಿಸಲಾಯಿತು. ಮತ್ತೊಂದೆಡೆ, ನಕಾರಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣಕ್ಕಾಗಿ ಬೀಜಗಳನ್ನು ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ಬಟ್ಟಿ ಇಳಿಸಿದ ನೀರಿನಲ್ಲಿ ನೆನೆಸಲಾಯಿತು. 10 ದಿನಗಳ ನಂತರ, ಮೊದಲ ನೀರುಹಾಕುವ ಮೊದಲು, ಸಸಿಗಳನ್ನು ತೆಳುಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, ಪ್ರತಿ ಮಡಕೆಯಲ್ಲಿ ಕೇವಲ ಎರಡು ಅಚ್ಚುಕಟ್ಟಾದ ಸಸಿಗಳನ್ನು ಬಿಡಲಾಯಿತು. ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ಎಸ್. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಸೋಂಕನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು, ಒಂದೇ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಹಂತದಲ್ಲಿ (10 ದಿನಗಳು) ಒಂದೇ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಹಂತದಲ್ಲಿ (10 ದಿನಗಳು) ಹುರುಳಿ ಸಸ್ಯದ ಕಾಂಡಗಳನ್ನು ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ಸ್ಕಾಲ್ಪೆಲ್ ಬಳಸಿ ಎರಡು ವಿಭಿನ್ನ ಸ್ಥಳಗಳಲ್ಲಿ ಕತ್ತರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಗಾಯಕ್ಕೆ ಸರಿಸುಮಾರು 0.5 ಗ್ರಾಂ ವಸಾಹತುಶಾಹಿ ಹೊಟ್ಟು ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಇರಿಸಲಾಯಿತು, ನಂತರ ಎಲ್ಲಾ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ಸಸ್ಯಗಳಲ್ಲಿ ಸೋಂಕು ಮತ್ತು ರೋಗ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಲು ಹೆಚ್ಚಿನ ಆರ್ದ್ರತೆಯನ್ನು ನೀಡಲಾಯಿತು. ನಿಯಂತ್ರಣ ಸಸ್ಯಗಳನ್ನು ಇದೇ ರೀತಿ ಗಾಯಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಅದೇ ಪ್ರಮಾಣದ (0.5 ಗ್ರಾಂ) ಬರಡಾದ, ವಸಾಹತುರಹಿತ ಹೊಟ್ಟು ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಗಾಯಕ್ಕೆ ಹಾಕಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ರೋಗದ ಬೆಳವಣಿಗೆಗೆ ಪರಿಸರವನ್ನು ಅನುಕರಿಸಲು ಮತ್ತು ಚಿಕಿತ್ಸಾ ಗುಂಪುಗಳ ನಡುವೆ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಹೆಚ್ಚಿನ ಆರ್ದ್ರತೆಯ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಯಿತು.
ಸಂಸ್ಕರಣಾ ವಿಧಾನ: ಬೀನ್ ಸಸಿಗಳಿಗೆ 500 ಮಿಲಿ ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್ (250 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಲೀ) ಜಲೀಯ ದ್ರಾವಣ ಅಥವಾ ಶಿಲೀಂಧ್ರನಾಶಕ ರೈಜೋಲೆಕ್ಸ್-ಟಿ (50 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಲೀ) ನೊಂದಿಗೆ ಮಣ್ಣಿಗೆ ನೀರುಣಿಸಲಾಯಿತು, ನಂತರ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯನ್ನು 10 ದಿನಗಳ ಮಧ್ಯಂತರದಲ್ಲಿ ಮೂರು ಬಾರಿ ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ಲಸೀಬೊ-ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ನಿಯಂತ್ರಣಗಳನ್ನು 500 ಮಿಲಿ ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ಬಟ್ಟಿ ಇಳಿಸಿದ ನೀರಿನಿಂದ ನೀರಾವರಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಎಲ್ಲಾ ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳನ್ನು ಹಸಿರುಮನೆ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ (25 ± 2°C, 75 ± 1% ಸಾಪೇಕ್ಷ ಆರ್ದ್ರತೆ ಮತ್ತು 8 ಗಂಟೆಗಳ ಬೆಳಕು/16 ಗಂಟೆಗಳ ಕತ್ತಲೆಯ ದ್ಯುತಿ ಅವಧಿ) ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಎಲ್ಲಾ ಮಡಕೆಗಳಿಗೆ ಹದಿನೈದು ದಿನಗಳಿಗೊಮ್ಮೆ ನೀರುಣಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮಾಸಿಕವಾಗಿ ಸಮತೋಲಿತ NPK ಗೊಬ್ಬರದೊಂದಿಗೆ (20-20-20, 3.6% ಸಲ್ಫರ್ ಮತ್ತು TE ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಅಂಶಗಳೊಂದಿಗೆ; ಜೈನ್ ಸೀಡ್ಸ್, ಈಜಿಪ್ಟ್) ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವಿಧದ ಶಿಫಾರಸುಗಳು ಮತ್ತು ತಯಾರಕರ ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಎಲೆಗಳ ಮೇಲೆ ಸಿಂಪಡಿಸುವ ಮೂಲಕ 3-4 ಗ್ರಾಂ/ಲೀ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಸಂಸ್ಕರಿಸಲಾಯಿತು. ಬೇರೆ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಹೇಳದ ಹೊರತು, ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ವಿಸ್ತರಿಸಿದ ಪ್ರೌಢ ಎಲೆಗಳನ್ನು (ಮೇಲಿನಿಂದ 2 ನೇ ಮತ್ತು 3 ನೇ ಎಲೆಗಳು) ಪ್ರತಿ ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಯಿಂದ 72 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರದ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯಲ್ಲಿ (hpt) ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ, ಏಕರೂಪಗೊಳಿಸಿ, ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳಿಗಾಗಿ -80 °C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು, ಇದರಲ್ಲಿ ಆಕ್ಸಿಡೇಟಿವ್ ಒತ್ತಡ ಸೂಚಕಗಳ ಸಿತು ಹಿಸ್ಟೋಕೆಮಿಕಲ್ ಸ್ಥಳೀಕರಣ, ಲಿಪಿಡ್ ಪೆರಾಕ್ಸಿಡೇಶನ್, ಕಿಣ್ವ ಮತ್ತು ಕಿಣ್ವವಲ್ಲದ ಉತ್ಕರ್ಷಣ ನಿರೋಧಕಗಳು ಮತ್ತು ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಸೇರಿವೆ.
ಟೆರಾನ್ ಮತ್ತು ಇತರರು (2006) ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಪೆಟ್ಜೋಲ್ಡ್ಟ್ ಮತ್ತು ಡಿಕ್ಸನ್ ಮಾಪಕವನ್ನು (1996) ಆಧರಿಸಿ 1–9 (ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ S2) ಮಾಪಕವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಬಿಳಿ ಅಚ್ಚು ಸೋಂಕಿನ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು ವಾರಕ್ಕೊಮ್ಮೆ 21 ದಿನಗಳ ನಂತರ ಇನಾಕ್ಯುಲೇಷನ್ ನಂತರ (dpi) ನಿರ್ಣಯಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಇಂಟರ್ನೋಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ನೋಡ್‌ಗಳ ಉದ್ದಕ್ಕೂ ಗಾಯಗಳ ಪ್ರಗತಿಯನ್ನು ಅನುಸರಿಸಲು ಇನಾಕ್ಯುಲೇಷನ್ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿ ಬೀನ್ ಸಸ್ಯಗಳ ಕಾಂಡಗಳು ಮತ್ತು ಕೊಂಬೆಗಳನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಇನಾಕ್ಯುಲೇಷನ್ ಬಿಂದುವಿನಿಂದ ಕಾಂಡ ಅಥವಾ ಶಾಖೆಯ ಉದ್ದಕ್ಕೂ ದೂರದ ಬಿಂದುವಿಗೆ ಗಾಯದ ಅಂತರವನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಗಾಯದ ಸ್ಥಳವನ್ನು ಆಧರಿಸಿ 1–9 ಅಂಕಗಳನ್ನು ನಿಗದಿಪಡಿಸಲಾಯಿತು, ಅಲ್ಲಿ (1) ಇನಾಕ್ಯುಲೇಷನ್ ಬಿಂದುವಿನ ಬಳಿ ಯಾವುದೇ ಗೋಚರ ಸೋಂಕು ಇಲ್ಲ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು (2–9) ನೋಡ್‌ಗಳು/ಇಂಟರ್ನೋಡ್‌ಗಳ ಉದ್ದಕ್ಕೂ ಗಾಯದ ಗಾತ್ರ ಮತ್ತು ಪ್ರಗತಿಯಲ್ಲಿ ಕ್ರಮೇಣ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ S2). ನಂತರ ಸೂತ್ರ 2 ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಬಿಳಿ ಅಚ್ಚು ಸೋಂಕಿನ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು ಶೇಕಡಾವಾರು ಪ್ರಮಾಣಕ್ಕೆ ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾಯಿತು:
ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ರೋಗ ಪ್ರಗತಿ ರೇಖೆಯ (AUDPC) ಅಡಿಯಲ್ಲಿರುವ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಸೂತ್ರವನ್ನು (ಶೇನರ್ ಮತ್ತು ಫಿನ್ನಿ, 1977) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗಿದೆ, ಇದನ್ನು ಇತ್ತೀಚೆಗೆ ಸಾಮಾನ್ಯ ಬೀನ್‌ನ ಬಿಳಿ ಕೊಳೆತಕ್ಕೆ (ಚೌಹಾನ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2020) ಸಮೀಕರಣ 3 ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಅಳವಡಿಸಲಾಗಿದೆ:
ಇಲ್ಲಿ Yi = ti ಸಮಯದಲ್ಲಿ ರೋಗದ ತೀವ್ರತೆ, Yi+1 = ಮುಂದಿನ ಬಾರಿ ti+1 ನಲ್ಲಿ ರೋಗದ ತೀವ್ರತೆ, ti = ಮೊದಲ ಅಳತೆಯ ಸಮಯ (ದಿನಗಳಲ್ಲಿ), ti+1 = ಮುಂದಿನ ಅಳತೆಯ ಸಮಯ (ದಿನಗಳಲ್ಲಿ), n = ಒಟ್ಟು ಸಮಯ ಬಿಂದುಗಳು ಅಥವಾ ವೀಕ್ಷಣಾ ಬಿಂದುಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ. ಎಲ್ಲಾ ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳಲ್ಲಿ ಸಸ್ಯದ ಎತ್ತರ (ಸೆಂ.ಮೀ), ಪ್ರತಿ ಸಸ್ಯಕ್ಕೆ ಶಾಖೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಸಸ್ಯಕ್ಕೆ ಎಲೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ ಸೇರಿದಂತೆ ಬೀನ್ ಸಸ್ಯ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ನಿಯತಾಂಕಗಳನ್ನು ವಾರಕ್ಕೊಮ್ಮೆ 21 ದಿನಗಳವರೆಗೆ ದಾಖಲಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಪ್ರತಿ ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಯಲ್ಲಿ, ಎಲೆ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು (ಮೇಲಿನಿಂದ ಎರಡನೇ ಮತ್ತು ಮೂರನೇ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಅಭಿವೃದ್ಧಿ ಹೊಂದಿದ ಎಲೆಗಳು) ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ನಂತರ 45 ನೇ ದಿನದಂದು (ಕೊನೆಯ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ 15 ದಿನಗಳ ನಂತರ) ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿ ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಯು ಐದು ಮಡಕೆಗಳನ್ನು (ಪ್ರತಿ ಮಡಕೆಗೆ ಎರಡು ಸಸ್ಯಗಳು) ಒಳಗೊಂಡಿತ್ತು. ಸುಮಾರು 500 ಮಿಗ್ರಾಂ ಪುಡಿಮಾಡಿದ ಅಂಗಾಂಶವನ್ನು ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ 4 °C ನಲ್ಲಿ 80% ಅಸಿಟೋನ್ ಬಳಸಿ ದ್ಯುತಿಸಂಶ್ಲೇಷಕ ವರ್ಣದ್ರವ್ಯಗಳನ್ನು (ಕ್ಲೋರೋಫಿಲ್ ಎ, ಕ್ಲೋರೊಫಿಲ್ ಬಿ ಮತ್ತು ಕ್ಯಾರೊಟಿನಾಯ್ಡ್‌ಗಳು) ಹೊರತೆಗೆಯಲು ಬಳಸಲಾಯಿತು. 24 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ, ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕ್ಲೋರೊಫಿಲ್ ಎ, ಕ್ಲೋರೊಫಿಲ್ ಬಿ ಮತ್ತು ಕ್ಯಾರೊಟಿನಾಯ್ಡ್ ವಿಷಯಗಳ ನಿರ್ಣಯಕ್ಕಾಗಿ ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು, ಇದು UV-160A ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೀಟರ್ (ಶಿಮಾಡ್ಜು ಕಾರ್ಪೊರೇಷನ್, ಜಪಾನ್) ಬಳಸಿ ವರ್ಣಮಾಪನದ ಮೂಲಕ ಮೂರು ವಿಭಿನ್ನ ತರಂಗಾಂತರಗಳಲ್ಲಿ (A470, A646 ಮತ್ತು A663 nm) ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯುವ ಮೂಲಕ ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಲಿಚ್ಟೆಂಥಲರ್ (1987) ವಿವರಿಸಿದ ಕೆಳಗಿನ ಸೂತ್ರಗಳು 4–6 ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ದ್ಯುತಿಸಂಶ್ಲೇಷಕ ವರ್ಣದ್ರವ್ಯಗಳ ವಿಷಯವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಯಿತು.
ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ 72 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ (hpt), ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಪೆರಾಕ್ಸೈಡ್ (H2O2) ಮತ್ತು ಸೂಪರ್ಆಕ್ಸೈಡ್ ಅಯಾನ್ (O2•−) ನ ಇನ್ ಸಿತು ಹಿಸ್ಟೋಕೆಮಿಕಲ್ ಸ್ಥಳೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ ಪ್ರತಿ ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಯಿಂದ ಎಲೆಗಳನ್ನು (ಮೇಲಿನಿಂದ ಎರಡನೇ ಮತ್ತು ಮೂರನೇ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಅಭಿವೃದ್ಧಿ ಹೊಂದಿದ ಎಲೆಗಳು) ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿ ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಯು ಐದು ಮಡಿಕೆಗಳನ್ನು (ಪ್ರತಿ ಮಡಕೆಗೆ ಎರಡು ಸಸ್ಯಗಳು) ಒಳಗೊಂಡಿತ್ತು. ವಿಧಾನದ ನಿಖರತೆ, ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹತೆ ಮತ್ತು ಪುನರುತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಪ್ರತಿ ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಯನ್ನು ನಕಲಿನಲ್ಲಿ (ಎರಡು ತಾಂತ್ರಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳು) ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. H2O2 ಮತ್ತು O2•− ಅನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ 0.1% 3,3′-ಡೈಅಮಿನೋಬೆನ್ಜಿಡಿನ್ (DAB; ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್, ಡಾರ್ಮ್‌ಸ್ಟಾಡ್ಟ್, ಜರ್ಮನಿ) ಅಥವಾ ನೈಟ್ರೋಬ್ಲೂ ಟೆಟ್ರಾಜೋಲಿಯಮ್ (NBT; ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್, ಡಾರ್ಮ್‌ಸ್ಟಾಡ್ಟ್, ಜರ್ಮನಿ) ಬಳಸಿ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು, ರೊಮೆರೊ-ಪ್ಯುರ್ಟಾಸ್ ಮತ್ತು ಇತರರು (2004) ಮತ್ತು ಆಡಮ್ ಮತ್ತು ಇತರರು (1989) ವಿವರಿಸಿದ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಸಣ್ಣ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳೊಂದಿಗೆ ಅನುಸರಿಸಿ. H2O2 ನ ಹಿಸ್ಟೋಕೆಮಿಕಲ್ ಸ್ಥಳೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ, ಚಿಗುರೆಲೆಗಳನ್ನು 10 mM ಟ್ರಿಸ್ ಬಫರ್ (pH 7.8) ನಲ್ಲಿ 0.1% DAB ಯೊಂದಿಗೆ ನಿರ್ವಾತ ಒಳಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 60 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಬೆಳಕಿನಲ್ಲಿ ಇಡಲಾಯಿತು. ಚಿಗುರೆಲೆಗಳನ್ನು 4:1 (v/v) ಎಥೆನಾಲ್:ಕ್ಲೋರೋಫಾರ್ಮ್ (ಅಲ್-ಗೊಮ್ಹೋರಿಯಾ ಫಾರ್ಮಾಸ್ಯುಟಿಕಲ್ಸ್ ಮತ್ತು ಮೆಡಿಕಲ್ ಸಪ್ಲೈಸ್, ಕೈರೋ, ಈಜಿಪ್ಟ್) ನಲ್ಲಿ 0.15% (v/v) TCA ಯಲ್ಲಿ ಬ್ಲೀಚ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಅವು ಕಪ್ಪಾಗುವವರೆಗೆ ಬೆಳಕಿಗೆ ಒಡ್ಡಲಾಯಿತು. ಅದೇ ರೀತಿ, ಕವಾಟಗಳನ್ನು 0.1 w/v % HBT ಯೊಂದಿಗೆ 10 mM ಪೊಟ್ಯಾಸಿಯಮ್ ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬಫರ್ (pH 7.8) ನೊಂದಿಗೆ ಇನ್ಸಿಟು O2•− ನ ಹಿಸ್ಟೋಕೆಮಿಕಲ್ ಸ್ಥಳೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ ನಿರ್ವಾತ ಒಳಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ಚಿಗುರೆಲೆಗಳನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಬೆಳಕಿನಲ್ಲಿ ಇಡಲಾಯಿತು, ನಂತರ ಮೇಲಿನಂತೆ ಬಿಳುಪುಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಕಡು ನೀಲಿ/ನೇರಳೆ ಕಲೆಗಳು ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳುವವರೆಗೆ ಬೆಳಗಿಸಲಾಯಿತು. ಇಮೇಜ್ ಪ್ರೊಸೆಸಿಂಗ್ ಪ್ಯಾಕೇಜ್ ImageJ (http://fiji.sc; ಪ್ರವೇಶಿಸಿದ್ದು 7 ಮಾರ್ಚ್ 2024) ನ ಫಿಜಿ ಆವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಕಂದು (H2O2 ಸೂಚಕವಾಗಿ) ಅಥವಾ ನೀಲಿ-ನೇರಳೆ (O2•− ಸೂಚಕವಾಗಿ) ಬಣ್ಣದ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಣಯಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಮಾಲೋಂಡಿಯಾಲ್ಡಿಹೈಡ್ (MDA; ಲಿಪಿಡ್ ಪೆರಾಕ್ಸಿಡೀಕರಣದ ಮಾರ್ಕರ್ ಆಗಿ) ಅನ್ನು ಡು ಮತ್ತು ಬ್ರಾಮ್ಲೇಜ್ (1992) ವಿಧಾನದ ಪ್ರಕಾರ ಸ್ವಲ್ಪ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳೊಂದಿಗೆ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿ ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಯಿಂದ (ಮೇಲಿನಿಂದ ಎರಡನೇ ಮತ್ತು ಮೂರನೇ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಅಭಿವೃದ್ಧಿ ಹೊಂದಿದ ಎಲೆಗಳು) ಎಲೆಗಳನ್ನು 72 ಗಂಟೆಗಳ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ನಂತರ (hpt) ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿ ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಯಲ್ಲಿ ಐದು ಮಡಕೆಗಳು (ಪ್ರತಿ ಮಡಕೆಗೆ ಎರಡು ಸಸ್ಯಗಳು) ಸೇರಿವೆ. ವಿಧಾನದ ನಿಖರತೆ, ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹತೆ ಮತ್ತು ಪುನರುತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಪ್ರತಿ ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಯನ್ನು ನಕಲಿನಲ್ಲಿ (ಎರಡು ತಾಂತ್ರಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳು) ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, 0.01% ಬ್ಯುಟಿಲೇಟೆಡ್ ಹೈಡ್ರಾಕ್ಸಿಟೋಲುಯೀನ್ (BHT; ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್, ಸೇಂಟ್ ಲೂಯಿಸ್, MO, USA) ಹೊಂದಿರುವ 20% ಟ್ರೈಕ್ಲೋರೋಅಸೆಟಿಕ್ ಆಮ್ಲದೊಂದಿಗೆ MDA ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಗಾಗಿ 0.5 ಗ್ರಾಂ ನೆಲದ ಎಲೆ ಅಂಗಾಂಶವನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್‌ನಲ್ಲಿರುವ MDA ಅಂಶವನ್ನು UV-160A ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೀಟರ್ (ಶಿಮಾಡ್ಜು ಕಾರ್ಪೊರೇಷನ್, ಜಪಾನ್) ಬಳಸಿ 532 ಮತ್ತು 600 nm ನಲ್ಲಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯುವ ಮೂಲಕ ವರ್ಣಮಾಪನದ ಮೂಲಕ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ nmol g−1 FW ಎಂದು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಯಿತು.
ಕಿಣ್ವಕವಲ್ಲದ ಮತ್ತು ಕಿಣ್ವಕವಲ್ಲದ ಉತ್ಕರ್ಷಣ ನಿರೋಧಕಗಳ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನಕ್ಕಾಗಿ, ಪ್ರತಿ ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಯಿಂದ 72 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರದ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯಲ್ಲಿ (hpt) ಎಲೆಗಳನ್ನು (ಮೇಲಿನಿಂದ ಎರಡನೇ ಮತ್ತು ಮೂರನೇ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಅಭಿವೃದ್ಧಿ ಹೊಂದಿದ ಎಲೆಗಳು) ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿ ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಯು ಐದು ಮಡಕೆಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿತ್ತು (ಪ್ರತಿ ಮಡಕೆಗೆ ಎರಡು ಸಸ್ಯಗಳು). ಪ್ರತಿ ಜೈವಿಕ ಮಾದರಿಯನ್ನು ನಕಲಿನಲ್ಲಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ (ಎರಡು ತಾಂತ್ರಿಕ ಮಾದರಿಗಳು). ಎರಡು ಎಲೆಗಳನ್ನು ದ್ರವ ಸಾರಜನಕದಿಂದ ಪುಡಿಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕಿಣ್ವಕ ಮತ್ತು ಕಿಣ್ವಕವಲ್ಲದ ಉತ್ಕರ್ಷಣ ನಿರೋಧಕಗಳು, ಒಟ್ಟು ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳು, ಪ್ರೋಲಿನ್ ಅಂಶ, ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮತ್ತು ಆಕ್ಸಲೇಟ್ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣದ ನಿರ್ಣಯಕ್ಕಾಗಿ ನೇರವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಕಹ್ಕೋನೆನ್ ಮತ್ತು ಇತರರು (1999) ವಿವರಿಸಿದ ವಿಧಾನದ ಸ್ವಲ್ಪ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳೊಂದಿಗೆ ಫೋಲಿನ್-ಸಿಯೊಕಾಲ್ಟಿಯು ಕಾರಕವನ್ನು (ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್, ಸೇಂಟ್ ಲೂಯಿಸ್, MO, USA) ಬಳಸಿ ಒಟ್ಟು ಕರಗುವ ಫೀನಾಲಿಕ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, ಸರಿಸುಮಾರು 0.1 ಗ್ರಾಂ ಏಕರೂಪದ ಎಲೆ ಅಂಗಾಂಶವನ್ನು 20 ಮಿಲಿ 80% ಮೆಥನಾಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ನಂತರ ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು. 0.1 ಮಿಲಿ ಮಾದರಿ ಸಾರವನ್ನು 0.5 ಮಿಲಿ ಫೋಲಿನ್-ಸಿಯೊಕಾಲ್ಟಿಯು ಕಾರಕದೊಂದಿಗೆ (10%) ಬೆರೆಸಲಾಯಿತು, 30 ಸೆಕೆಂಡುಗಳ ಕಾಲ ಅಲ್ಲಾಡಿಸಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ ಬಿಡಲಾಯಿತು. ನಂತರ 0.5 ಮಿಲಿ 20% ಸೋಡಿಯಂ ಕಾರ್ಬೋನೇಟ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು (Na2CO3; ಅಲ್-ಗೊಮ್ಹೋರಿಯಾ ಫಾರ್ಮಾಸ್ಯುಟಿಕಲ್ಸ್ ಮತ್ತು ಮೆಡಿಕಲ್ ಸಪ್ಲೈಸ್ ಕಂಪನಿ, ಕೈರೋ, ಈಜಿಪ್ಟ್) ಪ್ರತಿ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು, ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. ಕಾವುಕೊಟ್ಟ ನಂತರ, UV-160A ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೀಟರ್ (ಶಿಮಾಡ್ಜು ಕಾರ್ಪೊರೇಷನ್, ಜಪಾನ್) ಬಳಸಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾ ಮಿಶ್ರಣದ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು 765 nm ನಲ್ಲಿ ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. ಮಾದರಿ ಸಾರಗಳಲ್ಲಿನ ಒಟ್ಟು ಕರಗುವ ಫೀನಾಲ್‌ಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಗ್ಯಾಲಿಕ್ ಆಮ್ಲ ಮಾಪನಾಂಕ ನಿರ್ಣಯ ಕರ್ವ್ (ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, ಹ್ಯಾಂಪ್ಟನ್, NH, USA) ಬಳಸಿ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ತಾಜಾ ತೂಕದ ಪ್ರತಿ ಗ್ರಾಂಗೆ ಗ್ಯಾಲಿಕ್ ಆಮ್ಲಕ್ಕೆ ಸಮಾನವಾದ ಮಿಲಿಗ್ರಾಂಗಳಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಯಿತು (mg GAE g-1 ತಾಜಾ ತೂಕ).
ಒಟ್ಟು ಕರಗುವ ಫ್ಲೇವನಾಯ್ಡ್ ಅಂಶವನ್ನು ಡಿಜೆರಿಡೇನ್ ಮತ್ತು ಇತರರು (2006) ವಿಧಾನದ ಪ್ರಕಾರ ಸ್ವಲ್ಪ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳೊಂದಿಗೆ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, ಮೇಲಿನ ಮೆಥನಾಲ್ ಸಾರದ 0.3 ಮಿಲಿಯನ್ನು 0.3 ಮಿಲಿ 5% ಅಲ್ಯೂಮಿನಿಯಂ ಕ್ಲೋರೈಡ್ ದ್ರಾವಣದೊಂದಿಗೆ (AlCl3; ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, ಹ್ಯಾಂಪ್ಟನ್, NH, USA) ಬೆರೆಸಿ, ತೀವ್ರವಾಗಿ ಬೆರೆಸಿ ನಂತರ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು, ನಂತರ 0.3 ಮಿಲಿ 10% ಪೊಟ್ಯಾಸಿಯಮ್ ಅಸಿಟೇಟ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು (ಅಲ್-ಗೊಮ್ಹೋರಿಯಾ ಫಾರ್ಮಾಸ್ಯುಟಿಕಲ್ಸ್ ಮತ್ತು ಮೆಡಿಕಲ್ ಸಪ್ಲೈಸ್, ಕೈರೋ, ಈಜಿಪ್ಟ್) ಸೇರಿಸಿ, ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಬೆರೆಸಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. ಕಾವುಕೊಟ್ಟ ನಂತರ, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಮಿಶ್ರಣದ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು UV-160A ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೀಟರ್ (ಶಿಮಾಡ್ಜು ಕಾರ್ಪೊರೇಷನ್, ಜಪಾನ್) ಬಳಸಿ 430 nm ನಲ್ಲಿ ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. ಮಾದರಿ ಸಾರಗಳಲ್ಲಿ ಒಟ್ಟು ಕರಗುವ ಫ್ಲೇವನಾಯ್ಡ್‌ಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ರುಟಿನ್ ಮಾಪನಾಂಕ ನಿರ್ಣಯ ಕರ್ವ್ (TCI ಅಮೇರಿಕಾ, ಪೋರ್ಟ್‌ಲ್ಯಾಂಡ್, OR, USA) ಬಳಸಿ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ತಾಜಾ ತೂಕದ ಗ್ರಾಂಗೆ ಮಿಲಿಗ್ರಾಂ ರುಟಿನ್ ಸಮಾನವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಯಿತು (mg RE g-1 ತಾಜಾ ತೂಕ).
ಯೊಕೊಯಾಮಾ ಮತ್ತು ಹಿರಾಮಟ್ಸು (2003) ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸಿದ ಮತ್ತು ಸನ್ ಮತ್ತು ಇತರರು (2006) ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ವಿಧಾನವನ್ನು ಆಧರಿಸಿ, ಹುರುಳಿ ಎಲೆಗಳ ಒಟ್ಟು ಉಚಿತ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲದ ಅಂಶವನ್ನು ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ನಿನ್‌ಹೈಡ್ರಿನ್ ಕಾರಕವನ್ನು (ಥರ್ಮೋ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್ ಕೆಮಿಕಲ್ಸ್, ವಾಲ್ಥಮ್, MA, USA) ಬಳಸಿ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, pH 5.4 ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ 0.1 ಗ್ರಾಂ ನೆಲದ ಅಂಗಾಂಶವನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು 200 μL ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು 200 μL ನಿನ್‌ಹೈಡ್ರಿನ್ (2%) ಮತ್ತು 200 μL ಪಿರಿಡಿನ್ (10%; ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್ ಕೆಮಿಕಲ್, ನ್ಯೂ ಬ್ರನ್ಸ್‌ವಿಕ್, NJ, USA) ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸಲಾಯಿತು, 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕುದಿಯುವ ನೀರಿನ ಸ್ನಾನದಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು, ನಂತರ ತಂಪಾಗಿಸಿ UV-160A ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೀಟರ್ (ಶಿಮಾಡ್ಜು ಕಾರ್ಪೊರೇಷನ್, ಜಪಾನ್) ಬಳಸಿ 580 nm ನಲ್ಲಿ ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. ಮತ್ತೊಂದೆಡೆ, ಪ್ರೋಲಿನ್ ಅನ್ನು ಬೇಟ್ಸ್ ವಿಧಾನದಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು (ಬೇಟ್ಸ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 1973). ಪ್ರೋಲಿನ್ ಅನ್ನು 3% ಸಲ್ಫೋಸಲಿಸಿಲಿಕ್ ಆಮ್ಲದೊಂದಿಗೆ (ಥರ್ಮೋ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್ ಕೆಮಿಕಲ್ಸ್, ವಾಲ್ಥಮ್, MA, USA) ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕೇಂದ್ರೀಕರಣದ ನಂತರ, 0.5 ಮಿಲಿ ಸೂಪರ್ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು 1 ಮಿಲಿ ಗ್ಲೇಶಿಯಲ್ ಅಸಿಟಿಕ್ ಆಮ್ಲದೊಂದಿಗೆ (ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, ಹ್ಯಾಂಪ್ಟನ್, NH, USA) ಮತ್ತು ನಿನ್‌ಹೈಡ್ರಿನ್ ಕಾರಕದೊಂದಿಗೆ ಬೆರೆಸಿ, 90°C ನಲ್ಲಿ 45 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು, ತಂಪಾಗಿಸಿ ಮತ್ತು ಮೇಲಿನಂತೆಯೇ ಅದೇ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೀಟರ್ ಬಳಸಿ 520 nm ನಲ್ಲಿ ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. ಎಲೆಯ ಸಾರಗಳಲ್ಲಿನ ಒಟ್ಟು ಉಚಿತ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರೋಲಿನ್ ಅನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ ಗ್ಲೈಸಿನ್ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಲಿನ್ ಮಾಪನಾಂಕ ನಿರ್ಣಯ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳನ್ನು (ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್, ಸೇಂಟ್ ಲೂಯಿಸ್, MO, USA) ಬಳಸಿ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು mg/g ತಾಜಾ ತೂಕವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಯಿತು.
ಉತ್ಕರ್ಷಣ ನಿರೋಧಕ ಕಿಣ್ವಗಳ ಕಿಣ್ವಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು, 1 mM EDTA-Na2 (ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್, ಸೇಂಟ್ ಲೂಯಿಸ್, MO, USA) ಮತ್ತು 7.5% ಪಾಲಿವಿನೈಲ್‌ಪಿರೋಲಿಡೋನ್ (PVP; ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್, ಸೇಂಟ್ ಲೂಯಿಸ್, MO, USA) ಹೊಂದಿರುವ 50 mM ಟ್ರಿಸ್ ಬಫರ್ (pH 7.8) ನ 3 ಮಿಲಿಯೊಂದಿಗೆ ಸರಿಸುಮಾರು 500 ಮಿಗ್ರಾಂ ಏಕರೂಪದ ಅಂಗಾಂಶವನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಯಿತು, ಇದನ್ನು 10,000 × g ನಲ್ಲಿ 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಶೈತ್ಯೀಕರಣದ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ (4 °C) ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ (ಕಚ್ಚಾ ಕಿಣ್ವ ಸಾರ) ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು (ಎಲ್-ನಗರ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2023; ಓಸ್ಮಾನ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2023). ನಂತರ ಕೆಟಲೇಸ್ (CAT) ಅನ್ನು 0.1 M ಸೋಡಿಯಂ ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬಫರ್‌ನ 2 ಮಿಲಿ (pH 6.5; ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್, ಸೇಂಟ್ ಲೂಯಿಸ್, MO, USA) ಮತ್ತು 100 μl 269 mM H2O2 ದ್ರಾವಣದೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸಿ, ಅದರ ಕಿಣ್ವಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಸ್ವಲ್ಪ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳೊಂದಿಗೆ Aebi (1984) ವಿಧಾನದ ಪ್ರಕಾರ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). ಹರಾಚ್ ಮತ್ತು ಇತರರು (2009) ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಗುವಾಯಾಕೋಲ್-ಅವಲಂಬಿತ ಪೆರಾಕ್ಸಿಡೇಸ್ (POX) ಕಿಣ್ವಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು. (2008) ಸಣ್ಣ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳೊಂದಿಗೆ (ಎಲ್-ನಗರ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2023; ಓಸ್ಮಾನ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2023) ಮತ್ತು ಪಾಲಿಫಿನಾಲ್ ಆಕ್ಸಿಡೇಸ್ (PPO) ನ ಕಿಣ್ವಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು 2.2 ಮಿಲಿ 100 mM ಸೋಡಿಯಂ ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬಫರ್ (pH 6.0), 100 μl ಗ್ವಾಯಾಕೋಲ್ (TCI ರಾಸಾಯನಿಕಗಳು, ಪೋರ್ಟ್ಲ್ಯಾಂಡ್, OR, USA) ಮತ್ತು 100 μl 12 mM H2O2 ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸಿದ ನಂತರ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು. ಈ ವಿಧಾನವನ್ನು (ಎಲ್-ನಗರ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2023; ಓಸ್ಮಾನ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2023) ನಿಂದ ಸ್ವಲ್ಪ ಮಾರ್ಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ. 0.1 M ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬಫರ್ (pH 6.0) ನಲ್ಲಿ ಹೊಸದಾಗಿ ತಯಾರಿಸಿದ 3 ಮಿಲಿ ಕ್ಯಾಟೆಕಾಲ್ ದ್ರಾವಣ (ಥರ್ಮೋ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್ ಕೆಮಿಕಲ್ಸ್, ವಾಲ್ಥಮ್, MA, USA) (0.01 M) ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸಿದ ನಂತರ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. 240 nm (A240) ನಲ್ಲಿ H2O2 ನ ವಿಭಜನೆಯನ್ನು ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ CAT ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಯಿತು, 436 nm (A436) ನಲ್ಲಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ POX ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು UV-160A ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೀಟರ್ (ಶಿಮಾಡ್ಜು, ಜಪಾನ್) ಬಳಸಿ ಪ್ರತಿ 30 ಸೆಕೆಂಡುಗಳಿಗೊಮ್ಮೆ 495 nm (A495) ನಲ್ಲಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯ ಏರಿಳಿತಗಳನ್ನು ದಾಖಲಿಸುವ ಮೂಲಕ PPO ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಯಿತು.
ಕೊನೆಯ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ 72 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ ಬೀನ್ ಎಲೆಗಳಲ್ಲಿ (ಮೇಲಿನಿಂದ ಎರಡನೇ ಮತ್ತು ಮೂರನೇ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಅಭಿವೃದ್ಧಿ ಹೊಂದಿದ ಎಲೆಗಳು) ಪೆರಾಕ್ಸಿಸೋಮಲ್ ಕ್ಯಾಟಲೇಸ್ (PvCAT1; ಜೆನ್‌ಬ್ಯಾಂಕ್ ಪ್ರವೇಶ ಸಂಖ್ಯೆ. KF033307.1), ಸೂಪರ್‌ಆಕ್ಸೈಡ್ ಡಿಸ್ಮುಟೇಸ್ (PvSOD; ಜೆನ್‌ಬ್ಯಾಂಕ್ ಪ್ರವೇಶ ಸಂಖ್ಯೆ. XM_068639556.1), ಮತ್ತು ಗ್ಲುಟಾಥಿಯೋನ್ ರಿಡಕ್ಟೇಸ್ (PvGR; ಜೆನ್‌ಬ್ಯಾಂಕ್ ಪ್ರವೇಶ ಸಂಖ್ಯೆ. KY195009.1) ಸೇರಿದಂತೆ ಮೂರು ಉತ್ಕರ್ಷಣ ನಿರೋಧಕ-ಸಂಬಂಧಿತ ಜೀನ್‌ಗಳ ಪ್ರತಿಲಿಪಿ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ನೈಜ-ಸಮಯದ RT-PCR ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, ತಯಾರಕರ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಪ್ರಕಾರ ಸಿಂಪ್ಲಿ ಪಿ ಟೋಟಲ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಎಕ್ಸ್‌ಟ್ರಾಕ್ಷನ್ ಕಿಟ್ (ಕ್ಯಾಟ್. ಸಂಖ್ಯೆ. BSC52S1; ಬಯೋಫ್ಲಕ್ಸ್, ಬಯೋರಿ ಟೆಕ್ನಾಲಜಿ, ಚೀನಾ) ಬಳಸಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಅನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ, ತಯಾರಕರ ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ TOP ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್™ cDNA ಸಿಂಥೆಸಿಸ್ ಕಿಟ್ ಬಳಸಿ ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಅನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. ಮೇಲಿನ ಮೂರು ಜೀನ್‌ಗಳ ಪ್ರೈಮರ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ S3 ನಲ್ಲಿ ಪಟ್ಟಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. PvActin-3 (GenBank accession number: XM_068616709.1) ಅನ್ನು ಹೌಸ್‌ಕೀಪಿಂಗ್ ಜೀನ್‌ ಆಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸಾಪೇಕ್ಷ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು 2-ΔΔCT ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಯಿತು (ಲಿವಾಕ್ ಮತ್ತು ಸ್ಕ್ಮಿಟ್‌ಜೆನ್, 2001). ಜೈವಿಕ ಒತ್ತಡದ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಆಕ್ಟಿನ್ ಸ್ಥಿರತೆ (ಸಾಮಾನ್ಯ ದ್ವಿದಳ ಧಾನ್ಯಗಳು ಮತ್ತು ಆಂಥ್ರಾಕ್ನೋಸ್ ಶಿಲೀಂಧ್ರ ಕೊಲೆಟೋಟ್ರಿಚಮ್ ಲಿಂಡೆಮುಥಿಯಾನಮ್ ನಡುವಿನ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯಾಗದ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆ) ಮತ್ತು ಅಜೀವಕ ಒತ್ತಡ (ಬರ, ಲವಣಾಂಶ, ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನ) ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾಯಿತು (ಬೋರ್ಗೆಸ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2012).
ನಾವು ಆರಂಭದಲ್ಲಿ S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್‌ನಲ್ಲಿ ಆಕ್ಸಲೋಅಸೆಟೇಟ್ ಅಸಿಟೈಲ್‌ಹೈಡ್ರೋಲೇಸ್ (OAH) ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಸಿಲಿಕೋ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್-ಪ್ರೋಟೀನ್ BLAST ಉಪಕರಣವನ್ನು (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಜೀನೋಮ್-ವೈಡ್ ಅನ್ನು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, ನಾವು ಆಸ್ಪರ್‌ಜಿಲ್ಲಸ್ ಫಿಜಿಯೆನ್ಸಿಸ್ CBS 313.89 (AfOAH; ಟ್ಯಾಕ್ಸೈಡ್: 1191702; ಜೆನ್‌ಬ್ಯಾಂಕ್ ಪ್ರವೇಶ ಸಂಖ್ಯೆ XP_040799428.1; 342 ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳು) ಮತ್ತು ಪೆನಿಸಿಲಿಯಮ್ ಲಗೇನಾ (PlOAH; ಟ್ಯಾಕ್ಸೈಡ್: 94218; ಜೆನ್‌ಬ್ಯಾಂಕ್ ಪ್ರವೇಶ ಸಂಖ್ಯೆ XP_056833920.1; 316 ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳು) ನಿಂದ OAH ಅನ್ನು S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್‌ನಲ್ಲಿ (ಟ್ಯಾಕ್ಸೈಡ್: 5180) ಹೋಮೋಲೋಗಸ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ನಕ್ಷೆ ಮಾಡಲು ಪ್ರಶ್ನೆ ಅನುಕ್ರಮಗಳಾಗಿ ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ. ನ್ಯಾಷನಲ್ ಸೆಂಟರ್ ಫಾರ್ ಬಯೋಟೆಕ್ನಾಲಜಿ ಇನ್ಫಾರ್ಮೇಶನ್ (NCBI) ವೆಬ್‌ಸೈಟ್ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ ನಲ್ಲಿ ಜೆನ್‌ಬ್ಯಾಂಕ್‌ನಲ್ಲಿ ಇತ್ತೀಚೆಗೆ ಲಭ್ಯವಿರುವ ಎಸ್. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಜೀನೋಮ್ ಡೇಟಾದ ವಿರುದ್ಧ BLASTp ಅನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ (SsOAH) ನಿಂದ ಊಹಿಸಲಾದ OAH ಜೀನ್ ಮತ್ತು A. fijiensis CBS 313.89 ನಿಂದ AfOAH ನ ವಿಕಸನೀಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು ಫೈಲೋಜೆನೆಟಿಕ್ ಮರ ಮತ್ತು P. lagena ನಿಂದ PlOAH ಅನ್ನು MEGA11 (Tamura et al., 2021) ಮತ್ತು JTT ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್-ಆಧಾರಿತ ಮಾದರಿ (Jones et al., 1992) ನಲ್ಲಿ ಗರಿಷ್ಠ ಸಂಭವನೀಯತೆ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಊಹಿಸಲಾಗಿದೆ. ಫೈಲೋಜೆನೆಟಿಕ್ ಮರವನ್ನು S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ನಿಂದ ಊಹಿಸಲಾದ ಎಲ್ಲಾ OAH ಜೀನ್‌ಗಳ (SsOAH) ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳ ಬಹು ಜೋಡಣೆ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು ನಿರ್ಬಂಧ-ಆಧಾರಿತ ಜೋಡಣೆ ಸಾಧನ (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos ಮತ್ತು Agarwala, 2007) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರಶ್ನೆ ಅನುಕ್ರಮದೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಗಿದೆ. ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್‌ನಿಂದ SsOAH ನ ಅತ್ಯುತ್ತಮ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರಶ್ನೆ ಅನುಕ್ರಮಗಳೊಂದಿಗೆ (AfOAH ಮತ್ತು PlOAH) (ಲಾರ್ಕಿನ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2007) ಜೋಡಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಜೋಡಣೆಯಲ್ಲಿ ಸಂರಕ್ಷಿತ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ESPript ಉಪಕರಣವನ್ನು (ಆವೃತ್ತಿ 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲಾಯಿತು.
ಇದಲ್ಲದೆ, S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ SsOAH ನ ಊಹಿಸಲಾದ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಪ್ರತಿನಿಧಿ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಸಂರಕ್ಷಿತ ತಾಣಗಳನ್ನು ಇಂಟರ್‌ಪ್ರೊ ಉಪಕರಣವನ್ನು (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ವಿಭಿನ್ನ ಕುಟುಂಬಗಳಾಗಿ ಸಂವಾದಾತ್ಮಕವಾಗಿ ವರ್ಗೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ (Blum et al., 2021). ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಊಹಿಸಲಾದ S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ SsOAH ನ ಮೂರು ಆಯಾಮದ (3D) ರಚನೆಯ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಹೋಮಾಲಜಿ/ಅನಾಲಜಿ ರೆಕಗ್ನಿಷನ್ ಎಂಜಿನ್ (ಫೈರ್2 ಸರ್ವರ್ ಆವೃತ್ತಿ 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (ಕೆಲ್ಲಿ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2015) ಬಳಸಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು SWISS-MODEL ಸರ್ವರ್ (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014) ಬಳಸಿ ಮೌಲ್ಯೀಕರಿಸಲಾಯಿತು. ಊಹಿಸಲಾದ ಮೂರು ಆಯಾಮದ ರಚನೆಗಳನ್ನು (PDB ಸ್ವರೂಪ) UCSF-ಚಿಮೆರಾ ಪ್ಯಾಕೇಜ್ (ಆವೃತ್ತಿ 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) ಬಳಸಿ ಸಂವಾದಾತ್ಮಕವಾಗಿ ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲಾಯಿತು (ಪೆಟರ್ಸನ್ ಮತ್ತು ಇತರರು, 2004).
ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿನಿಯಾ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೋರಮ್‌ನ ಮೈಸಿಲಿಯಾದಲ್ಲಿ ಆಕ್ಸಲೋಅಸೆಟೇಟ್ ಅಸಿಟೈಲ್‌ಹೈಡ್ರೋಲೇಸ್ (SsOAH; ಜೆನ್‌ಬ್ಯಾಂಕ್ ಪ್ರವೇಶ ಸಂಖ್ಯೆ: XM_001590428.1) ನ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಮಟ್ಟವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ PCR ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೋರಮ್ ಅನ್ನು PDB ಹೊಂದಿರುವ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್‌ಗೆ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದು ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 25 ± 2 °C ನಲ್ಲಿ 150 rpm ನಲ್ಲಿ 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಮತ್ತು ನಿರಂತರ ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ (24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ) ಕವಕಜಾಲದ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಲು ಅಲುಗಾಡುವ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟರ್‌ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಯಿತು (ಮಾದರಿ: I2400, ನ್ಯೂ ಬ್ರನ್ಸ್‌ವಿಕ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್ ಕಂಪನಿ, ಎಡಿಸನ್, NJ, USA). ನಂತರ, ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ಅಂತಿಮ IC50 ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ (ಕ್ರಮವಾಗಿ ಸರಿಸುಮಾರು 40 ಮತ್ತು 3.2 mg/L) L-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಮತ್ತು ಶಿಲೀಂಧ್ರನಾಶಕ ರೈಜೋಲೆಕ್ಸ್-T ಯೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಅದೇ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಮತ್ತೊಂದು 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕಲ್ಚರ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಷನ್ ನಂತರ, ಸಂಸ್ಕೃತಿಗಳನ್ನು 2500 rpm ನಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಸೂಪರ್ನೇಟಂಟ್ (ಶಿಲೀಂಧ್ರ ಕವಕಜಾಲ) ಅನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು. ಅದೇ ರೀತಿ, ಸೋಂಕಿತ ಅಂಗಾಂಶಗಳ ಮೇಲ್ಮೈಯಲ್ಲಿ ಬಿಳಿ ಅಚ್ಚು ಮತ್ತು ಹತ್ತಿಯ ಕವಕಜಾಲವನ್ನು ರೂಪಿಸಿದ ಸೋಂಕಿತ ಸಸ್ಯಗಳಿಂದ ಸೋಂಕಿನ ನಂತರ 0, 24, 48, 72, 96, ಮತ್ತು 120 ಗಂಟೆಗಳಲ್ಲಿ ಶಿಲೀಂಧ್ರ ಕವಕಜಾಲವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು. ಶಿಲೀಂಧ್ರ ಕವಕಜಾಲದಿಂದ RNA ಅನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ cDNA ಅನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. SsOAH ಗಾಗಿ ಪ್ರೈಮರ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ S3 ನಲ್ಲಿ ಪಟ್ಟಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. SsActin (ಜೆನ್‌ಬ್ಯಾಂಕ್ ಪ್ರವೇಶ ಸಂಖ್ಯೆ: XM_001589919.1) ಅನ್ನು ಹೌಸ್‌ಕೀಪಿಂಗ್ ಜೀನ್‌ ಆಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸಾಪೇಕ್ಷ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು 2-ΔΔCT ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಯಿತು (ಲಿವಾಕ್ ಮತ್ತು ಸ್ಕ್ಮಿಟ್‌ಜೆನ್, 2001).
ಕ್ಸು ಮತ್ತು ಜಾಂಗ್ (2000) ವಿಧಾನದ ಪ್ರಕಾರ ಆಲೂಗಡ್ಡೆ ಡೆಕ್ಸ್ಟ್ರೋಸ್ ಸಾರು (PDB) ಮತ್ತು ಶಿಲೀಂಧ್ರ ರೋಗಕಾರಕ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿನಿಯಾ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೋರಮ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಸಸ್ಯ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಆಕ್ಸಾಲಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು ಸ್ವಲ್ಪ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳೊಂದಿಗೆ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೋರಮ್ ಐಸೋಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು PDB ಹೊಂದಿರುವ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದು ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಅಲುಗಾಡುವ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟರ್‌ನಲ್ಲಿ (ಮಾದರಿ I2400, ನ್ಯೂ ಬ್ರನ್ಸ್‌ವಿಕ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್ ಕಂ., ಎಡಿಸನ್, NJ, USA) 150 rpm ನಲ್ಲಿ 25 ± 2 °C ನಲ್ಲಿ 3-5 ದಿನಗಳವರೆಗೆ ನಿರಂತರ ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ (24 ಗಂಟೆಗಳು) ಕಲ್ಚರ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಕಾವುಕೊಟ್ಟ ನಂತರ, ಶಿಲೀಂಧ್ರ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯನ್ನು ಮೊದಲು ವಾಟ್‌ಮ್ಯಾನ್ #1 ಫಿಲ್ಟರ್ ಪೇಪರ್ ಮೂಲಕ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಉಳಿದಿರುವ ಕವಕಜಾಲವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 2500 rpm ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಆಕ್ಸಲೇಟ್‌ನ ಮತ್ತಷ್ಟು ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ನಿರ್ಣಯಕ್ಕಾಗಿ ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ 4 °C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು. ಸಸ್ಯ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ತಯಾರಿಸಲು, ಸರಿಸುಮಾರು 0.1 ಗ್ರಾಂ ಸಸ್ಯ ಅಂಗಾಂಶ ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ಮೂರು ಬಾರಿ ಬಟ್ಟಿ ಇಳಿಸಿದ ನೀರಿನಿಂದ (ಪ್ರತಿ ಬಾರಿ 2 ಮಿಲಿ) ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು 2500 rpm ನಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು, ಸೂಪರ್ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು ವಾಟ್ಮ್ಯಾನ್ ನಂ. 1 ಫಿಲ್ಟರ್ ಪೇಪರ್ ಮೂಲಕ ಡ್ರೈ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು.
ಆಕ್ಸಲಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಗಾಜಿನ ಸ್ಟಾಪರ್ಡ್ ಟ್ಯೂಬ್‌ನಲ್ಲಿ ಈ ಕೆಳಗಿನ ಕ್ರಮದಲ್ಲಿ ತಯಾರಿಸಲಾಯಿತು: 0.2 ಮಿಲಿ ಮಾದರಿ (ಅಥವಾ PDB ಕಲ್ಚರ್ ಫಿಲ್ಟ್ರೇಟ್ ಅಥವಾ ಆಕ್ಸಲಿಕ್ ಆಮ್ಲ ಪ್ರಮಾಣಿತ ದ್ರಾವಣ), 0.11 ಮಿಲಿ ಬ್ರೋಮೋಫೆನಾಲ್ ನೀಲಿ (BPB, 1 mM; ಫಿಶರ್ ಕೆಮಿಕಲ್, ಪಿಟ್ಸ್‌ಬರ್ಗ್, PA, USA), 0.198 ಮಿಲಿ 1 M ಸಲ್ಫ್ಯೂರಿಕ್ ಆಮ್ಲ (H2SO4; ಅಲ್-ಗೊಮ್ಹೋರಿಯಾ ಫಾರ್ಮಾಸ್ಯುಟಿಕಲ್ಸ್ ಮತ್ತು ವೈದ್ಯಕೀಯ ಸರಬರಾಜು, ಕೈರೋ, ಈಜಿಪ್ಟ್) ಮತ್ತು 0.176 ಮಿಲಿ 100 mM ಪೊಟ್ಯಾಸಿಯಮ್ ಡೈಕ್ರೋಮೇಟ್ (K2Cr2O7; TCI ರಾಸಾಯನಿಕಗಳು, ಪೋರ್ಟ್‌ಲ್ಯಾಂಡ್, OR, USA), ಮತ್ತು ನಂತರ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಬಟ್ಟಿ ಇಳಿಸಿದ ನೀರಿನಿಂದ 4.8 ಮಿಲಿಗೆ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, ತೀವ್ರವಾಗಿ ಬೆರೆಸಿ ತಕ್ಷಣ 60 °C ನೀರಿನ ಸ್ನಾನದಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಯಿತು. 10 ನಿಮಿಷಗಳ ನಂತರ, 0.5 ಮಿಲಿ ಸೋಡಿಯಂ ಹೈಡ್ರಾಕ್ಸೈಡ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು (NaOH; 0.75 M) ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಿಲ್ಲಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾ ಮಿಶ್ರಣದ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು (A600) UV-160 ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೀಟರ್ (ಶಿಮಾಡ್ಜು ಕಾರ್ಪೊರೇಷನ್, ಜಪಾನ್) ಬಳಸಿ 600 nm ನಲ್ಲಿ ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. PDB ಮತ್ತು ಬಟ್ಟಿ ಇಳಿಸಿದ ನೀರನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ ಕಲ್ಚರ್ ಫಿಲ್ಟ್ರೇಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಸಸ್ಯ ಮಾದರಿಗಳ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣಕ್ಕೆ ನಿಯಂತ್ರಣಗಳಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತಿತ್ತು. ಕಲ್ಚರ್ ಫಿಲ್ಟ್ರೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿನ ಆಕ್ಸಲಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು PDB ಮಾಧ್ಯಮದ ಪ್ರತಿ ಮಿಲಿಲೀಟರ್‌ಗೆ (μg.mL−1) ಮೈಕ್ರೋಗ್ರಾಂಗಳಷ್ಟು ಆಕ್ಸಲಿಕ್ ಆಮ್ಲವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಎಲೆಯ ಸಾರಗಳಲ್ಲಿ, ತಾಜಾ ತೂಕದ ಪ್ರತಿ ಗ್ರಾಂಗೆ (μg.g−1 FW) ಮೈಕ್ರೋಗ್ರಾಂಗಳಷ್ಟು ಆಕ್ಸಲಿಕ್ ಆಮ್ಲವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಆಕ್ಸಲಿಕ್ ಆಮ್ಲ ಮಾಪನಾಂಕ ನಿರ್ಣಯ ಕರ್ವ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್ ಕೆಮಿಕಲ್ಸ್, ವಾಲ್ಥಮ್, MA, USA).
ಅಧ್ಯಯನದ ಉದ್ದಕ್ಕೂ, ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ವಿನ್ಯಾಸದಲ್ಲಿ (CRD) ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ, ಪ್ರತಿ ಚಿಕಿತ್ಸೆಗೆ ಆರು ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗೆ ಐದು ಮಡಕೆಗಳು (ಪ್ರತಿ ಮಡಕೆಗೆ ಎರಡು ಸಸ್ಯಗಳು) ಬೇರೆ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಹೇಳದ ಹೊರತು. ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳನ್ನು ನಕಲಿನಲ್ಲಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ (ಎರಡು ತಾಂತ್ರಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳು). ಒಂದೇ ಪ್ರಯೋಗದ ಪುನರುತ್ಪಾದನಾ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಲು ತಾಂತ್ರಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತಿತ್ತು ಆದರೆ ನಕಲಿ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ಅವುಗಳನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಲಿಲ್ಲ. ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (ANOVA) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಡೇಟಾವನ್ನು ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು, ನಂತರ ಟುಕಿ-ಕ್ರಾಮರ್ ಪ್ರಾಮಾಣಿಕವಾಗಿ ಮಹತ್ವದ ವ್ಯತ್ಯಾಸ (HSD) ಪರೀಕ್ಷೆ (p ≤ 0.05). ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗಾಗಿ, IC50 ಮತ್ತು IC99 ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಪ್ರಾಬಿಟ್ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 95% ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹ ಮಧ್ಯಂತರಗಳನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಯಿತು.
ಈಜಿಪ್ಟ್‌ನ ಎಲ್ ಘಾಬಿಯಾ ಗವರ್ನರೇಟ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ವಿವಿಧ ಸೋಯಾಬೀನ್ ಹೊಲಗಳಿಂದ ಒಟ್ಟು ನಾಲ್ಕು ಐಸೋಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ. PDA ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ, ಎಲ್ಲಾ ಐಸೋಲೇಟ್‌ಗಳು ಕೆನೆ ಬಿಳಿ ಮೈಸೀಲಿಯಮ್ ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಿದವು, ಅದು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಹತ್ತಿಯ ಬಿಳಿ ಬಣ್ಣಕ್ಕೆ ತಿರುಗಿತು (ಚಿತ್ರ 1A) ಮತ್ತು ನಂತರ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯಮ್ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಬೀಜ್ ಅಥವಾ ಕಂದು ಬಣ್ಣಕ್ಕೆ ತಿರುಗಿತು. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯಾ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ದಟ್ಟವಾದ, ಕಪ್ಪು, ಗೋಳಾಕಾರದ ಅಥವಾ ಅನಿಯಮಿತ ಆಕಾರದಲ್ಲಿರುತ್ತದೆ, 5.2 ರಿಂದ 7.7 ಮಿಮೀ ಉದ್ದ ಮತ್ತು 3.4 ರಿಂದ 5.3 ಮಿಮೀ ವ್ಯಾಸದಲ್ಲಿರುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 1B). 25 ± 2 °C (ಚಿತ್ರ 1A) ನಲ್ಲಿ 10-12 ದಿನಗಳ ಕಾವು ನಂತರ ನಾಲ್ಕು ಐಸೋಲೇಟ್‌ಗಳು ಸಂಸ್ಕೃತಿ ಮಾಧ್ಯಮದ ಅಂಚಿನಲ್ಲಿ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯಾದ ಅಂಚಿನ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದರೂ, ಪ್ರತಿ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗೆ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯಾದ ಸಂಖ್ಯೆಯು ಅವುಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಭಿನ್ನವಾಗಿತ್ತು (P < 0.001), ಐಸೋಲೇಟ್ 3 ಅತಿ ಹೆಚ್ಚು ಸಂಖ್ಯೆಯ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯಾವನ್ನು ಹೊಂದಿತ್ತು (ಪ್ರತಿ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗೆ 32.33 ± 1.53 ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯಾ; ಚಿತ್ರ 1C). ಅದೇ ರೀತಿ, ಐಸೊಲೇಟ್ #3 ಇತರ ಐಸೊಲೇಟ್‌ಗಳಿಗಿಂತ PDB ಯಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಆಕ್ಸಲಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಿತು (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; ಚಿತ್ರ 1D). ಐಸೊಲೇಟ್ #3 ಫೈಟೊಪಾಥೋಜೆನಿಕ್ ಶಿಲೀಂಧ್ರ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿನಿಯಾ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೋರಮ್‌ನ ವಿಶಿಷ್ಟ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ಮತ್ತು ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ. ಉದಾಹರಣೆಗೆ, PDA ಯಲ್ಲಿ, ಐಸೊಲೇಟ್ #3 ರ ವಸಾಹತುಗಳು ವೇಗವಾಗಿ ಬೆಳೆದವು, ಕೆನೆ ಬಿಳಿ (ಚಿತ್ರ 1A), ರಿವರ್ಸ್ ಬೀಜ್ ಅಥವಾ ತಿಳಿ ಸಾಲ್ಮನ್ ಹಳದಿ-ಕಂದು ಬಣ್ಣದ್ದಾಗಿದ್ದವು ಮತ್ತು 9 ಸೆಂ.ಮೀ ವ್ಯಾಸದ ತಟ್ಟೆಯ ಮೇಲ್ಮೈಯನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಆವರಿಸಲು 25 ± 2°C ನಲ್ಲಿ 6-7 ದಿನಗಳು ಬೇಕಾಯಿತು. ಮೇಲಿನ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ಮತ್ತು ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ, ಐಸೊಲೇಟ್ #3 ಅನ್ನು ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿನಿಯಾ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೋರಮ್ ಎಂದು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಚಿತ್ರ 1. ಸಾಮಾನ್ಯ ದ್ವಿದಳ ಧಾನ್ಯ ಬೆಳೆಗಳಿಂದ ಎಸ್. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಗಳ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳು ಮತ್ತು ರೋಗಕಾರಕತೆ. (ಎ) ಪಿಡಿಎ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ನಾಲ್ಕು ಎಸ್. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಗಳ ಮೈಸೀಲಿಯಲ್ ಬೆಳವಣಿಗೆ, (ಬಿ) ನಾಲ್ಕು ಎಸ್. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಗಳ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯಾ, (ಸಿ) ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯಾದ ಸಂಖ್ಯೆ (ಪ್ರತಿ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗೆ), (ಡಿ) ಪಿಡಿಬಿ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಆಕ್ಸಾಲಿಕ್ ಆಮ್ಲ ಸ್ರವಿಸುವಿಕೆ (μg.mL−1), ಮತ್ತು (ಇ) ಹಸಿರುಮನೆ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಒಳಗಾಗುವ ವಾಣಿಜ್ಯ ದ್ವಿದಳ ಧಾನ್ಯ ತಳಿ ಗಿಜಾ 3 ನಲ್ಲಿ ನಾಲ್ಕು ಎಸ್. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಗಳ ರೋಗದ ತೀವ್ರತೆ (%). ಮೌಲ್ಯಗಳು ಐದು ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳ ಸರಾಸರಿ ± SD ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ (n = 5). ವಿಭಿನ್ನ ಅಕ್ಷರಗಳು ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳ ನಡುವಿನ ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ಮಹತ್ವದ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ (p < 0.05). (F–H) ಐಸೊಲೇಟ್ #3 (dpi) ನೊಂದಿಗೆ ಇನಾಕ್ಯುಲೇಷನ್ ಮಾಡಿದ 10 ದಿನಗಳ ನಂತರ, ಕ್ರಮವಾಗಿ ನೆಲದ ಮೇಲಿನ ಕಾಂಡಗಳು ಮತ್ತು ಸಿಲಿಕ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ಬಿಳಿ ಅಚ್ಚು ಲಕ್ಷಣಗಳು ಕಾಣಿಸಿಕೊಂಡವು. (I) ಎಸ್. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಐಸೊಲೇಟ್ #3 ರ ಆಂತರಿಕ ಲಿಪ್ಯಂತರ ಸ್ಪೇಸರ್ (ITS) ಪ್ರದೇಶದ ವಿಕಸನೀಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಗರಿಷ್ಠ ಸಾಧ್ಯತೆ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನಡೆಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ರಾಷ್ಟ್ರೀಯ ಜೈವಿಕ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನ ಮಾಹಿತಿ ಕೇಂದ್ರ (NCBI) ಡೇಟಾಬೇಸ್‌ನಿಂದ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ಪಡೆದ 20 ಉಲ್ಲೇಖ ಐಸೊಲೇಟ್‌ಗಳು/ಸ್ಟ್ರೈನ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಲಾಗಿದೆ. ಕ್ಲಸ್ಟರಿಂಗ್ ರೇಖೆಗಳ ಮೇಲಿನ ಸಂಖ್ಯೆಗಳು ಪ್ರದೇಶದ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯನ್ನು (%) ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಕ್ಲಸ್ಟರಿಂಗ್ ರೇಖೆಗಳ ಕೆಳಗಿನ ಸಂಖ್ಯೆಗಳು ಶಾಖೆಯ ಉದ್ದವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.
ಇದಲ್ಲದೆ, ರೋಗಕಾರಕತೆಯನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸಲು, ನಾಲ್ಕು ಪಡೆದ S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಐಸೋಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಹಸಿರುಮನೆ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಸೂಕ್ಷ್ಮವಾಗಿರುವ ವಾಣಿಜ್ಯ ಬೀನ್ ತಳಿ ಗಿಜಾ 3 ಅನ್ನು ಚುಚ್ಚುಮದ್ದು ಮಾಡಲು ಬಳಸಲಾಯಿತು, ಇದು ಕೋಚ್‌ನ ಪೋಸ್ಟುಲೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 1E). ಪಡೆದ ಎಲ್ಲಾ ಶಿಲೀಂಧ್ರ ಐಸೋಲೇಟ್‌ಗಳು ರೋಗಕಾರಕವಾಗಿದ್ದು ಹಸಿರು ಬೀನ್ (ಸಿವಿ. ಗಿಜಾ 3) ಗೆ ಸೋಂಕು ತಗುಲಿಸಬಹುದು, ಇದು ನೆಲದ ಮೇಲಿನ ಎಲ್ಲಾ ಭಾಗಗಳಲ್ಲಿ (ಚಿತ್ರ 1F), ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಕಾಂಡಗಳ ಮೇಲೆ (ಚಿತ್ರ 1G) ಮತ್ತು ಬೀಜಕೋಶಗಳ ಮೇಲೆ (ಚಿತ್ರ 1H) ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ಬಿಳಿ ಅಚ್ಚು ಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುತ್ತದೆ, ಇನಾಕ್ಯುಲೇಷನ್ ನಂತರ 10 ದಿನಗಳಲ್ಲಿ (dpi), ಐಸೋಲೇಟ್ 3 ಎರಡು ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ ಅತ್ಯಂತ ಆಕ್ರಮಣಕಾರಿ ಐಸೋಲೇಟ್ ಆಗಿತ್ತು. ಐಸೋಲೇಟ್ 3 ಬೀನ್ ಸಸ್ಯಗಳಲ್ಲಿ ಅತ್ಯಧಿಕ ರೋಗದ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು (%) ಹೊಂದಿತ್ತು (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, ಮತ್ತು ಸೋಂಕಿನ ನಂತರ 7, 14 ಮತ್ತು 21 ದಿನಗಳಲ್ಲಿ ಕ್ರಮವಾಗಿ 76.7 ± 3.1; ಚಿತ್ರ 1F).
ಆಂತರಿಕ ಲಿಪ್ಯಂತರ ಸ್ಪೇಸರ್ (ITS) ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಆಧರಿಸಿ (ಚಿತ್ರ 1I) ಅತ್ಯಂತ ಆಕ್ರಮಣಕಾರಿ S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಐಸೊಲೇಟ್ #3 ರ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ದೃಢಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಐಸೊಲೇಟ್ #3 ಮತ್ತು 20 ಉಲ್ಲೇಖ ಐಸೊಲೇಟ್‌ಗಳು/ತಳಿಗಳ ನಡುವಿನ ಫೈಲೋಜೆನೆಟಿಕ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಅವುಗಳ ನಡುವೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಹೋಲಿಕೆಯನ್ನು (>99%) ತೋರಿಸಿದೆ. S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಐಸೊಲೇಟ್ #3 (533 bp) ಒಣ ಬಟಾಣಿ ಬೀಜಗಳಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾದ ಅಮೇರಿಕನ್ S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಐಸೊಲೇಟ್ LPM36 (ಜೆನ್‌ಬ್ಯಾಂಕ್ ಪ್ರವೇಶ ಸಂಖ್ಯೆ MK896659.1; 540 bp) ಮತ್ತು ನೇರಳೆ (ಮಥಿಯೋಲಾ ಇಂಕಾನಾ) ಕಾಂಡ ಕೊಳೆತಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುವ ಚೀನೀ S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಐಸೊಲೇಟ್ YKY211 (ಜೆನ್‌ಬ್ಯಾಂಕ್ ಪ್ರವೇಶ ಸಂಖ್ಯೆ OR206374.1; 548 bp) ಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಹೋಲಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಗಮನಿಸಬೇಕಾದ ಸಂಗತಿ, ಇವೆಲ್ಲವನ್ನೂ ಡೆಂಡ್ರೋಗ್ರಾಮ್‌ನ ಮೇಲ್ಭಾಗದಲ್ಲಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ವರ್ಗೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 1I). ಹೊಸ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು NCBI ಡೇಟಾಬೇಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಠೇವಣಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಅದನ್ನು "ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿನಿಯಾ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ - ಐಸೊಲೇಟ್ YN-25" (ಜೆನ್‌ಬ್ಯಾಂಕ್ ಪ್ರವೇಶ ಸಂಖ್ಯೆ PV202792) ಎಂದು ಹೆಸರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಐಸೊಲೇಟ್ 3 ಅತ್ಯಂತ ಆಕ್ರಮಣಕಾರಿ ಐಸೊಲೇಟ್ ಎಂದು ಕಾಣಬಹುದು; ಆದ್ದರಿಂದ, ಈ ಐಸೊಲೇಟ್ ಅನ್ನು ನಂತರದ ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ ಅಧ್ಯಯನಕ್ಕಾಗಿ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು.
S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಐಸೊಲೇಟ್ 3 ವಿರುದ್ಧ ವಿವಿಧ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ (12.5, 25, 50, 75, 100 ಮತ್ತು 125 mg/L) ಡೈಮೈನ್ L-ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನ (ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್, ಡಾರ್ಮ್‌ಸ್ಟಾಡ್ಟ್, ಜರ್ಮನಿ) ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾ ವಿರೋಧಿ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಇನ್ ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ ತನಿಖೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು. L-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾ ವಿರೋಧಿ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಬೀರಿತು ಮತ್ತು ಡೋಸ್-ಅವಲಂಬಿತ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಹೈಫೆಯ ರೇಡಿಯಲ್ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಕ್ರಮೇಣ ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಿತು ಎಂಬುದು ಗಮನಾರ್ಹ (ಚಿತ್ರ 2A, B). ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾದ ಅತ್ಯಧಿಕ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ (125 mg/L), L-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಅತ್ಯಧಿಕ ಮೈಸೀಲಿಯಲ್ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಪ್ರತಿಬಂಧ ದರವನ್ನು (99.62 ± 0.27%; ಚಿತ್ರ 2B) ಪ್ರದರ್ಶಿಸಿತು, ಇದು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾದ ಅತ್ಯಧಿಕ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ (10 mg/L) ವಾಣಿಜ್ಯ ಶಿಲೀಂಧ್ರನಾಶಕ ರಿಜೋಲೆಕ್ಸ್-ಟಿ (ಪ್ರತಿಬಂಧ ದರ 99.45 ± 0.39%; ಚಿತ್ರ 2C) ಗೆ ಸಮನಾಗಿತ್ತು, ಇದು ಇದೇ ರೀತಿಯ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿತ್ವವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಚಿತ್ರ 2. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿನಿಯಾ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೋರಮ್ ವಿರುದ್ಧ ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಆಂಟಿಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಲ್ ಚಟುವಟಿಕೆ. (ಎ) ಎಸ್. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೋರಮ್ ವಿರುದ್ಧ ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನ ವಿವಿಧ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳ ಆಂಟಿಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಲ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಹೋಲಿಕೆ ವಾಣಿಜ್ಯ ಶಿಲೀಂಧ್ರನಾಶಕ ರೈಜೋಲೆಕ್ಸ್-ಟಿ (10 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಲೀ). (ಬಿ, ಸಿ) ಕ್ರಮವಾಗಿ ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್ (12.5, 25, 50, 75, 100 ಮತ್ತು 125 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಲೀ) ಅಥವಾ ರೈಜೋಲೆಕ್ಸ್-ಟಿ (2, 4, 6, 8 ಮತ್ತು 10 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಲೀ) ನ ವಿಭಿನ್ನ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ನಂತರ ಎಸ್. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೋರಮ್ ಮೈಸಿಲಿಯಲ್ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಪ್ರತಿಬಂಧ ದರ (%). ಮೌಲ್ಯಗಳು ಐದು ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳ ಸರಾಸರಿ ± SD ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ (n = 5). ವಿಭಿನ್ನ ಅಕ್ಷರಗಳು ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳ ನಡುವಿನ ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ (p < 0.05). (D, E) ಕ್ರಮವಾಗಿ ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಮತ್ತು ವಾಣಿಜ್ಯ ಶಿಲೀಂಧ್ರನಾಶಕ ರೈಜೋಲೆಕ್ಸ್-ಟಿ ಯ ಪ್ರೊಬಿಟ್ ಮಾದರಿ ಹಿಂಜರಿತ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. ಪ್ರಾಬಿಟ್ ಮಾದರಿಯ ಹಿಂಜರಿತ ರೇಖೆಯನ್ನು ಘನ ನೀಲಿ ರೇಖೆಯಾಗಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹ ಮಧ್ಯಂತರವನ್ನು (95%) ಡ್ಯಾಶ್ ಮಾಡಿದ ಕೆಂಪು ರೇಖೆಯಾಗಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಪ್ರಾಬಿಟ್ ರಿಗ್ರೆಷನ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಅನುಗುಣವಾದ ಪ್ಲಾಟ್‌ಗಳನ್ನು ಕೋಷ್ಟಕ 1 ಮತ್ತು ಚಿತ್ರಗಳು 2D,E ನಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, L-ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನ ಸ್ವೀಕಾರಾರ್ಹ ಇಳಿಜಾರು ಮೌಲ್ಯ (y = 2.92x − 4.67) ಮತ್ತು ಸಂಬಂಧಿತ ಗಮನಾರ್ಹ ಅಂಕಿಅಂಶಗಳು (ಕಾಕ್ಸ್ & ಸ್ನೆಲ್ R2 = 0.3709, ನಾಗೆಲ್ಕೆರ್ಕೆ R2 = 0.4998 ಮತ್ತು p < 0.0001; ಚಿತ್ರ 2D) ವಾಣಿಜ್ಯ ಶಿಲೀಂಧ್ರನಾಶಕ ರೈಜೋಲೆಕ್ಸ್-ಟಿ (y = 1.96x − 0.99, ಕಾಕ್ಸ್ & ಸ್ನೆಲ್ R2 = 0.1242, ನಾಗೆಲ್ಕೆರ್ಕೆ R2 = 0.1708 ಮತ್ತು p < 0.0001) (ಕೋಷ್ಟಕ 1) ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ವಿರುದ್ಧ ವರ್ಧಿತ ಶಿಲೀಂಧ್ರನಾಶಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.
ಕೋಷ್ಟಕ 1. ಎಸ್. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ವಿರುದ್ಧ ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಮತ್ತು ವಾಣಿಜ್ಯ ಶಿಲೀಂಧ್ರನಾಶಕ "ರಿಜೋಲೆಕ್ಸ್-ಟಿ" ನ ಅರ್ಧ-ಗರಿಷ್ಠ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಸಾಂದ್ರತೆಯ (IC50) ಮತ್ತು IC99 (mg/l) ಮೌಲ್ಯಗಳು.
ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ಸಂಸ್ಕರಿಸದ S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್-ಸೋಂಕಿತ ಸಸ್ಯಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಸಾಮಾನ್ಯ ಬೀನ್ಸ್ ಸಸ್ಯಗಳಲ್ಲಿ L-ಆರ್ನಿಥೈನ್ (250 mg/L) ಬಿಳಿ ಅಚ್ಚಿನ ಬೆಳವಣಿಗೆ ಮತ್ತು ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿತು (ನಿಯಂತ್ರಣ; ಚಿತ್ರ 3A). ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, ಸಂಸ್ಕರಿಸದ ಸೋಂಕಿತ ನಿಯಂತ್ರಣ ಸಸ್ಯಗಳ ರೋಗದ ತೀವ್ರತೆಯು ಕ್ರಮೇಣ ಹೆಚ್ಚಾದರೂ (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, ಮತ್ತು 92.33 ± 3.06%), L-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಪ್ರಯೋಗದ ಉದ್ದಕ್ಕೂ ರೋಗದ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು (%) ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿತು (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, ಮತ್ತು 26.36 ± 3.07) ಕ್ರಮವಾಗಿ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ 7, 14 ಮತ್ತು 21 ದಿನಗಳ ನಂತರ (dpt) (ಚಿತ್ರ 3A). ಅದೇ ರೀತಿ, ಎಸ್. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್-ಸೋಂಕಿತ ಬೀನ್ ಸಸ್ಯಗಳನ್ನು 250 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಲೀ ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನಿಂದ ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದಾಗ, ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡದ ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿ ರೋಗ ಪ್ರಗತಿ ರೇಖೆಯ (AUDPC) ಅಡಿಯಲ್ಲಿರುವ ಪ್ರದೇಶವು 1274.33 ± 33.13 ರಿಂದ 281.03 ± 7.95 ಕ್ಕೆ ಇಳಿದಿದೆ, ಇದು ಧನಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣ 50 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಲೀ ರಿಜೋಲೆಕ್ಸ್-ಟಿ ಶಿಲೀಂಧ್ರನಾಶಕಕ್ಕಿಂತ ಸ್ವಲ್ಪ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ (183.61 ± 7.71; ಚಿತ್ರ 3B). ಎರಡನೇ ಪ್ರಯೋಗದಲ್ಲಿಯೂ ಅದೇ ಪ್ರವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಯಿತು.
ಚಿತ್ರ 3. ಹಸಿರುಮನೆ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿನಿಯಾ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್‌ನಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ಸಾಮಾನ್ಯ ಹುರುಳಿಯ ಬಿಳಿ ಕೊಳೆತದ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಮೇಲೆ ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನ ಬಾಹ್ಯ ಬಳಕೆಯ ಪರಿಣಾಮ. (ಎ) 250 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಲೀ ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ನಂತರ ಸಾಮಾನ್ಯ ಹುರುಳಿಯ ಬಿಳಿ ಅಚ್ಚಿನ ರೋಗದ ಪ್ರಗತಿ ರೇಖೆ (ಎಯುಡಿಪಿಸಿ) ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರದೇಶ. ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ನಂತರ ಸಾಮಾನ್ಯ ಹುರುಳಿಯ ಬಿಳಿ ಅಚ್ಚಿನ ರೋಗದ ಪ್ರಗತಿ ರೇಖೆ (ಎಯುಡಿಪಿಸಿ). ಮೌಲ್ಯಗಳು ಐದು ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳ ಸರಾಸರಿ ± SD ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ (n = 5). ವಿಭಿನ್ನ ಅಕ್ಷರಗಳು ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳ ನಡುವಿನ ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ಮಹತ್ವದ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ (p < 0.05).
42 ದಿನಗಳ ನಂತರ 250 mg/L L-ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನ ಬಾಹ್ಯ ಬಳಕೆಯು ಸಸ್ಯದ ಎತ್ತರ (ಚಿತ್ರ 4A), ಪ್ರತಿ ಸಸ್ಯಕ್ಕೆ ಕೊಂಬೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ (ಚಿತ್ರ 4B) ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಸಸ್ಯಕ್ಕೆ ಎಲೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ (ಚಿತ್ರ 4C) ಯನ್ನು ಕ್ರಮೇಣ ಹೆಚ್ಚಿಸಿತು. ವಾಣಿಜ್ಯ ಶಿಲೀಂಧ್ರನಾಶಕ ರೈಜೋಲೆಕ್ಸ್-ಟಿ (50 mg/L) ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಿದ ಎಲ್ಲಾ ಪೌಷ್ಟಿಕಾಂಶದ ನಿಯತಾಂಕಗಳ ಮೇಲೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಬೀರಿದರೆ, ಸಂಸ್ಕರಿಸದ ನಿಯಂತ್ರಣಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ 250 mg/L L-ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನ ಬಾಹ್ಯ ಬಳಕೆಯು ಎರಡನೇ ಅತಿದೊಡ್ಡ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಬೀರಿತು (ಚಿತ್ರ 4A–C). ಮತ್ತೊಂದೆಡೆ, ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯು ದ್ಯುತಿಸಂಶ್ಲೇಷಕ ವರ್ಣದ್ರವ್ಯಗಳಾದ ಕ್ಲೋರೊಫಿಲ್ ಎ (ಚಿತ್ರ 4 ಡಿ) ಮತ್ತು ಕ್ಲೋರೊಫಿಲ್ ಬಿ (ಚಿತ್ರ 4 ಇ) ಗಳ ವಿಷಯದ ಮೇಲೆ ಯಾವುದೇ ಗಮನಾರ್ಹ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಲಿಲ್ಲ, ಆದರೆ ನಕಾರಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣ (0.44 ± 0.02 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಗ್ರಾಂ ತೂಕದಿಂದ) ಮತ್ತು ಸಕಾರಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣ (0.46 ± 0.02 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಗ್ರಾಂ ತೂಕದಿಂದ) ಕ್ಕೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಒಟ್ಟು ಕ್ಯಾರೊಟಿನಾಯ್ಡ್ ಅಂಶವನ್ನು (0.56 ± 0.03 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಗ್ರಾಂ ತೂಕದಿಂದ) ಸ್ವಲ್ಪ ಹೆಚ್ಚಿಸಿತು. ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ದ್ವಿದಳ ಧಾನ್ಯಗಳಿಗೆ ಫೈಟೊಟಾಕ್ಸಿಕ್ ಅಲ್ಲ ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಚಿತ್ರ 4. ಹಸಿರುಮನೆ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿನಿಯಾ ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಸೋಂಕಿತ ಬೀನ್ ಎಲೆಗಳ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳು ಮತ್ತು ದ್ಯುತಿಸಂಶ್ಲೇಷಕ ವರ್ಣದ್ರವ್ಯಗಳ ಮೇಲೆ ಬಾಹ್ಯ ಎಲ್-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಅನ್ವಯದ ಪರಿಣಾಮ. (ಎ) ಸಸ್ಯ ಎತ್ತರ (ಸೆಂ), (ಬಿ) ಪ್ರತಿ ಸಸ್ಯಕ್ಕೆ ಶಾಖೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ, (ಸಿ) ಪ್ರತಿ ಸಸ್ಯಕ್ಕೆ ಎಲೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ, (ಡಿ) ಕ್ಲೋರೋಫಿಲ್ ಎ ಅಂಶ (ಮಿಗ್ರಾಂ ಗ್ರಾಂ-1 ಫ್ರಾಂ wt), (ಇ) ಕ್ಲೋರೋಫಿಲ್ ಬಿ ಅಂಶ (ಮಿಗ್ರಾಂ ಗ್ರಾಂ-1 ಫ್ರಾಂ wt), (ಎಫ್) ಒಟ್ಟು ಕ್ಯಾರೋಟಿನಾಯ್ಡ್ ಅಂಶ (ಮಿಗ್ರಾಂ ಗ್ರಾಂ-1 ಫ್ರಾಂ wt). ಮೌಲ್ಯಗಳು ಐದು ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳ ಸರಾಸರಿ ± SD (n = 5) ಆಗಿದೆ. ವಿಭಿನ್ನ ಅಕ್ಷರಗಳು ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳ ನಡುವಿನ ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ಮಹತ್ವದ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ (p < 0.05).
ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಆಮ್ಲಜನಕ ಪ್ರಭೇದಗಳ (ROS; ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಪೆರಾಕ್ಸೈಡ್ [H2O2] ಎಂದು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ) ಮತ್ತು ಸ್ವತಂತ್ರ ರಾಡಿಕಲ್‌ಗಳಾಗಿ (ಸೂಪರ್‌ಆಕ್ಸೈಡ್ ಅಯಾನುಗಳು [O2•−] ಎಂದು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ) ಸಿತು ಹಿಸ್ಟೋಕೆಮಿಕಲ್ ಸ್ಥಳೀಕರಣದಲ್ಲಿ L-ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನ (250 mg/L) ಬಾಹ್ಯ ಬಳಕೆಯು H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; ಚಿತ್ರ 5A) ಮತ್ತು O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; ಚಿತ್ರ 5B) ಸಂಗ್ರಹಣೆಯನ್ನು ಗಣನೀಯವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿದೆ ಎಂದು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು, ಸಂಸ್ಕರಿಸದ ಸೋಂಕಿತ ಸಸ್ಯಗಳ (ಕ್ರಮವಾಗಿ 173.31 ± 12.06 ಮತ್ತು 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) ಮತ್ತು 50 mg/L ವಾಣಿಜ್ಯ ಶಿಲೀಂಧ್ರನಾಶಕ ರಿಜೋಲೆಕ್ಸ್-ಟಿ (170.12 ± 9.50 ಮತ್ತು 157.00 ± 7.81) ಶೇಖರಣೆಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ. 72 ಗಂಟೆಗಳಲ್ಲಿ ಕ್ರಮವಾಗಿ nmol.g−1 fr wt). hpt ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹವಾದ H2O2 ಮತ್ತು O2•− ನ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟಗಳು (ಚಿತ್ರ 5A, B). ಅದೇ ರೀತಿ, TCA-ಆಧಾರಿತ ಮಾಲೋಂಡಿಯಾಲ್ಡಿಹೈಡ್ (MDA) ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್-ಸೋಂಕಿತ ಹುರುಳಿ ಸಸ್ಯಗಳು ತಮ್ಮ ಎಲೆಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟದ MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) ಅನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 5C). ಆದಾಗ್ಯೂ, L-ಆರ್ನಿಥೈನ್‌ನ ಬಾಹ್ಯ ಬಳಕೆಯು ಲಿಪಿಡ್ ಪೆರಾಕ್ಸಿಡೀಕರಣವನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿತು, ಇದು ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಸಸ್ಯಗಳಲ್ಲಿ MDA ಅಂಶದಲ್ಲಿನ ಇಳಿಕೆಯಿಂದ ಸಾಕ್ಷಿಯಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
ಚಿತ್ರ 5. ಹಸಿರುಮನೆ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಸೋಂಕಿನ ನಂತರ 72 ಗಂಟೆಗಳಲ್ಲಿ S. ಸ್ಕ್ಲೆರೋಟಿಯೊರಮ್ ಸೋಂಕಿತ ಬೀನ್ ಎಲೆಗಳಲ್ಲಿ ಆಕ್ಸಿಡೇಟಿವ್ ಒತ್ತಡ ಮತ್ತು ಕಿಣ್ವಕವಲ್ಲದ ಉತ್ಕರ್ಷಣ ನಿರೋಧಕ ರಕ್ಷಣಾ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ಪ್ರಮುಖ ಗುರುತುಗಳ ಮೇಲೆ ಬಾಹ್ಯ L-ಆರ್ನಿಥೈನ್ ಅನ್ವಯದ ಪರಿಣಾಮ. (A) 72 hpt ನಲ್ಲಿ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ ಪೆರಾಕ್ಸೈಡ್ (H2O2; nmol g−1 FW), (B) 72 hpt ನಲ್ಲಿ ಸೂಪರ್ಆಕ್ಸೈಡ್ ಅಯಾನ್ (O2•−; nmol g−1 FW), (C) 72 hpt ನಲ್ಲಿ ಮ್ಯಾಲೋಂಡಿಯಾಲ್ಡಿಹೈಡ್ (MDA; nmol g−1 FW), (D) 72 hpt ನಲ್ಲಿ ಒಟ್ಟು ಕರಗುವ ಫೀನಾಲ್‌ಗಳು (mg GAE g−1 FW), (E) 72 hpt ನಲ್ಲಿ ಒಟ್ಟು ಕರಗುವ ಫ್ಲೇವನಾಯ್ಡ್‌ಗಳು (mg RE g−1 FW), (F) 72 hpt ನಲ್ಲಿ ಒಟ್ಟು ಉಚಿತ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳು (mg g−1 FW) ಮತ್ತು (G) 72 hpt ನಲ್ಲಿ ಪ್ರೊಲೈನ್ ಅಂಶ (mg g−1 FW). ಮೌಲ್ಯಗಳು 5 ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳ (n = 5) ಸರಾಸರಿ ± ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನವನ್ನು (ಸರಾಸರಿ ± SD) ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ. ವಿಭಿನ್ನ ಅಕ್ಷರಗಳು ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳ ನಡುವಿನ ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ಮಹತ್ವದ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ (p < 0.05).