ಜೀವಕೋಶ ವಿಭಾಗೀಕರಣ ಮತ್ತು ಹೋಮಿಯೋಸ್ಟಾಸಿಸ್ ಅನ್ನು ಕಾಪಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು ಸ್ರವಿಸುವ ಮಾರ್ಗದಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ವಿಂಗಡಣೆ ಅತ್ಯಗತ್ಯ. ಶೆಲ್-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ವಿಂಗಡಣೆಯ ಜೊತೆಗೆ, ಸ್ರವಿಸುವ ಸಾಗಣೆಯ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಕಿನೆಸಿನ್ ವಿಂಗಡಣೆಯಲ್ಲಿ ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳ ಪಾತ್ರವು ಇನ್ನೂ ಉತ್ತರಿಸಲಾಗದ ದೀರ್ಘಕಾಲೀನ ಮೂಲಭೂತ ಪ್ರಶ್ನೆಯಾಗಿದೆ. ಇಲ್ಲಿ, ಹೊಸದಾಗಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾದ ಗ್ಲೈಕೋಸಿಲ್ಫಾಸ್ಫಾಟಿಡಿಲಿನೋಸಿಟಾಲ್-ನಿಶ್ಚಲಗೊಳಿಸಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಬಹಳ ಉದ್ದವಾದ ಸೆರಾಮೈಡ್ ಲಿಪಿಡ್ ಭಾಗಗಳೊಂದಿಗೆ ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ವಿಶೇಷ ಎಂಡೋಪ್ಲಾಮ್‌ಗಳಾಗಿ ವರ್ಗೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ಇನ್ ವಿವೋದಲ್ಲಿ ಸಾಬೀತುಪಡಿಸಲು ನಾವು 3D ಏಕಕಾಲಿಕ ಬಹುವರ್ಣದ ಹೈ-ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ನೈಜ-ಸಮಯದ ಚಿತ್ರಣವನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತೇವೆ. ನಿವ್ವಳ ನಿರ್ಗಮನ ತಾಣ, ಇದು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಬಳಸುವುದಕ್ಕಿಂತ ಭಿನ್ನವಾಗಿದೆ. ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಎಂಡೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ರೆಟಿಕ್ಯುಲಮ್ ಮೆಂಬರೇನ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಸೆರಾಮೈಡ್‌ನ ಸರಪಳಿಯ ಉದ್ದವು ಈ ವಿಂಗಡಣೆಯ ಆಯ್ಕೆಗೆ ನಿರ್ಣಾಯಕವಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ. ಲಿಪಿಡ್ ಸರಪಳಿಯ ಉದ್ದವನ್ನು ಆಧರಿಸಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸರಕುಗಳನ್ನು ಸ್ರವಿಸುವ ಮಾರ್ಗದಲ್ಲಿ ಆಯ್ದ ರಫ್ತು ತಾಣಗಳಾಗಿ ವರ್ಗೀಕರಿಸಲು ನಮ್ಮ ಅಧ್ಯಯನವು ಮೊದಲ ನೇರ ಇನ್ ವಿವೋ ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.
ಯುಕ್ಯಾರಿಯೋಟಿಕ್ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ, ಎಂಡೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ರೆಟಿಕ್ಯುಲಮ್ (ER) ನಲ್ಲಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ನಂತರ ಅವುಗಳ ಸೂಕ್ತವಾದ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಗಮ್ಯಸ್ಥಾನಕ್ಕೆ ತಲುಪಿಸಲು ಸ್ರವಿಸುವ ಮಾರ್ಗದ ಮೂಲಕ ಸಾಗಣೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ವಿಂಗಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (1). ಕೋಟ್-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ವಿಂಗಡಣೆಯ ಜೊತೆಗೆ, ಕೆಲವು ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪೊರೆಯ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಅವುಗಳನ್ನು ಗುಂಪು ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಆಯ್ದ ನಿರ್ಗಮನ ಬಿಂದುಗಳಾಗಿಯೂ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಬಹಳ ಹಿಂದಿನಿಂದಲೂ ಊಹಿಸಲಾಗಿತ್ತು, ಆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು (2-5). ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ಸಂಭವನೀಯ ಲಿಪಿಡ್-ಆಧಾರಿತ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಸಾಬೀತುಪಡಿಸಲು ನೇರ ಇನ್ ವಿವೋ ಪುರಾವೆಗಳ ಕೊರತೆ ಇನ್ನೂ ಇದೆ. ಈ ಮೂಲಭೂತ ಸಮಸ್ಯೆಯನ್ನು ಪರಿಹರಿಸಲು, ಗ್ಲೈಕೋಸಿಲ್ಫಾಸ್ಫಾಟಿಡಿಲಿನೋಸಿಟಾಲ್ (GPI) ಆಂಕರ್ ಮಾಡಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು (GPI-APs) ER ನಿಂದ ಹೇಗೆ ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿ ರಫ್ತು ಮಾಡಲ್ಪಡುತ್ತವೆ ಎಂಬುದನ್ನು ನಾವು ಯೀಸ್ಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ. GPI-APಗಳು ವಿವಿಧ ರೀತಿಯ ಲಿಪಿಡ್-ಸಂಪರ್ಕಿತ ಜೀವಕೋಶ ಮೇಲ್ಮೈ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಾಗಿವೆ (6, 7). GPI-AP ಎಂಬುದು ಗ್ಲೈಕೋಲಿಪಿಡ್ ಮೊಯಿಟಿ (GPI ಆಂಕರ್) ಮೂಲಕ ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಪೊರೆಯ ಹೊರಗಿನ ಚಿಗುರೆಲೆಗಳಿಗೆ ಜೋಡಿಸಲಾದ ಸ್ರವಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಆಗಿದೆ. ಅವರು GPI ಆಂಕರ್‌ಗಳನ್ನು ER ಲುಮೆನ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಂಪ್ರದಾಯವಾದಿ ನಂತರದ ಅನುವಾದ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳಾಗಿ ಸ್ವೀಕರಿಸುತ್ತಾರೆ (8). ಲಗತ್ತಿಸಿದ ನಂತರ, GPI-AP ಗಾಲ್ಗಿ ಉಪಕರಣದ ಮೂಲಕ ER ನಿಂದ ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಮೆಂಬರೇನ್‌ಗೆ ಹಾದುಹೋಗುತ್ತದೆ (5, 9). GPI ಆಂಕರ್‌ಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯು GPI-AP ಅನ್ನು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಸ್ರವಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಂದ (ಇತರ ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಮೆಂಬರೇನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಂತೆ) ಸ್ರವಿಸುವ ಮಾರ್ಗದಲ್ಲಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಸಾಗಿಸಲು ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ (5, 9, 10). ಯೀಸ್ಟ್ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ, GPI-AP ಗಳನ್ನು ಎಂಡೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ರೆಟಿಕ್ಯುಲಮ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಇತರ ಸ್ರವಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ಕೋಟ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕಾಂಪ್ಲೆಕ್ಸ್ II (COPII) (6, 7) ನಿಂದ ಸುತ್ತುವ ವಿಶಿಷ್ಟ ಕೋಶಕಗಳಾಗಿ ಪ್ಯಾಕ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ER ರಫ್ತು ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಈ ವರ್ಗೀಕರಣ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ನಿರ್ಣಾಯಕ ಅಂಶಗಳು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿಲ್ಲ, ಆದರೆ ಈ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಕ್ಕೆ ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳು ಬೇಕಾಗಬಹುದು ಎಂದು ಊಹಿಸಲಾಗಿದೆ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ GPI ಆಂಕರ್‌ನ ಲಿಪಿಡ್ ಭಾಗದ ರಚನಾತ್ಮಕ ಮರುರೂಪಿಸುವಿಕೆ (5, 8). ಯೀಸ್ಟ್‌ನಲ್ಲಿ, GPI ಲಿಪಿಡ್ ಮರುರೂಪಿಸುವಿಕೆಯು GPI ಲಗತ್ತಿಸಿದ ತಕ್ಷಣ ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅನೇಕ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, ಇದು ಸೆರಾಮೈಡ್ ಅನ್ನು 26-ಕಾರ್ಬನ್ ಲಾಂಗ್-ಚೈನ್ ಸ್ಯಾಚುರೇಟೆಡ್ ಫ್ಯಾಟಿ ಆಸಿಡ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸಲು ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ (C26:0) (11, 12). C26 ಸೆರಾಮೈಡ್ ಇದುವರೆಗೆ ಯೀಸ್ಟ್ ಕೋಶಗಳಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ಮುಖ್ಯ ಸೆರಾಮೈಡ್ ಆಗಿದೆ. ಇದನ್ನು ER ನಲ್ಲಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅದರಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನದನ್ನು COPII ಕೋಶಕಗಳ ಮೂಲಕ ಗಾಲ್ಗಿ ಉಪಕರಣಕ್ಕೆ ರಫ್ತು ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ (13). GPI-AP ನ ER ರಫ್ತಿಗೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ನಡೆಯುತ್ತಿರುವ ಸೆರಾಮೈಡ್ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ (14, 15), ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಯಾಗಿ, ಗಾಲ್ಗಿ ಉಪಕರಣದಲ್ಲಿ ಸೆರಾಮೈಡ್ ಅನ್ನು ಇನೋಸಿಟಾಲ್ ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಸೆರಾಮೈಡ್ (IPC) ಗೆ ಪರಿವರ್ತಿಸುವುದು GPI ಆಂಕರ್ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿರುತ್ತದೆ (16). ಕೃತಕ ಪೊರೆಗಳೊಂದಿಗಿನ ಜೈವಿಕ ಭೌತಿಕ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಬಹಳ ಉದ್ದವಾದ ಅಸಿಲ್ ಸರಪಳಿ ಸೆರಾಮೈಡ್‌ಗಳು ವಿಶಿಷ್ಟ ಭೌತಿಕ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳೊಂದಿಗೆ ಕ್ರಮಬದ್ಧ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಒಗ್ಗೂಡಿಸಬಹುದು ಎಂದು ತೋರಿಸಿವೆ (17, 18). ಈ ಡೇಟಾವು C26 ಸೆರಾಮೈಡ್‌ನೊಂದಿಗೆ C26 ಸೆರಾಮೈಡ್ ಮತ್ತು GPI-AP ತಮ್ಮ ಭೌತಿಕ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಗೊಂದಲಮಯ ER ಮೆಂಬರೇನ್ ಲಿಪಿಡ್ ಪರಿಸರದಲ್ಲಿ ಕ್ರಮಬದ್ಧ ಪ್ರದೇಶಗಳು ಅಥವಾ ಪ್ರದೇಶಗಳಾಗಿ ಒಗ್ಗೂಡಿಸಲು ಬಳಸುತ್ತವೆ ಎಂಬ ಊಹೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. ಇದು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಸಣ್ಣ ಮತ್ತು ಅಪರ್ಯಾಪ್ತ ಗ್ಲಿಸರೊಲಿಪಿಡ್‌ಗಳಿಂದ ಕೂಡಿದೆ (C16:1 ಮತ್ತು C18:1) (19, 20). ಈ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ER ನಿರ್ಗಮನ ತಾಣಗಳ (ERES) ಮೇಲೆ ಆಯ್ದವಾಗಿ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಅಲ್ಲಿ ಸೆರಾಮೈಡ್ ಮತ್ತು ಸೆರಾಮೈಡ್-ಆಧಾರಿತ GPI-AP ಅನ್ನು ಅದೇ ಮೀಸಲಾದ COPII ವೆಸಿಕಲ್ (5) ನಲ್ಲಿ ಗಾಲ್ಗಿಗೆ ಸಹ-ಸಾಗಿಸಬಹುದು.
ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ, ಸೂಪರ್-ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ರಿಯಲ್-ಟೈಮ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ (SCLIM) ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನಾವು ಈ ಲಿಪಿಡ್-ಆಧಾರಿತ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಆಗಿ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಬಹುದಾದ ಅತ್ಯಾಧುನಿಕ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ ತಂತ್ರವಾಗಿದೆ. ಮೂರು-ಬಣ್ಣ ಮತ್ತು ಮೂರು-ಆಯಾಮದ (3D) ಚಿತ್ರಗಳು ಜೀವಂತ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಅತ್ಯಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ಮತ್ತು ವೇಗವನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ (21, 22).
S. cerevisiae ನಲ್ಲಿ ER ಅನ್ನು ಬಿಟ್ಟ ನಂತರ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಸ್ರವಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಂದ C26 ಸೆರಾಮೈಡ್ ಗುಂಪಿನೊಂದಿಗೆ ಸಾಮಾನ್ಯ GPI-AP ಅನ್ನು ಹೇಗೆ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು ಎಂಬುದನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲು ನಾವು ಮೊದಲು SCLIM ತಂತ್ರಜ್ಞಾನವನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಿದ್ದೇವೆ. ER ನ ವರ್ಗೀಕರಣವನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಲು, ನಾವು ಹೊಸದಾಗಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ ಸರಕು ERES ಅನ್ನು ಇನ್ ವಿವೋದಲ್ಲಿ ಪ್ರವೇಶಿಸುವುದನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸುವ ಆನುವಂಶಿಕ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ (7, 23). ಸರಕುಗಳಾಗಿ, ನಾವು ಹಸಿರು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪ್ರೋಟೀನ್ (GFP) ನೊಂದಿಗೆ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ C26 ಸೆರಾಮೈಡ್-ಆಧಾರಿತ GPI-AP ಗ್ಯಾಸ್1 ಮತ್ತು ನಿಯರ್-ಇನ್ಫ್ರಾರೆಡ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ (iRFP) ನೊಂದಿಗೆ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಸ್ರವಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್ Mid2 ಅನ್ನು ಆರಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇವೆರಡೂ ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಮೆಂಬರೇನ್ ಅನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿರಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ (24–26). sec31-1 ತಾಪಮಾನ-ಸೂಕ್ಷ್ಮ ರೂಪಾಂತರದಲ್ಲಿ, ಈ ಎರಡು ಸರಕುಗಳನ್ನು ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಸ್-ಪ್ರೇರೇಪಿಸಬಹುದಾದ ಪ್ರವರ್ತಕ ಮತ್ತು ರಚನಾತ್ಮಕ ERES ಮಾರ್ಕರ್ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ತೀವ್ರ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ (37°C), sec31-1 ರೂಪಾಂತರವು COPII ಮೊಳಕೆಯೊಡೆಯುವಿಕೆ ಮತ್ತು ER ರಫ್ತನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಲು COPII ಕೋಟ್ ಘಟಕ Sec31 ರ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವುದರಿಂದ, ಹೊಸದಾಗಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ ಸರಕು ER ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ (23). ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನಕ್ಕೆ (24°C) ತಣ್ಣಗಾದ ನಂತರ, sec31-1 ರೂಪಾಂತರಿತ ಕೋಶಗಳು ಸ್ರವಿಸುವ ಪ್ರದೇಶದಿಂದ ಚೇತರಿಸಿಕೊಂಡವು ಮತ್ತು ಸಂಗ್ರಹವಾದ ಹೊಸ ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ ಸರಕುಗಳನ್ನು ER ನಿಂದ ರಫ್ತು ಮಾಡಲು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಲಾಯಿತು. CLIM ದೃಶ್ಯೀಕರಣವು ಹೊಸದಾಗಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾದ Gas1-GFP ಮತ್ತು Mid2-iRFP ಗಳು 37°C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಟ್ಟ ನಂತರ sec31-1 ರೂಪಾಂತರಿತ ಕೋಶಗಳ ER ನಲ್ಲಿ ಇನ್ನೂ ಸಂಗ್ರಹವಾಗಿವೆ ಮತ್ತು ನಂತರ 24°C ನಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಬಿಡುಗಡೆಯಾಗುತ್ತವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 1). Mid2-iRFP ಅನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣ ER ಪೊರೆಯ ಮೇಲೆ ವಿತರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು Gas1-GFP ನಿರಂತರ ER ಪೊರೆಯ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರೀಕೃತವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಅವುಗಳ ವಿತರಣೆಯು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಭಿನ್ನವಾಗಿರುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 1, A ನಿಂದ C ಮತ್ತು ಮೂವಿ S1). ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಚಿತ್ರ 1D ಯಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ, Gas1-GFP ಕ್ಲಸ್ಟರ್ Mid2-iRFP ಅನ್ನು ಹೊಂದಿಲ್ಲ. ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು GPI-AP ಮತ್ತು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಮೊದಲೇ ವಿಭಿನ್ನ ER ಪೊರೆಯ ಪ್ರದೇಶಗಳಾಗಿ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ. Gas1-GFP ಕ್ಲಸ್ಟರ್ mCherry ಯ COPII ಕೋಟ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ Sec13 (ಚಿತ್ರ 1, E ಮತ್ತು F, ಮತ್ತು ಚಲನಚಿತ್ರ S1) (23) ನೊಂದಿಗೆ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ERES ಗೆ ಪಕ್ಕದಲ್ಲಿದೆ.
sec31-1 ಜೀವಕೋಶಗಳು ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಸ್-ಪ್ರೇರಿತ ಸ್ರವಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುತ್ತವೆ, ಉದ್ದವಾದ ಅಸಿಲ್ ಸರಪಳಿ (C26) ಸೆರಾಮೈಡ್ GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ಹಸಿರು) ಮತ್ತು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ Mid2-iRFP (TMP, ನೀಲಿ) ಮತ್ತು ಈ ರಚನಾತ್ಮಕ ERES ಲೇಬಲಿಂಗ್ Sec13-mCherry (ERES, ಮೆಜೆಂಟಾ) ಅನ್ನು 37°C ನಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು, 24°C ಗೆ ಸರಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು 5 ನಿಮಿಷಗಳ ನಂತರ SCLIM ನಿಂದ ಚಿತ್ರಿಸಲಾಗಿದೆ. (A ನಿಂದ C) ಸಮತಲದ ಪ್ರತಿನಿಧಿ ವಿಲೀನಗೊಂಡ ಅಥವಾ ಏಕ 2D ಚಿತ್ರ (A), 10 z-ವಿಭಾಗಗಳ 2D ಪ್ರೊಜೆಕ್ಷನ್ ಚಿತ್ರ (B) ಅಥವಾ ಸರಕು ಮತ್ತು ERES ಮಾರ್ಕರ್‌ಗಳ 3D ಕೋಶ ಗೋಳಾರ್ಧದ ಚಿತ್ರ (C) ಅನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್ 1μm (A ಮತ್ತು B). ಸ್ಕೇಲ್ ಘಟಕವು 0.551μm (C) ಆಗಿದೆ. Gas1-GFP ಅನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕ ER ಪ್ರದೇಶಗಳು ಅಥವಾ ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗಿದೆ, ಆದರೆ Mid2-iRFP ಅನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ER ಮೆಂಬರೇನ್ (C) ಉದ್ದಕ್ಕೂ ವಿತರಿಸಲಾಗಿದೆ. (D) ಗ್ರಾಫ್ Gas1-GFP ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ನಲ್ಲಿ Gas1-GFP ಮತ್ತು Mid2-iRFP ಯ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು ಬಿಳಿ ಬಾಣದ ರೇಖೆಯ (ಎಡ) ಉದ್ದಕ್ಕೂ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. AU, ಅನಿಯಂತ್ರಿತ ಘಟಕ. (E ಮತ್ತು F) ಸರಕುಗಳು ಮತ್ತು ERES ಗುರುತುಗಳನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸುವ 3D ಚಿತ್ರವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ERES ಬಳಿ Gas1-GFP ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗಿದೆ. ಸ್ಕೇಲ್ ಘಟಕ 0.551μm ಆಗಿದೆ. (F) ಬಿಳಿ ಘನ ಬಾಣವು ERES ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ Gas1-GFP ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಅನ್ನು ಗುರುತಿಸುತ್ತದೆ. ಮಧ್ಯ ಮತ್ತು ಬಲ ಫಲಕಗಳು ವಿಲೀನಗೊಂಡ ವಿಸ್ತರಿಸಿದ 3D ಚಿತ್ರ ಮತ್ತು ಆಯ್ದ Gas1-GFP ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ನ ತಿರುಗಿದ ನೋಟವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ.
Gas1-GFP ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ERES ನಡುವಿನ ನಿಕಟ ಪ್ರಾದೇಶಿಕ ಸಂಬಂಧವು Gas1-GFP ಆಯ್ದ ERES ಅನ್ನು ಪ್ರವೇಶಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು Mid2-iRFP ER ಅನ್ನು ಬಿಡಲು ಬಳಸುವ ಆಯ್ಕೆಗಿಂತ ಭಿನ್ನವಾಗಿದೆ. ಈ ಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ಪರಿಹರಿಸಲು, ನಾವು ಕೇವಲ ಒಂದು ಅಥವಾ ಎರಡು ಸರಕುಗಳಿಗೆ ERES ಅನುಪಾತವನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 2, A ನಿಂದ C). ಹೆಚ್ಚಿನ ERES (70%) ಕೇವಲ ಒಂದು ರೀತಿಯ ಸರಕುಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಒಳಗೊಂಡಿರುವುದನ್ನು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ. ಚಿತ್ರ 2C ಯ ಕೆಳಗಿನ ಚಿತ್ರವು Gas1-GFP (ಚಿತ್ರ 1) ಅಥವಾ Mid2-iRFP (ಚಿತ್ರ 2) ಮಾತ್ರ ಹೊಂದಿರುವ ERES ನ ಎರಡು ವಿಶಿಷ್ಟ ಉದಾಹರಣೆಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಇದಕ್ಕೆ ವಿರುದ್ಧವಾಗಿ, ಸರಿಸುಮಾರು 20% ERES ಒಂದೇ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ ಎರಡು ಸರಕುಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ. ಕೆಲವು ERES (10%) ಎರಡು ರೀತಿಯ ಸರಕುಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವುದು ಕಂಡುಬಂದಿದೆ, ಆದರೆ ಅವು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿ ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರದೇಶಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿವೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಈ ಅಂಕಿಅಂಶಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ER ಅನ್ನು ರಫ್ತು ಮಾಡಿದ ನಂತರ, GPI-AP Gas1-GFP ಮತ್ತು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಸರಕು Mid2-iRFP ಅನ್ನು ವಿಭಿನ್ನ ERES ಆಗಿ ವಿಂಗಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 2D). ಈ ವಿಂಗಡಣೆ ದಕ್ಷತೆಯು ಹಿಂದಿನ ಜೀವರಾಸಾಯನಿಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (6) ಮತ್ತು ರೂಪವಿಜ್ಞಾನ ನಿರ್ಣಯ (7) ನೊಂದಿಗೆ ಬಹಳ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ. ERES (ಚಿತ್ರ 2E ಮತ್ತು ಚಲನಚಿತ್ರ S2) ಗೆ ಪ್ರವೇಶಿಸುವ ಕ್ವಾರಂಟೈನ್ಡ್ ಸರಕುಗಳ ನಡವಳಿಕೆಯನ್ನು ಸಹ ನಾವು ಗಮನಿಸಬಹುದು. ಚಿತ್ರ 2E, Gas1-GFP (ಪ್ಯಾನಲ್ 3) ಅಥವಾ Mid2-iRFP (ಪ್ಯಾನಲ್ 4) ನ ಒಂದು ಸಣ್ಣ ಭಾಗ ಮಾತ್ರ ERES ಅನ್ನು ಒಂದು ಬದಿಯಿಂದ ಪ್ರವೇಶಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಸೀಮಿತವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಚಿತ್ರ 2E ಯ ಪ್ಯಾನಲ್ 5, Gas1-GFP ಮತ್ತು Mid2-iRFP ಕೆಲವೊಮ್ಮೆ ಒಂದೇ ERES ನಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುತ್ತವೆ, ಆದರೆ ಅವು ವಿಭಿನ್ನ ಬದಿಗಳಿಂದ ಪ್ರವೇಶಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ವಿಭಿನ್ನ COPII ಕೋಶಕಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುವ ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಪ್ರದೇಶಗಳಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರೀಕೃತವಾಗಿರುತ್ತವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. C26 ಸೆರಾಮೈಡ್-ಆಧಾರಿತ GPI-AP ಗ್ಯಾಸ್1 ಅನ್ನು ಆಯ್ದ ERES ಆಗಿ ಗಮನಿಸಿದ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆ ಮತ್ತು ವರ್ಗೀಕರಣವು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ದೃಢಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ ಏಕೆಂದರೆ ಮತ್ತೊಂದು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಸ್ರವಿಸುವ ಸರಕು, GFP-ಟ್ಯಾಗ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಮೆಂಬರೇನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ Axl2 (27), Mid2-iRFP ಗೆ ಹೋಲುವ ನಡವಳಿಕೆಯನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. (ಚಿತ್ರ S1 ಮತ್ತು ಚಲನಚಿತ್ರ S3). ಹೊಸದಾಗಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾದ Axl2-GFP ಅನ್ನು Mid2-iRFP (ಚಿತ್ರ S1, A ಮತ್ತು B) ನಂತಹ ER ಪೊರೆಯ ಮೂಲಕ ವಿತರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ERES ನಲ್ಲಿ Mid2-iRFP ನೊಂದಿಗೆ ಸಹ-ಸ್ಥಳೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ S1, B ನಿಂದ D). ಚಿತ್ರ 1 ರ ಫಲಕಗಳು 1 ಮತ್ತು 2. S1C ಎರಡು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಸರಕುಗಳು ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ ERES ನ ಎರಡು ವಿಶಿಷ್ಟ ಉದಾಹರಣೆಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, ಎರಡೂ ಸರಕುಗಳು ಒಟ್ಟಿಗೆ ERES ಅನ್ನು ಪ್ರವೇಶಿಸುತ್ತವೆ (ಚಿತ್ರ S1E, ಫಲಕ 3 ಮತ್ತು ಚಲನಚಿತ್ರ S3).
ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಸ್ ಪ್ರೇರಿತ ಸ್ರವಿಸುವಿಕೆಗಳನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ sec31-1 ಕೋಶಗಳು, Gas1-GFP (GPI-AP, ಹಸಿರು) ಮತ್ತು Mid2-iRFP (TMP, ನೀಲಿ) ಮತ್ತು Sec13-mCherry (ERES, ಮೆಜೆಂಟಾ) ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಮಾಡುವ ರಚನಾತ್ಮಕ ERES ಅನ್ನು 37 ರಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಯಿತು. °C ನಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಟ್ಟ ನಂತರ, ಸ್ರವಿಸುವಿಕೆ ಬ್ಲಾಕ್ ಅನ್ನು ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡಲು 24 °C ಗೆ ಸರಿಸಿ, ಮತ್ತು 20 ನಿಮಿಷಗಳ ನಂತರ SCLIM ನೊಂದಿಗೆ ಚಿತ್ರಿಸಿ. (A ನಿಂದ C) ಸರಕು ಮತ್ತು ERES ನಿಂದ ಗುರುತಿಸಲಾದ 10 z-ವಿಭಾಗಗಳ ಪ್ರತಿನಿಧಿ 2D ಪ್ರೊಜೆಕ್ಷನ್ ಚಿತ್ರಗಳು (A; ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 1μm) ಅಥವಾ 3D ಕೋಶ ಗೋಳಾರ್ಧದ ಚಿತ್ರಗಳು (B ಮತ್ತು C; ಸ್ಕೇಲ್ ಯೂನಿಟ್, 0.456μm). (B) ನಲ್ಲಿರುವ ಕೆಳಗಿನ ಫಲಕ ಮತ್ತು (C) ನಲ್ಲಿರುವ ಫಲಕವು ERES (ಮೆಜೆಂಟಾ) ನಲ್ಲಿ ಇರುವ ಸರಕುಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲು ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತದೆ [Gas1-GFP (ಬೂದು) ಮತ್ತು Mid2-iRFP (ತಿಳಿ ನೀಲಿ)]. (C) ತೆರೆದ ಬಾಣ: ERES ಕೇವಲ ಒಂದು ತುಂಡು ಸರಕುಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಒಯ್ಯುತ್ತದೆ (1 ರಿಂದ 4). ಬೂದು ಬಾಣ: ERES ಬೇರ್ಪಡಿಸಿದ ಸರಕುಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ (5). ಬಿಳಿ ಘನ ಬಾಣ: ಸಹ-ಸ್ಥಳೀಕೃತ ಸರಕುಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ERES. ಕೆಳಗೆ: ಆಯ್ದ ಏಕ ERES Gas1-GFP (1) ಅಥವಾ Mid2-iRFP (2) ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ. ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 100 nm. (D) (C) ನಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದ ಫೋಟೊಮೈಕ್ರೋಗ್ರಾಫ್‌ನ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ. ಕೇವಲ ಒಂದು ಸರಕು (Gas1-GFP ಅಥವಾ Mid2-iRFP), ಬೇರ್ಪಡಿಸಿದ ಸರಕು ಮತ್ತು ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ ಸರಕುಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ERES ನ ಸರಾಸರಿ ಶೇಕಡಾವಾರು. ಮೂರು ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ, 54 ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ n=432. ದೋಷ ಪಟ್ಟಿ = SD. ಎರಡು-ಬಾಲದ ಜೋಡಿಯಾಗದ t ಪರೀಕ್ಷೆ. *** P = 0.0002. (E) (C) ಎಂದು ಗುರುತಿಸಲಾದ ಕ್ವಾರಂಟೈನ್ ಮಾಡಲಾದ ಸರಕುಗಳ ಆಯ್ದ ERES ನ 3D ಚಿತ್ರ. Gas1-GFP (ಹಸಿರು) (3) ಅಥವಾ Mid2-iRFP (ನೀಲಿ) (4) ಒಂದು ಬದಿಯಿಂದ ERES (ಕೆನ್ನೇರಳೆ) ಗೆ ಪ್ರವೇಶಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ERES ಒಳಗೆ ಒಂದು ಸಣ್ಣ ಪ್ರದೇಶಕ್ಕೆ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ. ಕೆಲವೊಮ್ಮೆ, ಎರಡೂ ರೀತಿಯ ಸರಕುಗಳು ಒಂದೇ ಕಡೆಯಿಂದ ಒಂದೇ ERES (5) ಅನ್ನು ಪ್ರವೇಶಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ERES ಒಳಗೆ ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಪ್ರದೇಶಕ್ಕೆ ಸೀಮಿತವಾಗಿರುತ್ತವೆ. ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 100 nm.
ಮುಂದೆ, ER ಪೊರೆಯಲ್ಲಿರುವ ಉದ್ದವಾದ ಅಸಿಲ್ ಚೈನ್ ಸೆರಾಮೈಡ್ (C26) ಗ್ಯಾಸ್1 ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಕ್ಲಸ್ಟರಿಂಗ್ ಮತ್ತು ವಿಂಗಡಣೆಯನ್ನು ಆಯ್ದ ERES ಗೆ ಚಾಲನೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಎಂಬ ಊಹೆಯನ್ನು ನಾವು ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಈ ಉದ್ದೇಶಕ್ಕಾಗಿ, ನಾವು ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಯೀಸ್ಟ್ ಸ್ಟ್ರೈನ್ GhLag1 ಅನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದರಲ್ಲಿ ಎರಡು ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ ಸೆರಾಮೈಡ್ ಸಿಂಥೇಸ್‌ಗಳಾದ Lag1 ಮತ್ತು Lac1 ಅನ್ನು GhLag1 (ಹತ್ತಿಯ Lag1 ಹೋಮೋಲೋಗ್) ನಿಂದ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಯಿತು, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಯೀಸ್ಟ್ ಸ್ಟ್ರೈನ್ ಜೀವಕೋಶ ಪೊರೆಯ ಸೆರಾಮೈಡ್ ಸ್ಟ್ರೈನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಕಾಡು ಪ್ರಕಾರಕ್ಕಿಂತ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3A) (28). ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ (MS) ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಕಾಡು ಪ್ರಕಾರದ ತಳಿಗಳಲ್ಲಿ, ಒಟ್ಟು ಸೆರಾಮೈಡ್‌ನ 95% ಬಹಳ ಉದ್ದವಾಗಿದೆ (C26) ಸರಪಳಿ ಸೆರಾಮೈಡ್, ಆದರೆ GhLag1 ನಲ್ಲಿ, ಸೆರಾಮೈಡ್‌ನ 85% ತುಂಬಾ ಉದ್ದವಾಗಿದೆ (C18 ಮತ್ತು C16). , ಸೆರಾಮೈಡ್‌ನ ಕೇವಲ 2% ಮಾತ್ರ ಬಹಳ ಉದ್ದವಾಗಿದೆ (C26) ಸರಪಳಿ ಸೆರಾಮೈಡ್. GhLag1 ಪೊರೆಯಲ್ಲಿ C18 ಮತ್ತು C16 ಸೆರಾಮೈಡ್‌ಗಳು ಇಲ್ಲಿಯವರೆಗೆ ಪತ್ತೆಯಾದ ಮುಖ್ಯ ಸೆರಾಮೈಡ್‌ಗಳಾಗಿದ್ದರೂ, MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು GhLag1 ಸ್ಟ್ರೈನ್‌ನಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾದ Gas1-GFP ಯ GPI ಆಂಕರ್ C26 ಸೆರಾಮೈಡ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಎಂದು ದೃಢಪಡಿಸಿದೆ, ಇದು ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಬಹುದು. ಗುಣಮಟ್ಟ ಒಂದೇ ಆಗಿರುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 3A) (26). ಆದ್ದರಿಂದ, ಇದರರ್ಥ ಸೆರಾಮೈಡ್ ಮರುರೂಪಿಸುವ ಕಿಣ್ವ Cwh43 C26 ಸೆರಾಮೈಡ್‌ಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಆಯ್ದವಾಗಿದೆ, ಚಿತ್ರ 26 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ, ಇದು GhLag1 ಸ್ಟ್ರೈನ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಣ್ಣ ಪ್ರಮಾಣದ C26 ಸೆರಾಮೈಡ್‌ನಿಂದ GPI ಆಂಕರ್ ಅನ್ನು ಆದ್ಯತೆಯಾಗಿ ಸಂಯೋಜಿಸುತ್ತದೆ. S2 (29). ಆದಾಗ್ಯೂ, GhLag1 ನ ಜೀವಕೋಶ ಪೊರೆಯು ಮೂಲತಃ C18-C16 ಸೆರಾಮೈಡ್ ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ, ಆದರೆ Gas1-GFP ಇನ್ನೂ C26 ಸೆರಾಮೈಡ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ. ಈ ಅಂಶವು ಈ ಸ್ಟ್ರೈನ್ ಅನ್ನು ER ನಲ್ಲಿ ಮೆಂಬರೇನ್ ಸೆರಾಮೈಡ್‌ನ ಅಸಿಲ್ ಸರಪಳಿ ಉದ್ದದ ಸಮಸ್ಯೆಯನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಪರಿಹರಿಸಲು ಆದರ್ಶ ಸಾಧನವನ್ನಾಗಿ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ವರ್ಗ ಮತ್ತು ವಿಂಗಡಣೆಯ ಕಾಲ್ಪನಿಕ ಪಾತ್ರ. ನಂತರ, ನಾವು ಮೊದಲು ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿಯ ಮೂಲಕ Sec31-1 ರ ತಾಪಮಾನ-ಸೂಕ್ಷ್ಮ ರೂಪಾಂತರಿತ ಆಲೀಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ GhLag1 ನಲ್ಲಿ ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಗೊಳ್ಳುವ C26 Gas1-GFP ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ, ಅಲ್ಲಿ ER ಮೆಂಬರೇನ್ ಸೆರಾಮೈಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಉದ್ದವಾದ (C18-C16) ಸರಪಳಿ ಮಾತ್ರ ಅಸ್ತಿತ್ವದಲ್ಲಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3). sec31-1 ರಲ್ಲಿ, ಹೆಚ್ಚಿನ Gas1-GFP ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರೀಕೃತವಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಆದರೆ sec31-1 ರಲ್ಲಿ Gas1-GFP ಉದ್ದವಾದ (C18-C16) ಉದ್ದವಾದ ಸೆರಾಮೈಡ್ ER ಮೆಂಬರೇನ್‌ನೊಂದಿಗೆ Gas1-GFP ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಸಂಪೂರ್ಣ ER ಮೆಂಬರೇನ್‌ನಲ್ಲಿ ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಗಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ವಿತರಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ. ನಿಖರವಾಗಿ ಹೇಳಬೇಕೆಂದರೆ, C26 ಸೆರಾಮೈಡ್-ಆಧಾರಿತ ಕ್ಲಸ್ಟರಿಂಗ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ERES ಗೆ ನಿಕಟ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿರುವುದರಿಂದ (ಚಿತ್ರ 1), ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ER ರಫ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನದ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಸಹ ಒಳಗೊಳ್ಳಬಹುದೇ ಎಂದು ನಾವು ಮುಂದೆ ತನಿಖೆ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ. GPI-AP ER ರಫ್ತಿಗಾಗಿ ವಿಶೇಷ COPII ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ, ಇದು GPI ಆಂಕರ್‌ನ ಗ್ಲೈಕನ್ ಭಾಗದ Ted1 ನ ರಚನಾತ್ಮಕ ಮರುರೂಪಿಸುವಿಕೆಯಿಂದ ಸಕ್ರಿಯವಾಗಿ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲ್ಪಡುತ್ತದೆ (30, 31). ನಂತರ ಮರುಸಂಯೋಜಿತ GPI-ಗ್ಲೈಕಾನ್ ಅನ್ನು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಕಾರ್ಗೋ ರಿಸೆಪ್ಟರ್ p24 ಸಂಕೀರ್ಣವು ಗುರುತಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಪ್ರಮುಖ COPII ಕಾರ್ಗೋ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಉಪಘಟಕ Sec24 ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಐಸೋಫಾರ್ಮ್ ಆಗಿರುವ Lst1 ಅನ್ನು ಆಯ್ದವಾಗಿ ನೇಮಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ, ಇದು GPI-AP-ಭರಿತ COPII ಕೋಶಕಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ (31-33). ಆದ್ದರಿಂದ, ಈ ಏಕ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಅಳಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು (p24 ಸಂಕೀರ್ಣ ಘಟಕ Emp24, GPI-ಗ್ಲೈಕಾನ್ ಮರುರೂಪಿಸುವ ಕಿಣ್ವ Ted1 ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ COPII ಉಪಘಟಕ Lst1) sec31-1 ರೂಪಾಂತರಿತ ತಳಿಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸುವ ಡಬಲ್ ರೂಪಾಂತರವನ್ನು ನಾವು ನಿರ್ಮಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಅವುಗಳನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ Gas1-ಕ್ಲಸ್ಟರ್ GFP ಅನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವೇ (ಚಿತ್ರ 3). sec31-1emp24Δ ಮತ್ತು sec31-1ted1Δ ನಲ್ಲಿ, Gas1-GFP ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಅನ್‌ಕ್ಲಸ್ಟರ್ಡ್ ಆಗಿದ್ದು ER ಪೊರೆಯಾದ್ಯಂತ ವಿತರಿಸಲ್ಪಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಈ ಹಿಂದೆ sec31-1 GhLag1 ನಲ್ಲಿ ನೋಡಿದಂತೆ, sec31-1lst1Δ ನಲ್ಲಿ, Gas1-GFP sec31-1 ನಂತೆ. ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ER ಪೊರೆಯಲ್ಲಿ C26 ಸೆರಾಮೈಡ್ ಇರುವುದರ ಜೊತೆಗೆ, Gas1-GFP ಯ ಕ್ಲಸ್ಟರಿಂಗ್ p24 ಸಂಕೀರ್ಣಕ್ಕೆ ಬಂಧಿಸುವ ಅಗತ್ಯವಿದೆ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ Lst1 ನೇಮಕಾತಿ ಅಗತ್ಯವಿರುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ನಂತರ, ER ಪೊರೆಯಲ್ಲಿನ ಸೆರಾಮೈಡ್‌ನ ಸರಪಳಿ ಉದ್ದವು Gas1-GFP ಯ p24 ಗೆ ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ನಾವು ಅನ್ವೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಪೊರೆಯಲ್ಲಿ C18-C16 ಸೆರಾಮೈಡ್ ಇರುವಿಕೆಯು p24 ಸಂಕೀರ್ಣದಿಂದ ಪುನರ್ನಿರ್ಮಿಸಲಾದ GPI-ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗಳ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರಗಳು S3 ಮತ್ತು S4, A ಮತ್ತು B) ಅಥವಾ GPI-AP ಗೆ ಬಂಧಿಸುವುದು ಮತ್ತು GPI-AP ಅನ್ನು ರಫ್ತು ಮಾಡುವುದು. ಸಾಮರ್ಥ್ಯ. ನೇಮಕಾತಿ COPII ಉಪವಿಭಾಗ Lst1 (ಚಿತ್ರ S4C). ಆದ್ದರಿಂದ, C26 ಸೆರಾಮೈಡ್-ಅವಲಂಬಿತ ಕ್ಲಸ್ಟರಿಂಗ್‌ಗೆ ವಿಭಿನ್ನ ER ರಫ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳೊಂದಿಗೆ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂವಹನಗಳ ಅಗತ್ಯವಿರುವುದಿಲ್ಲ, ಆದರೆ ಲಿಪಿಡ್ ಉದ್ದದಿಂದ ನಡೆಸಲ್ಪಡುವ ಪರ್ಯಾಯ ವಿಂಗಡಣೆ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತದೆ. ನಂತರ, ER ಪೊರೆಯಲ್ಲಿನ ಸೆರಾಮೈಡ್ ಅಸಿಲ್ ಸರಪಳಿ ಉದ್ದವು ಆಯ್ದ ERES ಆಗಿ Gas1-GFP ಯ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ವರ್ಗೀಕರಣಕ್ಕೆ ಮುಖ್ಯವೇ ಎಂದು ನಾವು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಶಾರ್ಟ್-ಚೈನ್ ಸೆರಾಮೈಡ್ ಹೊಂದಿರುವ GhLag1 ಸ್ಟ್ರೈನ್‌ನಲ್ಲಿರುವ Gas1, ER ಅನ್ನು ಬಿಟ್ಟು ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಮೆಂಬರೇನ್‌ಗೆ ಪ್ರವೇಶಿಸುವುದರಿಂದ (ಚಿತ್ರ S5), ಸೆರಾಮೈಡ್ ಅಸಿಲ್ ಸರಪಳಿಯ ಉದ್ದದಿಂದ ವಿಂಗಡಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಿದರೆ, GhLag1 ಸ್ಟ್ರೈನ್‌ನಲ್ಲಿರುವ Gas1 ಅನ್ನು ಮರುನಿರ್ದೇಶಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ದಾಟಬಹುದು ಎಂದು ನಾವು ನಂಬುತ್ತೇವೆ. ಅದೇ ಮೆಂಬರೇನ್ ಹೊಂದಿರುವ ERES ಸರಕುಗಳು.
(A) GhLag1 ನ ಜೀವಕೋಶ ಪೊರೆಯು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಚಿಕ್ಕದಾದ C18-C16 ಸೆರಾಮೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ, ಆದರೆ Gas1-GFP ನ GPI ಆಂಕರ್ ಇನ್ನೂ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಕೋಶಗಳಂತೆಯೇ C26 IPC ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ. ಮೇಲೆ: ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ (Wt) ಮತ್ತು GhLag1p ತಳಿಗಳ ಜೀವಕೋಶ ಪೊರೆಯಲ್ಲಿ ಸೆರಾಮೈಡ್‌ನ ಅಸಿಲ್ ಸರಪಳಿ ಉದ್ದದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ (MS) ಮೂಲಕ. ಡೇಟಾವು ಒಟ್ಟು ಸೆರಾಮೈಡ್‌ನ ಶೇಕಡಾವಾರು ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. ಮೂರು ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಸರಾಸರಿ. ದೋಷ ಪಟ್ಟಿ = SD. ಎರಡು-ಬಾಲದ ಜೋಡಿಯಾಗದ ಟಿ ಪರೀಕ್ಷೆ. **** P ＜0.0001. ಕೆಳಗಿನ ಫಲಕ: ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಮತ್ತು GhLag1p ತಳಿಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾದ Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI ಆಂಕರ್‌ನಲ್ಲಿ ಇರುವ IPC ಯ ಅಸಿಲ್ ಸರಪಳಿ ಉದ್ದದ MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. ಡೇಟಾವು ಒಟ್ಟು IPC ಸಿಗ್ನಲ್‌ನ ಶೇಕಡಾವಾರು ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. ಐದು ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಸರಾಸರಿ. ದೋಷ ಪಟ್ಟಿ = SD. ಎರಡು-ಬಾಲದ ಜೋಡಿಯಾಗದ ಟಿ ಪರೀಕ್ಷೆ. ns, ಮುಖ್ಯವಲ್ಲ. P = 0.9134. (B) ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಸ್-ಪ್ರೇರಿತ Gas1-GFP ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ ಮತ್ತು sec31-1lst1Δ ಕೋಶಗಳ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕಗಳನ್ನು 37°C ನಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 24°C ನಂತರ ನಿಯಮಿತ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕವನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ರವಾನಿಸಲಾಯಿತು. ಬಿಳಿ ಬಾಣ: ER Gas1-GFP ಕ್ಲಸ್ಟರ್. ತೆರೆದ ಬಾಣ: ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಮಾಡದ ಗ್ಯಾಸ್1-GFP ಅನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣ ER ಪೊರೆಯ ಮೇಲೆ ವಿತರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ER ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ರಿಂಗ್ ಸ್ಟೇನಿಂಗ್ ಅನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 5μm. (C) (B) ನಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದ ಫೋಟೊಮೈಕ್ರೋಗ್ರಾಫ್‌ನ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ. ಪಂಕ್ಟೇಟ್ Gas1-GFP ರಚನೆಯೊಂದಿಗೆ ಜೀವಕೋಶಗಳ ಸರಾಸರಿ ಶೇಕಡಾವಾರು. ಮೂರು ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ, n≥300 ಕೋಶಗಳು. ದೋಷ ಪಟ್ಟಿ = SD. ಎರಡು-ಬಾಲದ ಜೋಡಿಯಾಗದ t ಪರೀಕ್ಷೆ. **** P ＜0.0001.
ಈ ಸಮಸ್ಯೆಯನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ಪರಿಹರಿಸಲು, ನಾವು sec31-1 ತಾಪಮಾನ-ಸೂಕ್ಷ್ಮ ರೂಪಾಂತರಿತ ಆಲೀಲ್ (ಚಿತ್ರ 4 ಮತ್ತು ಚಲನಚಿತ್ರ S4) ಬಳಸಿ GhLag1 ನಲ್ಲಿ Gas1-GFP ಮತ್ತು Mid2-iRFP ಯ SCLIM ದೃಶ್ಯೀಕರಣವನ್ನು ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ. ER ಅನ್ನು 37°C ನಲ್ಲಿ ಉಳಿಸಿಕೊಂಡು ನಂತರ 24°C ನಲ್ಲಿ ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡಿದ ನಂತರ, ಹೊಸದಾಗಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾದ Gas1-GFP ಯ ಹೆಚ್ಚಿನ ಭಾಗವನ್ನು ER ಪೊರೆಯಾದ್ಯಂತ ಗುಂಪು ಮಾಡಲಾಗಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ವಿತರಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ, ಇದನ್ನು ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕಗಳು ಗಮನಿಸಿದಂತೆ (ಚಿತ್ರ 4, A ಮತ್ತು B). ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ಹೆಚ್ಚಿನ ಶೇಕಡಾವಾರು ERES (67%) ಎರಡು ರೀತಿಯ ಸರಕುಗಳನ್ನು ಸಹ-ಸ್ಥಳೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 4D). ಚಿತ್ರ 4C ಯ 1 ಮತ್ತು 2 ಫಲಕಗಳು ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ Gas1-GFP ಮತ್ತು Mid2-GFP ಯೊಂದಿಗೆ ERES ನ ಎರಡು ವಿಶಿಷ್ಟ ಉದಾಹರಣೆಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ. ಇದಲ್ಲದೆ, ಎರಡೂ ಸರಕುಗಳನ್ನು ಒಂದೇ ERES ಗೆ ಸೇರಿಸಿಕೊಳ್ಳಲಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 4E, ಫಲಕ 3 ಮತ್ತು ಚಲನಚಿತ್ರ S4). ಆದ್ದರಿಂದ, ER ಪೊರೆಯಲ್ಲಿನ ಸೆರಾಮೈಡ್ ಅಸಿಲ್ ಸರಪಳಿಯ ಉದ್ದವು ER ಪ್ರೋಟೀನ್ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ವರ್ಗೀಕರಣದ ಪ್ರಮುಖ ನಿರ್ಣಾಯಕವಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಮ್ಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.
ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಸ್-ಪ್ರೇರಿತ ಸ್ರವಿಸುವಿಕೆಗಳನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ Sec31-1 GhLag1 ಕೋಶಗಳು, Gas1-GFP (GPI-AP, ಹಸಿರು) ಮತ್ತು Mid2-iRFP (TMP, ನೀಲಿ) ಮತ್ತು ರಚನಾತ್ಮಕ ERES-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ Sec13-mCherry (ERES, ಮೆಜೆಂಟಾ) 37°C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡುತ್ತವೆ. 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಮುಂದುವರಿಸಿ, ಸ್ರವಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡಲು 24°C ಗೆ ಇಳಿಸಿ ಮತ್ತು 20 ನಿಮಿಷಗಳ ನಂತರ SCLIM ನೊಂದಿಗೆ ಚಿತ್ರಿಸಿ. (A ನಿಂದ C) ಸರಕು ಮತ್ತು ERES ನಿಂದ ಗುರುತಿಸಲಾದ 10 z-ವಿಭಾಗಗಳ ಪ್ರತಿನಿಧಿ 2D ಪ್ರೊಜೆಕ್ಷನ್ ಚಿತ್ರಗಳು (A; ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 1μm) ಅಥವಾ 3D ಕೋಶ ಗೋಳಾರ್ಧದ ಚಿತ್ರಗಳು (B ಮತ್ತು C; ಸ್ಕೇಲ್ ಯೂನಿಟ್, 0.45μm). (B) ನಲ್ಲಿರುವ ಕೆಳಗಿನ ಫಲಕ ಮತ್ತು (C) ನಲ್ಲಿರುವ ಫಲಕವು ERES (ಮೆಜೆಂಟಾ) [Gas1-GFP (ಬೂದು) ಮತ್ತು Mid2-iRFP (ತಿಳಿ ನೀಲಿ)] ನಲ್ಲಿ ಇರುವ ಸರಕುಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲು ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತದೆ. (C) ಬಿಳಿ ತುಂಬಿದ ಬಾಣ: ERES, ಸರಕುಗಳು ಅತಿಕ್ರಮಿಸುತ್ತವೆ. ತೆರೆದ ಬಾಣ: ERES ಕೇವಲ ಒಂದು ಐಟಂ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ. ಕೆಳಗಿನ ಫಲಕ: ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿದ ERES ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ ಸರಕುಗಳನ್ನು (1 ಮತ್ತು 2) (C) ನಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 100 nm. (D) (C) ನಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದ ಫೋಟೊಮೈಕ್ರೋಗ್ರಾಫ್‌ನ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣ. sec31-1 ಮತ್ತು sec31-1 GhLag1 ಘಟಕಗಳಲ್ಲಿ, ಕೇವಲ ಒಂದು ಸರಕು (Gas1-GFP ಅಥವಾ Mid2-iRFP) ಸೇರಿಸಲಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಸರಕು ಮತ್ತು ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ ಸರಕುಗಳಿಗೆ ERES ನ ಸರಾಸರಿ ಶೇಕಡಾವಾರು. ಮೂರು ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ, 54 ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ n = 432 (sec31-1) ಮತ್ತು 47 ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ n = 430 (sec31-1 GhLag1). ದೋಷ ಪಟ್ಟಿ = SD. ಎರಡು-ಬಾಲದ ಜೋಡಿಯಾಗದ t ಪರೀಕ್ಷೆ. *** P = 0.0002 (sec31-1) ಮತ್ತು ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) (C) ನಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ ಸರಕು (3) ಹೊಂದಿರುವ ಆಯ್ದ ERES ನ 3D ಚಿತ್ರ. Gas1-GFP (ಹಸಿರು) ಮತ್ತು Mid2-iRFP (ನೀಲಿ) ಒಂದೇ ಬದಿಯಿಂದ ERES (ಕೆನ್ನೇರಳೆ ಬಣ್ಣ) ಸಮೀಪಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಅದೇ ERES ನಿರ್ಬಂಧಿತ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಉಳಿಯುತ್ತವೆ. ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್, 100 nm.
ಈ ಅಧ್ಯಯನವು ಲಿಪಿಡ್-ಆಧಾರಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸರಕುಗಳನ್ನು ಸ್ರವಿಸುವ ಮಾರ್ಗದಲ್ಲಿ ಆಯ್ದ ರಫ್ತು ತಾಣಗಳಾಗಿ ವರ್ಗೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂಬುದಕ್ಕೆ ನೇರ ಇನ್ ವಿವೋ ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ವರ್ಗೀಕರಣ ಆಯ್ಕೆಗಾಗಿ ಅಸಿಲ್ ಸರಪಳಿ ಉದ್ದದ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸುತ್ತದೆ. SCLIM ಎಂಬ ಶಕ್ತಿಶಾಲಿ ಮತ್ತು ಅತ್ಯಾಧುನಿಕ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕ ತಂತ್ರವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, ನಾವು ಯೀಸ್ಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೊಸದಾಗಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾದ ಗ್ಯಾಸ್1-GFP (ಬಹಳ ಉದ್ದವಾದ ಅಸಿಲ್ ಸರಪಳಿ (C26) ಸೆರಾಮೈಡ್ ಲಿಪಿಡ್ ಭಾಗವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಪ್ರಮುಖ ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಮೆಂಬರೇನ್ GPI-AP) ಅನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಡಿಸ್ಕ್ರೀಟ್ ER ಗಳಲ್ಲಿ ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರದೇಶಗಳು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ERES ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿವೆ, ಆದರೆ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಸ್ರವಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ER ಮೆಂಬರೇನ್‌ನಾದ್ಯಂತ ವಿತರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 1). ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಈ ಎರಡು ರೀತಿಯ ಸರಕುಗಳು ವಿಭಿನ್ನ ERES ಅನ್ನು ಆಯ್ದವಾಗಿ ಪ್ರವೇಶಿಸುತ್ತವೆ (ಚಿತ್ರ 2). ಪೊರೆಯಲ್ಲಿನ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಸೆರಾಮೈಡ್‌ನ ಅಸಿಲ್ ಸರಪಳಿಯ ಉದ್ದವನ್ನು C26 ರಿಂದ C18-C16 ಗೆ ಇಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಗ್ಯಾಸ್1-GFP ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಅನ್ನು ಡಿಸ್ಕ್ರೀಟ್ ER ಪ್ರದೇಶಕ್ಕೆ ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅದೇ ERES ಮೂಲಕ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ER ಅನ್ನು ಬಿಡಲು Gas1-GFP ಅನ್ನು ಮರುಮಾರ್ಗೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 3 ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ 3). 4).
ER ನಿಂದ ನಿರ್ಗಮಿಸಲು GPI-AP ವಿಶೇಷ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸುತ್ತಿದ್ದರೂ, C26 ಸೆರಾಮೈಡ್-ಅವಲಂಬಿತ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆಯು ERES ವಿಶೇಷತೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುವ ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂವಹನಗಳನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿಲ್ಲ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರಗಳು S4 ಮತ್ತು S5). ಬದಲಾಗಿ, ನಮ್ಮ ಸಂಶೋಧನೆಗಳು ಲಿಪಿಡ್-ಆಧಾರಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕ್ಲಸ್ಟರಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಇತರ ಸರಕುಗಳ ನಂತರದ ಹೊರಗಿಡುವಿಕೆಯಿಂದ ನಡೆಸಲ್ಪಡುವ ಪರ್ಯಾಯ ವರ್ಗೀಕರಣ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತವೆ. ನಮ್ಮ ಅವಲೋಕನಗಳು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ERES ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ Gas1-GFP ಪ್ರದೇಶ ಅಥವಾ ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಸ್ರವಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್ Mid2-iRFP ಅನ್ನು ಹೊಂದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ, ಇದು C26 ಸೆರಾಮೈಡ್-ಅವಲಂಬಿತ GPI-AP ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಸಂಬಂಧಿತ ERES ಗೆ ಪ್ರವೇಶವನ್ನು ಸುಗಮಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಅನ್ನು ಹೊರಗಿಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಸ್ರವಿಸುವಿಕೆಯು ಈ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ERES ಅನ್ನು ಪ್ರವೇಶಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರಗಳು 1 ಮತ್ತು 2). ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, ER ಪೊರೆಯಲ್ಲಿ C18-C16 ಸೆರಾಮೈಡ್‌ಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯು GPI-AP ಪ್ರದೇಶಗಳು ಅಥವಾ ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಕಾರಣವಾಗುವುದಿಲ್ಲ, ಆದ್ದರಿಂದ ಅವು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಸ್ರವಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಅದೇ ERES ಗೆ ಹೊರಗಿಡುವುದಿಲ್ಲ ಅಥವಾ ಬದಲಾಯಿಸುವುದಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರಗಳು 3 ಮತ್ತು 4). . ಆದ್ದರಿಂದ, ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ERES ಗೆ ಲಿಂಕ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಕ್ಲಸ್ಟರಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಸುಗಮಗೊಳಿಸುವ ಮೂಲಕ C26 ಸೆರಾಮೈಡ್ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆ ಮತ್ತು ವರ್ಗೀಕರಣವನ್ನು ಚಾಲನೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸುತ್ತೇವೆ.
ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ER ಪ್ರದೇಶಕ್ಕೆ ಈ C26 ಸೆರಾಮೈಡ್-ಅವಲಂಬಿತ ಕ್ಲಸ್ಟರಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಹೇಗೆ ಸಾಧಿಸುವುದು? ಪೊರೆಯ ಸೆರಾಮೈಡ್ ಪಾರ್ಶ್ವವಾಗಿ ಬೇರ್ಪಡುವ ಪ್ರವೃತ್ತಿಯು GPI-AP ಮತ್ತು C26 ಸೆರಾಮೈಡ್‌ಗಳು ಚಿಕ್ಕದಾದ ಮತ್ತು ಅಪರ್ಯಾಪ್ತ ಗ್ಲಿಸರೊಲಿಪಿಡ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ER ಪೊರೆಯ ಹೆಚ್ಚು ಅನಿಯಮಿತ ಲಿಪಿಡ್ ಪರಿಸರದಲ್ಲಿ ಸಣ್ಣ ಮತ್ತು ತಕ್ಷಣವೇ ಆದೇಶಿಸಲಾದ ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು. ಗುಣಮಟ್ಟದ ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗಳು (17, 18). ಈ ಸಣ್ಣ ತಾತ್ಕಾಲಿಕ ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗಳನ್ನು p24 ಸಂಕೀರ್ಣಕ್ಕೆ ಬಂಧಿಸಿದ ನಂತರ ದೊಡ್ಡದಾದ, ಹೆಚ್ಚು ಸ್ಥಿರವಾದ ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗಳಾಗಿ ಮತ್ತಷ್ಟು ಬೆಸೆಯಬಹುದು (34). ಇದಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, ದೊಡ್ಡ ಗೋಚರ ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸಲು C26 Gas1-GFP p24 ಸಂಕೀರ್ಣದೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸಬೇಕು ಎಂದು ನಾವು ತೋರಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 3). p24 ಸಂಕೀರ್ಣವು ಯೀಸ್ಟ್‌ನಲ್ಲಿ ನಾಲ್ಕು ವಿಭಿನ್ನ p24 ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಂದ ಕೂಡಿದ ಹೆಟೆರೊಜೈಗಸ್ ಆಲಿಗೋಮರ್ ಆಗಿದೆ (35), ಇದು ಬಹುವೇಲೆಂಟ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಸಣ್ಣ GPI-AP ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗಳ ಅಡ್ಡ-ಲಿಂಕ್‌ಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು, ಇದರಿಂದಾಗಿ ದೊಡ್ಡ ಸ್ಥಿರ ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ (34). GPI-AP ಗಳ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಎಕ್ಟೋಡೊಮೈನ್‌ಗಳ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯು ಅವುಗಳ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಗೆ ಕೊಡುಗೆ ನೀಡಬಹುದು, ಇದನ್ನು ಸಸ್ತನಿಗಳ ಧ್ರುವೀಕೃತ ಎಪಿಥೀಲಿಯಲ್ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಅವುಗಳ ಗಾಲ್ಗಿ ಸಾಗಣೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ (36). ಆದಾಗ್ಯೂ, C18-C16 ಸೆರಾಮೈಡ್ ER ಪೊರೆಯಲ್ಲಿ ಇರುವಾಗ, p24 ಸಂಕೀರ್ಣವು Gas1-GFP ಗೆ ಬಂಧಿಸಿದಾಗ, ದೊಡ್ಡ ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಸಮೂಹಗಳು ರೂಪುಗೊಳ್ಳುವುದಿಲ್ಲ. ಆಧಾರವಾಗಿರುವ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವು ಉದ್ದವಾದ ಅಸಿಲ್ ಸರಪಳಿ ಸೆರಾಮೈಡ್‌ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಭೌತಿಕ ಮತ್ತು ರಾಸಾಯನಿಕ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿರಬಹುದು. ಕೃತಕ ಪೊರೆಗಳ ಜೈವಿಕ ಭೌತಿಕ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಉದ್ದವಾದ (C24) ಮತ್ತು ಸಣ್ಣ (C18-C16) ಅಸಿಲ್ ಸರಪಳಿ ಸೆರಾಮೈಡ್‌ಗಳು ಹಂತ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು, ಉದ್ದವಾದ ಅಸಿಲ್ ಸರಪಳಿ ಸೆರಾಮೈಡ್‌ಗಳು (C24) ಮಾತ್ರ ಹೆಚ್ಚಿನ ವಕ್ರತೆ ಮತ್ತು ಫಿಲ್ಮ್ ಬಾಗುವಿಕೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಬಹುದು ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ. ಪರಸ್ಪರ ಉಲ್ಲೇಖದ ಮೂಲಕ (17, 37, 38). Emp24 ನ ಮಾನವ ಹೋಮೋಲೋಗ್ ಆಗಿರುವ TMED2 ನ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಹೆಲಿಕ್ಸ್, ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ಲೋಬ್ಯೂಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ C18 ಸೆರಾಮೈಡ್-ಆಧಾರಿತ ಸ್ಫಿಂಗೊಮೈಲಿನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಆಯ್ದವಾಗಿ ಸಂವಹನ ನಡೆಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ (39). ಆಣ್ವಿಕ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ (MD) ಸಿಮ್ಯುಲೇಶನ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, C18 ಮತ್ತು C26 ಸೆರಾಮೈಡ್‌ಗಳು Emp24 ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಹೆಲಿಕ್ಸ್‌ನ ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ಲೋಬ್ಯೂಲ್‌ಗಳ ಸುತ್ತಲೂ ಸಂಗ್ರಹಗೊಳ್ಳುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಅವು ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಆದ್ಯತೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ S6). Emp24 ನ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಹೆಲಿಕ್ಸ್ ಪೊರೆಯಲ್ಲಿ ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳ ಅಸಮಪಾರ್ಶ್ವದ ವಿತರಣೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು ಎಂದು ಇದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಗಮನಿಸಬೇಕಾದ ಸಂಗತಿ. ಇದು ಸಸ್ತನಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಆಧರಿಸಿದ ಇತ್ತೀಚಿನ ಫಲಿತಾಂಶವಾಗಿದೆ. ಇದೇ ರೀತಿಯ MD ಸಿಮ್ಯುಲೇಶನ್‌ಗಳು ಈಥರ್ ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಸಹ ತೋರಿಸುತ್ತವೆ (40). ಆದ್ದರಿಂದ, ER26 ನ ಎರಡು ಲೋಬ್ಯೂಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ C26 ಸೆರಾಮೈಡ್ ಸ್ಥಳೀಯವಾಗಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಊಹಿಸುತ್ತೇವೆ. ಲುಮಿನಲ್ ಲೋಬ್ಯೂಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿನ GPI-AP ನೇರವಾಗಿ ಮಲ್ಟಿವೇಲೆಂಟ್ p24 ಗೆ ಬಂಧಿಸಿದಾಗ ಮತ್ತು ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ಲೋಬ್ಯೂಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ p24 ಸುತ್ತಲೂ C26 ಸೆರಾಮೈಡ್ ಸಂಗ್ರಹವಾದಾಗ, ಅದು ಜೊತೆಯಲ್ಲಿರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪೊರೆಯ ವಕ್ರತೆಯು ಬೆರಳುಗಳ ಮೂಲಕ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುತ್ತದೆ (41), GPI-AP ERES ಪಕ್ಕದಲ್ಲಿರುವ ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಪ್ರದೇಶಗಳಾಗಿ ಬೇರ್ಪಡಲು ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ER ಪೊರೆಯ ಹೆಚ್ಚು ಬಾಗಿದ ಪ್ರದೇಶಗಳಿಗೆ ಅನುಕೂಲಕರವಾಗಿದೆ (42). ಹಿಂದಿನ ವರದಿಗಳು ಪ್ರಸ್ತಾವಿತ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸಿದವು (43, 44). ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಪೊರೆಯ ಮೇಲೆ ಸೆರಾಮೈಡ್-ಆಧಾರಿತ ಗ್ಲೈಕೋಸ್ಫಿಂಗೋಲಿಪಿಡ್‌ಗಳಿಗೆ (GSL) ಆಲಿಗೋಲೆಕ್ಟಿನ್‌ಗಳು, ರೋಗಕಾರಕಗಳು ಅಥವಾ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಮಲ್ಟಿವೇಲೆಂಟ್ ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಯು ದೊಡ್ಡ GSL ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸುತ್ತದೆ, ಹಂತ ವಿಭಜನೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪೊರೆಯ ವಿರೂಪ ಮತ್ತು ಆಂತರಿಕೀಕರಣವನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುತ್ತದೆ (44). ಇವಾಬುಚಿ ಇತ್ಯಾದಿ. (43) ಉದ್ದವಾದ (C24) ಆದರೆ ಚಿಕ್ಕದಲ್ಲದ (C16) ಅಸಿಲ್ ಸರಪಳಿಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ, GSL ಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸಿಲ್ಸೆರಮೈಡ್‌ಗೆ ಬದ್ಧವಾಗಿರುವ ಮಲ್ಟಿವೇಲೆಂಟ್ ಲಿಗಂಡ್ ದೊಡ್ಡ ಸಮೂಹಗಳ ರಚನೆ ಮತ್ತು ಪೊರೆಯ ಆಕ್ರಮಣವನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಎಲೆಗಳ ಮೇಲಿನ ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸಂ ಲಿನ್-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ಸಿಗ್ನಲ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಡಕ್ಷನ್ ಅನ್ನು ಜೋಡಿಸಲಾದ ನ್ಯೂಟ್ರೋಫಿಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಅಸಿಲ್ ಸರಪಳಿಗಳಿಂದ ಇಂಟರ್ಡಿಜಿಟೇಟ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ಕಂಡುಬಂದಿದೆ.
ಸಸ್ತನಿಗಳ ಧ್ರುವೀಕೃತ ಎಪಿಥೀಲಿಯಲ್ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ, ಆಂಟಿ-ಗಾಲ್ಗಿ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್ (TGN) ನ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಅಪಿಕಲ್ ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಪೊರೆಯ ಮಟ್ಟಕ್ಕೆ GPI-AP ನ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ ಮತ್ತು ವಿಂಗಡಣೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ (10, 45). ಈ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು GPI-AP ಆಲಿಗೋಮೆರೈಸೇಶನ್ (36) ನಿಂದ ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಇದು ಯೀಸ್ಟ್‌ನಲ್ಲಿ ನಾವು ಕಂಡುಕೊಳ್ಳುವ ಸೆರಾಮೈಡ್ ಸರಪಳಿಯ ಉದ್ದವನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿರಬಹುದು. ಸಸ್ತನಿಗಳ GPI-AP ಈಥರ್ ಲಿಪಿಡ್-ಆಧಾರಿತ ಆಂಕರ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದರೂ, ಮತ್ತು ಅದರ ರಾಸಾಯನಿಕ ರಚನೆಯು ಬಹಳ ಉದ್ದವಾದ ಅಸಿಲ್ ಸರಪಳಿ ಸೆರಾಮೈಡ್‌ಗಿಂತ ಬಹಳ ಭಿನ್ನವಾಗಿದೆ, ಇತ್ತೀಚಿನ ಅಧ್ಯಯನವು ಎರಡೂ ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳು ವಿಕಸನೀಯವಾಗಿ ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಭೌತಿಕ ಮತ್ತು ರಾಸಾಯನಿಕ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ಕಂಡುಹಿಡಿದಿದೆ (40). ಆದ್ದರಿಂದ, ಸಸ್ತನಿ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿನ ಈಥರ್ ಲಿಪಿಡ್ ಭಾಗವು ಯೀಸ್ಟ್‌ನಲ್ಲಿರುವ C26 ಸೆರಾಮೈಡ್‌ಗೆ ಹೋಲುತ್ತದೆ ಮತ್ತು GPI-AP ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ವಿಂಗಡಣೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಲು ಪೊರೆಯಲ್ಲಿನ ದೀರ್ಘ-ಸರಪಳಿ ಸೆರಾಮೈಡ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸುವುದು ಇದರ ಪಾತ್ರವಾಗಿದೆ. ಈ ಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ಇನ್ನೂ ನೇರವಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಬೇಕಾಗಿದ್ದರೂ, ಹಿಂದಿನ ಸಂಶೋಧನೆಗಳು ಗಾಲ್ಗಿ ದೇಹಕ್ಕೆ ಉದ್ದವಾದ ಅಸಿಲ್ ಸರಪಳಿ ಸೆರಾಮೈಡ್‌ನ ಸಾಗಣೆಯನ್ನು ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸ್ಮಿಕ್ ವರ್ಗಾವಣೆ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಂದ ನಡೆಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ, ಆದರೆ ಯೀಸ್ಟ್‌ನಂತಹ GPI ಆಂಕರ್‌ಗಳ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿರುತ್ತದೆ ಎಂದು ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತವೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ವಿಕಸನೀಯ ಸಂಪ್ರದಾಯವಾದಿ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವು ಒಂದೇ ಸಾರಿಗೆ ಕೋಶದಲ್ಲಿ ಬಹಳ ಉದ್ದವಾದ ಅಸಿಲ್ ಸರಪಳಿ ಸೆರಾಮೈಡ್ ಮತ್ತು GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ಅನ್ನು ಆಯ್ದವಾಗಿ ಸಹ-ಸಾಗಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರುತ್ತದೆ.
ಯೀಸ್ಟ್ ಮತ್ತು ಸಸ್ತನಿಗಳ ಧ್ರುವೀಕೃತ ಎಪಿಥೀಲಿಯಲ್ ಕೋಶ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳಲ್ಲಿ, GPI-AP ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಇತರ ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಮೆಂಬರೇನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಂದ ಬೇರ್ಪಡುವಿಕೆ ಎಲ್ಲವೂ ಜೀವಕೋಶದ ಮೇಲ್ಮೈಯನ್ನು ತಲುಪುವ ಮೊದಲು ಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ. ಪಲಾಡಿನೊ ಮತ್ತು ಇತರರು (48) ಸಸ್ತನಿಗಳ ಧ್ರುವೀಕೃತ ಎಪಿಥೀಲಿಯಲ್ ಕೋಶಗಳ TGN ನಲ್ಲಿ, GPI-AP ಕ್ಲಸ್ಟರಿಂಗ್ GPI-AP ಗಳನ್ನು ಅಪಿಕಲ್ ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಮೆಂಬರೇನ್‌ಗೆ ಆಯ್ದ ವರ್ಗೀಕರಣಕ್ಕೆ ಮಾತ್ರವಲ್ಲದೆ, GPI-AP ಗಳ ಕ್ಲಸ್ಟರಿಂಗ್ ಸಂಘಟನೆ ಮತ್ತು ಅದರ ಜೈವಿಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಕಂಡುಹಿಡಿದಿದ್ದಾರೆ. ಜೀವಕೋಶದ ಮೇಲ್ಮೈ. ಯೀಸ್ಟ್‌ನಲ್ಲಿ, ಈ ಅಧ್ಯಯನವು ER ನಲ್ಲಿರುವ C26 ಸೆರಾಮೈಡ್-ಅವಲಂಬಿತ GPI-AP ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಮೆಂಬರೇನ್‌ನಲ್ಲಿ GPI-AP ಯ ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಸಂಘಟನೆ ಮತ್ತು ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಬಹುದು ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (24, 49). ಈ ಮಾದರಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, GhLag1 ಕೋಶಗಳು GPI ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳು ಅಥವಾ ಜೀವಕೋಶದ ಗೋಡೆಯ ಸಮಗ್ರತೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವ ಔಷಧಿಗಳಿಗೆ ಅಲರ್ಜಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ (28), ಮತ್ತು ಯೀಸ್ಟ್ ಕೋಶಗಳ ಸಂಯೋಗದಲ್ಲಿ ಪ್ರಕ್ಷೇಪಿಸಲಾದ ತುದಿ ಸೆರಾಮೈಡ್‌ನ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ Gas1-GFP ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗಳ (49) ಅಗತ್ಯವು G ಅನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ hLag1 ಕೋಶಗಳ ಸಂಭವನೀಯ ಶಾರೀರಿಕ ಪರಿಣಾಮಗಳು. GPI-AP ದೋಷ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಜೀವಕೋಶದ ಮೇಲ್ಮೈಯ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಸಂಘಟನೆಯನ್ನು ER ನಿಂದ ಲಿಪಿಡ್ ಉದ್ದವನ್ನು ಆಧರಿಸಿದ ವಿಂಗಡಣೆ ವಿಧಾನದ ಮೂಲಕ ಪ್ರೋಗ್ರಾಮ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆಯೇ ಎಂದು ಮತ್ತಷ್ಟು ಪರೀಕ್ಷಿಸುವುದು ನಮ್ಮ ಭವಿಷ್ಯದ ಸಂಶೋಧನೆಯ ವಿಷಯವಾಗಿದೆ.
ಈ ಕೆಲಸದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ಸ್ಯಾಕರೊಮೈಸಸ್ ಸೆರೆವಿಸಿಯಾ ತಳಿಗಳನ್ನು ಕೋಷ್ಟಕ S1 ರಲ್ಲಿ ಪಟ್ಟಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಲೈವ್ ಸೆಲ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ SCLIM ನ MMY1583 ಮತ್ತು MMY1635 ತಳಿಗಳನ್ನು W303 ಹಿನ್ನೆಲೆಯಲ್ಲಿ ನಿರ್ಮಿಸಲಾಗಿದೆ. ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಟ್ಯಾಗ್‌ನೊಂದಿಗೆ Sec13-mCherry ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಈ ತಳಿಗಳನ್ನು ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಚೈನ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್ (PCR) ಆಧಾರಿತ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು pFA6a ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಅನ್ನು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನಂತೆ ನಿರ್ಮಿಸಲಾಗಿದೆ (23). GAL1 ಪ್ರವರ್ತಕದ ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ Mid2-iRFP ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ತಳಿಯನ್ನು ಈ ಕೆಳಗಿನಂತೆ ನಿರ್ಮಿಸಲಾಗಿದೆ. pKTiRFP-KAN ವೆಕ್ಟರ್‌ನಿಂದ iRFP-KanMx ಅನುಕ್ರಮದ PCR ವರ್ಧನೆ (E. O'Shea ನ ಉಡುಗೊರೆ, ಆಡ್ಜೆನ್ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಸಂಖ್ಯೆ 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; ಸಂಶೋಧನಾ ಸಂಪನ್ಮೂಲ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆ (RRID): ಆಡ್ಜೆನ್_64687) ಮತ್ತು ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ Mid2 ನ C-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಗಿದೆ. Mid2-iRFP ಜೀನೋಮ್ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ವರ್ಧಿಸಿ GAL1 ಪ್ರವರ್ತಕಕ್ಕೆ ಕ್ಲೋನ್ ಮಾಡಿದ ನಂತರ, ಅದನ್ನು ಏಕೀಕರಣ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ pRS306 ನ ನಾಟ್ I-Sac I ಸೈಟ್‌ಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಯಿತು. ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಬಂದ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ pRGS7 ಅನ್ನು URA3 ಲೋಕಸ್‌ಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲು Pst I ನೊಂದಿಗೆ ರೇಖೀಯಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು.
ಗ್ಯಾಸ್1-ಜಿಎಫ್‌ಪಿ ಸಮ್ಮಿಳನ ಜೀನ್ ಅನ್ನು ಸೆಂಟ್ರೋಮಿಯರ್ (ಸಿಇಎನ್) ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಜಿಎಎಲ್1 ಪ್ರವರ್ತಕದ ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದನ್ನು ಈ ಕೆಳಗಿನಂತೆ ನಿರ್ಮಿಸಲಾಗಿದೆ. ಗ್ಯಾಸ್1-ಜಿಎಫ್‌ಪಿ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಪಿಸಿಆರ್ ಮೂಲಕ ಪಿಆರ್‌ಎಸ್416-ಜಿಎಎಸ್1-ಜಿಎಫ್‌ಪಿ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ (24) (ಎಲ್. ಪೊಪೊಲೊ ಉಡುಗೊರೆ) ನಿಂದ ವರ್ಧಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಸಿಇಎನ್ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಪಿಬಿಇವಿ-ಜಿಎಲ್ ಎಲ್‌ಇಯು 2 (ಸಿ ಉಡುಗೊರೆ) ಯ ಎಕ್ಸ್‌ಎಂಎ ಐ–ಎಕ್ಸ್‌ಹೋ ಐ ಸೈಟ್‌ಗೆ ಕ್ಲೋನ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಮಿಲ್ಲರ್; ಆಡ್‌ಜೀನ್ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಸಂಖ್ಯೆ 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; ಆರ್‌ಆರ್‌ಐಡಿ: ಆಡ್‌ಜೀನ್_51225). ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಬರುವ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಅನ್ನು ಪಿಆರ್‌ಜಿಎಸ್6 ಎಂದು ಹೆಸರಿಸಲಾಯಿತು. ಆಕ್ಸಲ್2-ಜಿಎಫ್‌ಪಿ ಸಮ್ಮಿಳನ ಜೀನ್ ಅನ್ನು ಪಿಬಿಇವಿ-ಜಿಎಲ್ ಎಲ್‌ಇಯು 2 ವೆಕ್ಟರ್‌ನ ಜಿಎಎಲ್1 ಪ್ರವರ್ತಕದ ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅದರ ನಿರ್ಮಾಣವು ಈ ಕೆಳಗಿನಂತಿರುತ್ತದೆ. Axl2-GFP ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು PCR ಮೂಲಕ pRS304-p2HSE-Axl2-GFP ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ (23) ನಿಂದ ವರ್ಧಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು pBEVY-GL LEU2 ವೆಕ್ಟರ್‌ನ ಬಾಮ್ HI-Pst I ಸೈಟ್‌ಗೆ ಕ್ಲೋನ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಬಂದ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಅನ್ನು pRGS12 ಎಂದು ಹೆಸರಿಸಲಾಯಿತು. ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ಆಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಕೋಷ್ಟಕ S2 ರಲ್ಲಿ ಪಟ್ಟಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.
ಈ ತಳಿಯನ್ನು 0.2% ಅಡೆನಿನ್ ಮತ್ತು 2% ಗ್ಲೂಕೋಸ್ [YP-ಡೆಕ್ಸ್ಟ್ರೋಸ್ (YPD)], 2% ರಾಫಿನೋಸ್ [YP-ರಾಫಿನೋಸ್] ಸಮೃದ್ಧ ಯೀಸ್ಟ್ ಸಾರ ಪ್ರೋಟೀನ್ p (YP) ಮಾಧ್ಯಮ (1% ಯೀಸ್ಟ್ ಸಾರ ಮತ್ತು 2% ಪ್ರೋಟೀನ್ ept). (YPR)] ಅಥವಾ 2% ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಸ್ [YP-ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಸ್ (YPG)] ಅನ್ನು ಇಂಗಾಲದ ಮೂಲವಾಗಿ ಅಥವಾ ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ ಕನಿಷ್ಠ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ (0.15% ಯೀಸ್ಟ್ ಸಾರ ಮತ್ತು 0.5% ಅಮೋನಿಯಂ ಸಲ್ಫೇಟ್) ಪೋಷಣೆಗೆ ಅಗತ್ಯವಾದ ಸೂಕ್ತವಾದ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳು ಮತ್ತು ಬೇಸ್‌ಗಳನ್ನು ಪೂರೈಸಲು ಮತ್ತು 2% ಗ್ಲೂಕೋಸ್ (ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಕನಿಷ್ಠ ಮಾಧ್ಯಮ) ಅಥವಾ 2% ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಸ್ (ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಸ್ ಕನಿಷ್ಠ ಮಾಧ್ಯಮ) ಅನ್ನು ಕಾರ್ಬನ್ ಮೂಲವಾಗಿ ಹೊಂದಿರುವ ಪೂರಕವಾಗಿದೆ.
ನೈಜ-ಸಮಯದ ಚಿತ್ರಣಕ್ಕಾಗಿ, GAL1 ಪ್ರವರ್ತಕದ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ರಚನೆಯನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ತಾಪಮಾನ-ಸೂಕ್ಷ್ಮ sec31-1 ರೂಪಾಂತರಿತ ಕೋಶಗಳನ್ನು YPR ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ 24°C ನಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಮಧ್ಯ-ಲಾಗ್ ಹಂತಕ್ಕೆ ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು. YPG ನಲ್ಲಿ 24°C ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆಯವರೆಗೆ ಇಂಡಕ್ಷನ್ ಮಾಡಿದ ನಂತರ, ಕೋಶಗಳನ್ನು SG ನಲ್ಲಿ 37°C ನಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ ಸ್ರವಿಸುವ ಬ್ಲಾಕ್‌ನಿಂದ ಬಿಡುಗಡೆಯಾಗಲು 24°C ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು. ಕೋಶಗಳನ್ನು ಗಾಜಿನ ಸ್ಲೈಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಸರಿಪಡಿಸಲು ಕಾನ್ಕನಾವಾಲಿನ್ A ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು SCLIM ನಿಂದ ಚಿತ್ರಿಸಲಾಯಿತು. SCLIM ಎಂಬುದು ಒಲಿಂಪಸ್ IX-71 ತಲೆಕೆಳಗಾದ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್ ಮತ್ತು UPlanSApo 100×1.4 ಸಂಖ್ಯಾತ್ಮಕ ದ್ಯುತಿರಂಧ್ರ ತೈಲ ಮಸೂರ (ಒಲಿಂಪಸ್), ಹೆಚ್ಚಿನ ವೇಗ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ-ಸಿಗ್ನಲ್-ಟು-ಶಬ್ದ ಅನುಪಾತ ತಿರುಗುವ ಡಿಸ್ಕ್ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಸ್ಕ್ಯಾನರ್ (ಯೊಕೊಗಾವಾ ಎಲೆಕ್ಟ್ರಿಕ್), ಕಸ್ಟಮ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ ಮತ್ತು ಕಸ್ಟಮ್ ಕೂಲಿಂಗ್‌ನ ಸಂಯೋಜನೆಯಾಗಿದೆ. ಸಿಸ್ಟಮ್‌ನ ಇಮೇಜ್ ಇಂಟೆನ್ಸಿಫೈಯರ್ (ಹಮಮಟ್ಸು ಫೋಟೊನಿಕ್ಸ್) ×266.7 ರ ಅಂತಿಮ ವರ್ಧನೆಯೊಂದಿಗೆ ವರ್ಧಕ ಲೆನ್ಸ್ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಮತ್ತು ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಗುಣಿಸುವ ಚಾರ್ಜ್-ಕಪಲ್ಡ್ ಸಾಧನ ಕ್ಯಾಮೆರಾವನ್ನು (ಹಮಮಟ್ಸು ಫೋಟೊನಿಕ್ಸ್) ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ (21). ಇಮೇಜ್ ಸ್ವಾಧೀನವನ್ನು ಕಸ್ಟಮ್ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ (ಯೊಕೊಗಾವಾ ಎಲೆಕ್ಟ್ರಿಕ್) ನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ. 3D ಚಿತ್ರಗಳಿಗಾಗಿ, ವಸ್ತುನಿಷ್ಠ ಲೆನ್ಸ್ ಅನ್ನು ಲಂಬವಾಗಿ ಕಂಪಿಸಲು ನಾವು ಕಸ್ಟಮ್-ನಿರ್ಮಿತ ಪೀಜೋಎಲೆಕ್ಟ್ರಿಕ್ ಆಕ್ಯೂವೇಟರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಸ್ಟ್ಯಾಕ್‌ನಲ್ಲಿ 100 nm ಅಂತರದಲ್ಲಿ ಆಪ್ಟಿಕಲ್ ಭಾಗಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿದ್ದೇವೆ. Z-ಸ್ಟ್ಯಾಕ್ ಚಿತ್ರವನ್ನು 3D ವೋಕ್ಸೆಲ್ ಡೇಟಾ ಆಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ತಿರುಗುವ ಡಿಸ್ಕ್ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್‌ಗೆ ಬಳಸುವ ಸೈದ್ಧಾಂತಿಕ ಪಾಯಿಂಟ್ ಸ್ಪ್ರೆಡ್ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ವೊಲೊಸಿಟಿ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ (ಪರ್ಕಿನ್ಎಲ್ಮರ್) ಮೂಲಕ ಡಿಕನ್ವಲ್ಯೂಷನ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗೆ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸಹ-ಸ್ಥಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತವಾಗಿ ಮಿತಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿಸಲು ವೊಲೊಸಿಟಿ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವ ಮೂಲಕ, ಸರಕು ಸೇರಿದಂತೆ ERES ಅನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. ಮೆಟಾಮಾರ್ಫ್ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ (ಆಣ್ವಿಕ ಸಾಧನಗಳು) ಬಳಸಿ ಲೈನ್ ಸ್ಕ್ಯಾನ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ಮಹತ್ವವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಗ್ರಾಫ್‌ಪ್ಯಾಡ್ ಪ್ರಿಸ್ಮ್ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಬಳಸಿ. ಎರಡು-ಬಾಲದ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆ ಮತ್ತು ಸಾಮಾನ್ಯ ಏಕಮುಖ ವ್ಯತ್ಯಾಸ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (ANOVA) ಪರೀಕ್ಷೆಗೆ, ಗುಂಪುಗಳ ನಡುವಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳು P <0.05 (*) ಮೇಲೆ ಗಮನಾರ್ಹ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತವೆ ಎಂದು ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಗ್ಯಾಸ್1-ಜಿಎಫ್‌ಪಿಯ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿಗಾಗಿ, ಲಾಗ್ ಫೇಸ್ ಕೋಶಗಳನ್ನು ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ YPD ಯಲ್ಲಿ ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಗೇಶನ್ ಮೂಲಕ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು, ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬಫರ್ಡ್ ಸಲೈನ್‌ನಿಂದ ಎರಡು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕನಿಷ್ಠ 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕದ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಮುಂದುವರಿಯಲಾಯಿತು ಚೆಕ್ (24). ವಸ್ತುನಿಷ್ಠ ಲೆನ್ಸ್, L5 (GFP) ಫಿಲ್ಟರ್, ಹಮಾಮಟ್ಸು ಕ್ಯಾಮೆರಾ ಮತ್ತು ಅಪ್ಲಿಕೇಶನ್ ಸೂಟ್ X (LAS X) ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿದ ಲೈಕಾ DMi8 ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್ (HCX PL APO 1003/1.40 ಎಣ್ಣೆ PH3 CS) ಅನ್ನು ಸ್ವಾಧೀನಕ್ಕಾಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು.
ಮಾದರಿಗಳನ್ನು 65°C ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ SDS ಮಾದರಿ ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಡಿನೇಚರ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ SDS-ಪಾಲಿಅಕ್ರಿಲಾಮೈಡ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ (PAGE) ನಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಇಮ್ಯುನೊಬ್ಲಾಟಿಂಗ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, ಪ್ರತಿ ಲೇನ್‌ಗೆ 10 μl ಮಾದರಿಯನ್ನು ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯ: 1:3000 ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಮೊಲದ ಪಾಲಿಕ್ಲೋನಲ್ ಆಂಟಿ-ಗ್ಯಾಸ್1, 1:500 ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಮೊಲದ ಪಾಲಿಕ್ಲೋನಲ್ ಆಂಟಿ-ಎಂಪಿ24 ಮತ್ತು 1:3000 ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಮೊಲದ ಪಾಲಿಕ್ಲೋನಲ್ ಆಂಟಿ-ಜಿಎಫ್‌ಪಿ (ಎಚ್. ರೈಜ್‌ಮನ್‌ನಿಂದ ಉಡುಗೊರೆ) ಬಳಸಿ. ಮೌಸ್ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಆಂಟಿ-ಪಿಜಿಕೆ1 ಪ್ರತಿಕಾಯವನ್ನು 1:5000 ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು (ಜೆ. ಡೆ ಲಾ ಕ್ರೂಜ್‌ನಿಂದ ಉಡುಗೊರೆ). ದ್ವಿತೀಯ ಪ್ರತಿಕಾಯ: ಹಾರ್ಸ್‌ರಡಿಶ್ ಪೆರಾಕ್ಸಿಡೇಸ್ (HRP) ಸಂಯೋಜಿತ ಮೇಕೆ ಆಂಟಿ-ಮೊಲ ಇಮ್ಯುನೊಗ್ಲಾಬ್ಯುಲಿನ್ G (IgG) ಅನ್ನು 1:3000 (ಪಿಯರ್ಸ್) ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. HRP-ಸಂಯೋಜಿತ ಮೇಕೆ ಆಂಟಿ-ಮೌಸ್ IgG ಅನ್ನು 1:3000 (ಪಿಯರ್ಸ್) ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಸೂಪರ್‌ಸಿಗ್ನಲ್ ವೆಸ್ಟ್ ಪಿಕೊ ಕಾರಕದ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಕೆಮಿಲುಮಿನೆಸೆನ್ಸ್ ವಿಧಾನದಿಂದ ರೋಗನಿರೋಧಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವಲಯವನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಯಿತು.
(31) ರಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ, ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ER ಭಾಗದ ಮೇಲೆ ನೈಸರ್ಗಿಕ ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಶನ್ ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, 100 ಆಪ್ಟಿಕಲ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಎರಡು ಬಾರಿ 600 nm (OD600) ನಲ್ಲಿ TNE ಬಫರ್ [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM ಫಿನೈಲ್ಮೀಥೈಲ್ಸಲ್ಫೋನಿಲ್ ಫ್ಲೋರೈಡ್ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀಸ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್ ಮಿಶ್ರಣ) ದಿಂದ ಯೀಸ್ಟ್ ಕೋಶಗಳನ್ನು ತೊಳೆಯಿರಿ. ಇದನ್ನು ಗಾಜಿನ ಮಣಿಗಳಿಂದ ಒಡೆಯಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ ಜೀವಕೋಶದ ಅವಶೇಷಗಳು ಮತ್ತು ಗಾಜಿನ ಮಣಿಗಳನ್ನು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮೂಲಕ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಸೂಪರ್ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು 4°C ನಲ್ಲಿ 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 17,000 ಗ್ರಾಂ ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಗುಳಿಗೆಯನ್ನು TNE ನಲ್ಲಿ ಮತ್ತೆ ಜೋಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಡಿಜಿಟಲಿಸ್ ಸಪೋನಿನ್ ಅನ್ನು 1% ಅಂತಿಮ ಸಾಂದ್ರತೆಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ಅಮಾನತುಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು 4°C ನಲ್ಲಿ ತಿರುಗುವಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ 1 ಗಂಟೆ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ ಕರಗದ ಘಟಕಗಳನ್ನು 4°C ನಲ್ಲಿ 13,000 ಗ್ರಾಂ ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮೂಲಕ 60 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು. ಗ್ಯಾಸ್1-ಜಿಎಫ್‌ಪಿ ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಶನ್‌ಗಾಗಿ, ಮೊದಲು ಮಾದರಿಯನ್ನು ಖಾಲಿ ಅಗರೋಸ್ ಮಣಿಗಳೊಂದಿಗೆ (ಕ್ರೋಮೋಟೆಕ್) 4°C ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ ಪೂರ್ವ-ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಿ, ನಂತರ 4°C ನಲ್ಲಿ ಜಿಎಫ್‌ಪಿ-ಟ್ರ್ಯಾಪ್_ಎ (ಕ್ರೋಮೋಟೆಕ್) 3 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಿ. ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಟೆಡ್ ಮಣಿಗಳನ್ನು 0.2% ಡಿಗೋಕ್ಸಿಜೆನಿನ್ ಹೊಂದಿರುವ ಟಿಎನ್‌ಇಯಿಂದ ಐದು ಬಾರಿ ತೊಳೆದು, ಎಸ್‌ಡಿಎಸ್ ಮಾದರಿ ಬಫರ್‌ನಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಿ, ಎಸ್‌ಡಿಎಸ್-ಪೇಜ್‌ನಲ್ಲಿ ಬೇರ್ಪಡಿಸಿ, ಇಮ್ಯುನೊಬ್ಲಾಟಿಂಗ್ ಮೂಲಕ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.
(31) ರಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ, ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ER ಭಾಗದ ಮೇಲೆ ಅಡ್ಡ-ಸಂಪರ್ಕ ನಿರ್ಣಯವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ER ಭಾಗವನ್ನು 0.5 mM ಡಿಥಿಯೋಬಿಸ್ (ಸಕ್ಸಿನಿಮಿಡಿಲ್ ಪ್ರೊಪಿಯೊನೇಟ್) (ಪಿಯರ್ಸ್, ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, ರಾಕ್‌ಫೋರ್ಡ್, IL, USA; 20°C, 20 ನಿಮಿಷ) ನೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. ಗ್ಲೈಸಿನ್ (50 mM ಅಂತಿಮ ಸಾಂದ್ರತೆ, 5 ನಿಮಿಷಗಳು, 20°C) ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಅಡ್ಡ-ಸಂಪರ್ಕ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ತಣಿಸಲಾಯಿತು.
ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ (50), ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ಮತ್ತು GhLag1 ತಳಿಗಳಲ್ಲಿ ಸೆರಾಮೈಡ್‌ನ MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, YPD ಯಲ್ಲಿ 30°C ನಲ್ಲಿ ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ಘಾತೀಯ ಹಂತಕ್ಕೆ (3 ರಿಂದ 4 OD600 ಯೂನಿಟ್‌ಗಳು/ಮಿಲಿ) ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 25×107 ಕೋಶಗಳನ್ನು ಕೊಯ್ಲು ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಅವುಗಳ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಟ್ರೈಕ್ಲೋರೋಅಸೆಟಿಕ್ ಆಮ್ಲದೊಂದಿಗೆ ತಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಹೊರತೆಗೆಯುವ ದ್ರಾವಕವನ್ನು ಬಳಸಿ [ಎಥೆನಾಲ್, ನೀರು, ಈಥರ್, ಪಿರಿಡಿನ್ ಮತ್ತು 4.2 N ಅಮೋನಿಯಂ ಹೈಡ್ರಾಕ್ಸೈಡ್ (15:15:5:1:0.018 v/v)] ಮತ್ತು 1.2 nmol ಆಂತರಿಕ ಪ್ರಮಾಣಿತ C17 ಸೆರಾಮೈಡ್ (860517, ಅವಂತಿ ಪೋಲಾರ್ ಲಿಪಿಡ್) ಗುಣಮಟ್ಟ). ಸಾರದ ಸೌಮ್ಯ ಕ್ಷಾರೀಯ ಜಲವಿಚ್ಛೇದನೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ಮೊನೊಮೆಥೈಲಮೈನ್ ಕಾರಕವನ್ನು [ಮೆಥನಾಲ್, ನೀರು, n-ಬ್ಯುಟನಾಲ್ ಮತ್ತು ಮೀಥೈಲಮೈನ್ ದ್ರಾವಣ (4:3:1:5 v/v)] ಬಳಸಿ, ಮತ್ತು ನಂತರ ಉಪ್ಪು ತೆಗೆಯಲು ನೀರು-ಸ್ಯಾಚುರೇಟೆಡ್ n-ಬ್ಯುಟನಾಲ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ. ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಸಾರವನ್ನು ಧನಾತ್ಮಕ ಮೋಡ್ ದ್ರಾವಕದಲ್ಲಿ [ಕ್ಲೋರೋಫಾರ್ಮ್/ಮೆಥನಾಲ್/ನೀರು (2:7:1) + 5 mM ಅಮೋನಿಯಂ ಅಸಿಟೇಟ್] ಮತ್ತೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್‌ಗೆ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು. ಸ್ಪಿಂಗೊಲಿಪಿಡ್ ಅಣುಗಳ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ ಬಹು-ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ (MRM) ಅನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. TSQ ವಾಂಟೇಜ್ ತೃತೀಯ ಕ್ವಾಡ್ರುಪೋಲ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಲಿಪಿಡ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ರೋಬೋಟಿಕ್ ನ್ಯಾನೊಫ್ಲೋ ಅಯಾನ್ ಮೂಲ ನ್ಯಾನೊಮೇಟ್ HD (ಅಡ್ವಿಯನ್ ಬಯೋಸೈನ್ಸಸ್, ಇಥಾಕಾ, NY) ನೊಂದಿಗೆ ಸಜ್ಜುಗೊಂಡಿದೆ. ಪ್ರತಿ ಸೆರಾಮೈಡ್ ವರ್ಗಕ್ಕೆ ಘರ್ಷಣೆಯ ಶಕ್ತಿಯನ್ನು ಅತ್ಯುತ್ತಮವಾಗಿಸಲಾಗಿದೆ. MS ಡೇಟಾವನ್ನು ಧನಾತ್ಮಕ ಮೋಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ. ಪ್ರತಿ ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗೆ, ಲಿಪಿಡ್ ಸಿಗ್ನಲ್ ಮೂರು ಸ್ವತಂತ್ರ ಅಳತೆಗಳ ಸರಾಸರಿಯಾಗಿದೆ.
(31) ರಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ, Gas1-GFP ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು (800×107) ನೈಸರ್ಗಿಕ ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಶನ್‌ಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ Gas1-GFP ಅನ್ನು SDS-PAGE ನಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪಾಲಿವಿನೈಲಿಡಿನ್ ಫ್ಲೋರೈಡ್ (PVDF) ಪೊರೆಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು. PVDF ಅನ್ನು ಅಮೈಡ್ ಕಪ್ಪು ಬಣ್ಣದಿಂದ ಕಲೆ ಹಾಕುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲಾಯಿತು. Gas1-GFP ಬ್ಯಾಂಡ್ ಅನ್ನು PVDF ನಿಂದ ಕತ್ತರಿಸಿ 5 ಬಾರಿ ಮೆಥನಾಲ್ ಮತ್ತು ಒಮ್ಮೆ ದ್ರವ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿ-MS (LC-MS) ದರ್ಜೆಯ ನೀರಿನಿಂದ ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು. ಮೆಂಬರೇನ್ ಪಟ್ಟಿಯನ್ನು 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), ಬಫರ್ ಮತ್ತು 500μl ಹೊಸದಾಗಿ ಕರಗಿದ 1 M ಸೋಡಿಯಂ ನೈಟ್ರೈಟ್ ಮಿಶ್ರಣದಿಂದ 37°C ನಲ್ಲಿ 3 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ, ಲಿಪಿಡ್ ಭಾಗವನ್ನು Gas1-GFP ಯಿಂದ ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಗ್ಲುಕೋಸ್ಅಮೈನ್ ಮತ್ತು ಇನೋಸಿಟಾಲ್ ನಡುವೆ ಇನೋಸಿನ್ ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಸೆರಾಮೈಡ್ ಅನ್ನು ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ (51). ಅದರ ನಂತರ, ಪೊರೆಯ ಪಟ್ಟಿಯನ್ನು LC-MS ದರ್ಜೆಯ ನೀರಿನಿಂದ ನಾಲ್ಕು ಬಾರಿ ತೊಳೆದು, ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಒಣಗಿಸಿ, ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯವರೆಗೆ -80°C ನಲ್ಲಿ ಸಾರಜನಕ ವಾತಾವರಣದಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು. ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ, ಪ್ರತಿ ಪ್ರಯೋಗಕ್ಕೂ PVDF ಪೊರೆಯ ಖಾಲಿ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ Gas1-GFP ಯಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಲಿಪಿಡ್ ಅನ್ನು ವಿವರಿಸಿದಂತೆ MS ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿತು (50). ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, GPI-ಲಿಪಿಡ್ ಹೊಂದಿರುವ PVDF ಪಟ್ಟಿಗಳನ್ನು 75μl ಋಣಾತ್ಮಕ ಅಚ್ಚು ದ್ರಾವಕದಲ್ಲಿ [ಕ್ಲೋರೋಫಾರ್ಮ್/ಮೆಥನಾಲ್ (1:2) + 5 mM ಅಮೋನಿಯಂ ಅಸಿಟೇಟ್] ಮತ್ತೆ ಜೋಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸ್ಪಿಂಗೊಲಿಪಿಡ್ ಪ್ರಭೇದಗಳ (TSQ ವಾಂಟೇಜ್) ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಪ್ರೇ ಅಯಾನೀಕರಣ (ESI)-MRM/MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ರವಾನಿಸಲಾಯಿತು. ಈ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, MS ಡೇಟಾವನ್ನು ನಕಾರಾತ್ಮಕ ಅಯಾನು ಕ್ರಮದಲ್ಲಿ ಪಡೆಯಲಾಯಿತು.
ಮೊದಲೇ ಹೇಳಿದಂತೆ, GPI ಆಂಕರ್‌ನ ಲಿಪಿಡ್ ಭಾಗವನ್ನು [3H]-ಇನೋಸಿಟಾಲ್-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ GPI-AP (16) ನಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳನ್ನು ದ್ರಾವಕ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು (55:45:10 ಕ್ಲೋರೋಫಾರ್ಮ್-ಮೆಥನಾಲ್-0.25% KCl) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ತೆಳುವಾದ ಪದರದ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿ ಮೂಲಕ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು FLA-7000 (ಫ್ಯೂಜಿಫಿಲ್ಮ್) ಬಳಸಿ ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲಾಯಿತು.
Gas1-GFP (600×107) ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಕೋಶಗಳನ್ನು TNE ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ TNE ಬಫರ್‌ನಿಂದ ಎರಡು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಗಾಜಿನ ಮಣಿಗಳಿಂದ ಒಡೆದು, ನಂತರ ಜೀವಕೋಶದ ಅವಶೇಷಗಳು ಮತ್ತು ಗಾಜಿನ ಮಣಿಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು 4°C ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ 17,000 ಗ್ರಾಂ ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಪೆಲೆಟ್ ಅನ್ನು TNE ನಲ್ಲಿ ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 37°C ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ 0.2% ಡಿಜಿಟಲಿಸ್ ಸಪೋನಿನ್ ಹೊಂದಿರುವ TNE ನಲ್ಲಿ 1 U PI-PLC (ಇನ್ವಿಟ್ರೋಜನ್) ನೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. ಕಿಣ್ವ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ನಂತರ, ಪೊರೆಯನ್ನು 4°C ನಲ್ಲಿ 17,000 ಗ್ರಾಂ ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮೂಲಕ 1 ಗಂಟೆ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು. Gas1-GFP ಅನ್ನು ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಟ್ ಮಾಡಲು, ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ 4°C ನಲ್ಲಿ GFP-Trap_A (Chromotek) ನೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. SDS-PAGE ನಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾದ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ Gas1-GFP ಅನ್ನು ಕೂಮಾಸ್ಸಿ ಬ್ರಿಲಿಯಂಟ್ ಬ್ಲೂ ಬಣ್ಣದಿಂದ ಬಣ್ಣಿಸಲಾಗಿದೆ. ಗ್ಯಾಸ್1-ಜಿಎಫ್‌ಪಿ ಸ್ಟೇನಿಂಗ್ ಬ್ಯಾಂಡ್ ಅನ್ನು ಜಲಚರವನ್ನು ಸುತ್ತುವರೆದಿರುವ ಬೂದು ಬಣ್ಣದಿಂದ ಕತ್ತರಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ ಅಯೋಡೋಅಸೆಟಮೈಡ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಆಲ್ಕೈಲೇಷನ್ ಮತ್ತು ಡೈಥಿಯೋಥ್ರೈಟಾಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಕಡಿತಗೊಳಿಸಿದ ನಂತರ, ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಇನ್-ಜೆಲ್ ಜೀರ್ಣಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಜಿಪಿಐ-ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಟ್ರಿಪ್ಟಿಕ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಿರಿ ಮತ್ತು ಒಣಗಿಸಿ. ಒಣಗಿದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನ್ನು 20 μl ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಕರಗಿಸಲಾಯಿತು. ಎಲ್‌ಸಿಗೆ ಒಂದು ಭಾಗವನ್ನು (8μl) ಚುಚ್ಚುಮದ್ದು ಮಾಡಿ. ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸಲು ಆಕ್ಟಾಡೆಸಿಲ್ಸಿಲೇನ್ (ODS) ಕಾಲಮ್ (ಡೆವೆಲೋಸಿಲ್ 300ODS-HG-5; ಒಳಗಿನ ವ್ಯಾಸ 150 ಮಿಮೀ × 1.0 ಮಿಮೀ; ನೊಮುರಾ ಕೆಮಿಕಲ್, ಐಚಿ ಪ್ರಿಫೆಕ್ಚರ್, ಜಪಾನ್) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಮೊಬೈಲ್ ಹಂತವು ದ್ರಾವಕ A (0.08% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲ) ಮತ್ತು ದ್ರಾವಕ B (80% ಅಸಿಟೋನಿಟ್ರೈಲ್‌ನಲ್ಲಿ 0.15% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲ). ಅಕ್ಸೆಲಾ HPLC ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, ಬೋಸ್ಟನ್, ಮ್ಯಾಸಚೂಸೆಟ್ಸ್) 55 ನಿಮಿಷಗಳ ಒಳಗೆ ದ್ರಾವಕ A ಯೊಂದಿಗೆ ಕಾಲಮ್ ಅನ್ನು 50 μl ನಿಮಿಷ-1 ರ ಹರಿವಿನ ದರದಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲು ಬಳಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ ದ್ರಾವಕ B ಯ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು 40% ಕ್ಕೆ ಹೆಚ್ಚಿಸಲಾಯಿತು. , ಯುನೈಟೆಡ್ ಸ್ಟೇಟ್ಸ್). ಎಲ್ಯುಯೇಟ್ ಅನ್ನು ನಿರಂತರವಾಗಿ ESI ಅಯಾನ್ ಮೂಲಕ್ಕೆ ಪರಿಚಯಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು GPI-ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಟ್ರಿಪ್ಟಿಕ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು LTQ ಆರ್ಬಿಟ್ರಾಪ್ XL (ಹೈಬ್ರಿಡ್ ಲೀನಿಯರ್ ಅಯಾನ್ ಟ್ರ್ಯಾಪ್-ಆರ್ಬಿಟ್ರಾಪ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್; ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿತು. MS ಸೆಟಪ್‌ನಲ್ಲಿ, ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿ ಮೂಲದ ವೋಲ್ಟೇಜ್ ಅನ್ನು 4.5 kV ಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ವರ್ಗಾವಣೆ ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿಯ ತಾಪಮಾನವನ್ನು 300°C ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿ ವೋಲ್ಟೇಜ್ ಮತ್ತು ಟ್ಯೂಬ್ ಲೆನ್ಸ್ ವೋಲ್ಟೇಜ್ ಅನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ 15 V ಮತ್ತು 50 V ಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ. MS ಡೇಟಾವನ್ನು ಧನಾತ್ಮಕ ಅಯಾನು ಮೋಡ್‌ನಲ್ಲಿ (60,000 ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್; 10 ಭಾಗಗಳ ದ್ರವ್ಯರಾಶಿ ನಿಖರತೆ ಪ್ರತಿ ಮಿಲಿಯನ್‌ಗೆ) 300/m/z ದ್ರವ್ಯರಾಶಿ/ಚಾರ್ಜ್ ಅನುಪಾತ (m/z) 3000 ದ್ರವ್ಯರಾಶಿ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ. MS/MS ಡೇಟಾವನ್ನು LTQ ಆರ್ಬಿಟ್ರಾಪ್ XL [ಡೇಟಾ ಅವಲಂಬಿಸಿರುವ ಮೊದಲ 3 ಅಂಕೆಗಳು, ಘರ್ಷಣೆ ಪ್ರೇರಿತ ವಿಘಟನೆ (CID)] ನಲ್ಲಿರುವ ಅಯಾನು ಬಲೆ ಮೂಲಕ ಪಡೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.
GROMACS (52) ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಮತ್ತು MARTINI 2 ಫೋರ್ಸ್ ಫೀಲ್ಡ್ (53-55) ಬಳಸಿ MD ಸಿಮ್ಯುಲೇಶನ್‌ಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ CHARMM GUI ಮೆಂಬರೇನ್ ಬಿಲ್ಡರ್ (56, 57) ಅನ್ನು ಡಯೋಲಿಯೊಲ್ಫಾಸ್ಫಾಟಿಡಿಲ್ಕೋಲಿನ್ (DOPC) ಮತ್ತು Cer C18 ಅಥವಾ DOPC ಮತ್ತು Cer C26 ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ದ್ವಿಪದರವನ್ನು ನಿರ್ಮಿಸಲು ಬಳಸಲಾಯಿತು. Cer C26 ನ ಟೋಪೋಲಜಿ ಮತ್ತು ನಿರ್ದೇಶಾಂಕಗಳನ್ನು ಸ್ಪಿಂಗೋಸಿನ್ ಬಾಲದಿಂದ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಮಣಿಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುವ ಮೂಲಕ DXCE ನಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ. ಡಬಲ್ ಲೇಯರ್ ಅನ್ನು ಸಮತೋಲನಗೊಳಿಸಲು ಮತ್ತು ಅದನ್ನು ಚಲಾಯಿಸಲು ಕೆಳಗೆ ವಿವರಿಸಿದ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಬಳಸಿ, ನಂತರ Emp24 ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ನಿರ್ಮಿಸಲು ವ್ಯವಸ್ಥೆಯ ಕೊನೆಯ ನಿರ್ದೇಶಾಂಕಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ. ಯೀಸ್ಟ್ Emp24 (ಅವಶೇಷಗಳು 173 ರಿಂದ 193) ನ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಡೊಮೇನ್ ಅನ್ನು ದೃಶ್ಯ MD (VMD) ಉಪಕರಣದ ಆಣ್ವಿಕ ರಚನೆಯನ್ನು (58) ಬಳಸಿಕೊಂಡು α-ಹೆಲಿಕ್ಸ್ ಆಗಿ ನಿರ್ಮಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ, ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿದ ನಂತರ, ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಒರಟಾಗಿ ಹರಳಾಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು CHARMM GUI ಬಳಸಿ ದ್ವಿಪದರಕ್ಕೆ ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಅಂತಿಮ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯು 1202 DOPC ಮತ್ತು 302 Cer C26 ಅಥವಾ 1197 DOPC ಮತ್ತು 295 Cer C18 ಮತ್ತು Emp24 ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ. ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು 0.150M ಸಾಂದ್ರತೆಗೆ ಅಯಾನೀಕರಿಸಿ. ಎರಡು ದ್ವಿಪದರ ಸಂಯೋಜನೆಗಳಿಗೆ ನಾಲ್ಕು ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳನ್ನು ಮಾಡಲಾಯಿತು.
ಲಿಪಿಡ್ ದ್ವಿಪದರವನ್ನು CHARMM GUI ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸಮತೋಲನಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು 405,000 ಹಂತಗಳನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವುದು ಮತ್ತು ನಂತರ ಸಮತೋಲನಗೊಳಿಸುವುದನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತದೆ, ಅಲ್ಲಿ ಸ್ಥಾನ ನಿರ್ಬಂಧಗಳನ್ನು ಕ್ರಮೇಣ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಮಯದ ಹಂತವನ್ನು 0.005 ps ನಿಂದ 0.02 ps ಗೆ ಹೆಚ್ಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸಮತೋಲನದ ನಂತರ, ಇದು 0.02 ps ನ ಸಮಯದ ಹಂತದೊಂದಿಗೆ 6 µs ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ. Emp24 ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಿದ ನಂತರ, ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಮತ್ತು ಸಮತೋಲನಗೊಳಿಸಲು ಅದೇ CHARMM GUI ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಬಳಸಿ, ಮತ್ತು ನಂತರ ಉತ್ಪಾದನೆಯಲ್ಲಿ 8 ಸೆಕೆಂಡುಗಳ ಕಾಲ ರನ್ ಮಾಡಿ.
ಎಲ್ಲಾ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳಿಗೆ, ಸಮತೋಲನ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಒತ್ತಡವನ್ನು ಬೆರೆಂಡ್ಸೆನ್ ಬ್ಯಾರೊಸ್ಟಾಟ್ (59) ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಉತ್ಪಾದನಾ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ, ಒತ್ತಡವನ್ನು ಪ್ಯಾರಿನೆಲ್ಲೊ-ರೆಹಮಾನ್ ಬ್ಯಾರೊಸ್ಟಾಟ್ (60) ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ. ಎಲ್ಲಾ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, ಸರಾಸರಿ ಒತ್ತಡವು 1 ಬಾರ್ ಮತ್ತು ಅರೆ-ಐಸೋಟ್ರೋಪಿಕ್ ಒತ್ತಡ ಜೋಡಣೆ ಯೋಜನೆಯನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸಮತೋಲನ ಮತ್ತು ಉತ್ಪಾದನಾ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ, ವೇಗ ಮರುಮಾಪನಾಂಕ ನಿರ್ಣಯದೊಂದಿಗೆ ಥರ್ಮೋಸ್ಟಾಟ್ (61) ಅನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ ಪ್ರೋಟೀನ್, ಲಿಪಿಡ್ ಮತ್ತು ದ್ರಾವಕ ಕಣಗಳ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಜೋಡಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸಂಪೂರ್ಣ ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಗುರಿ ತಾಪಮಾನವು 310K ಆಗಿದೆ. 0.005 ಬಫರ್ ಸಹಿಷ್ಣುತೆಯೊಂದಿಗೆ ವರ್ಲೆಟ್ ಯೋಜನೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಜೋಡಣೆ ಪಟ್ಟಿಯನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುವ ಮೂಲಕ ಬಂಧವಿಲ್ಲದ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ. ಕೂಲಂಬ್ ಪದವನ್ನು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಕ್ಷೇತ್ರ ಮತ್ತು 1.1 nm ನ ಕಟ್-ಆಫ್ ದೂರವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ. ವ್ಯಾಂಡರ್ ವಾಲ್ಸ್ ಪದವು 1.1 nm ನ ಕಟ್-ಆಫ್ ದೂರದೊಂದಿಗೆ ಕಟ್-ಆಫ್ ಯೋಜನೆಯನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ವರ್ಲೆಟ್ ಕಟ್-ಆಫ್ ಯೋಜನೆಯನ್ನು ಸಂಭಾವ್ಯ ಡ್ರಿಫ್ಟ್ (62) ಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
VMD ಬಳಸಿ, DOPC ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಮಣಿಗಳು ಅಥವಾ ಸೆರಾಮೈಡ್ AM1 ಮಣಿಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ನಡುವಿನ ಕಟ್ಆಫ್ ತರಂಗಾಂತರವು 0.7 nm ಆಗಿದ್ದು, ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸುವ ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ. ಈ ಕೆಳಗಿನ ಸೂತ್ರದ ಪ್ರಕಾರ, (63) ರಲ್ಲಿರುವಂತೆ ಸವಕಳಿ-ಪುಷ್ಟೀಕರಣ (DE) ಅಂಶವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿ: DE ಅಂಶ = (ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಒಟ್ಟು ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳ ಪ್ರಮಾಣ 0.7) ಪ್ರೋಟೀನ್ 0.7 ರಲ್ಲಿ (ಒಟ್ಟು ಲಿಪಿಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ Cer ಪ್ರಮಾಣ)
ವರದಿ ಮಾಡಲಾದ ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಸರಾಸರಿಯಾಗಿ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ದೋಷ ಪಟ್ಟಿಗಳು SE ಯ ನಾಲ್ಕು ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರತಿಗಳಾಗಿವೆ. DE ಅಂಶದ ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ಮಹತ್ವವನ್ನು t ಪರೀಕ್ಷೆಯಿಂದ [(ಸರಾಸರಿDE-ಅಂಶ-1)/SE] ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ. ಒಂದು-ಬಾಲದ ವಿತರಣೆಯಿಂದ P ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿ.
ಟ್ರೇಸ್‌ನ ಕೊನೆಯ 250 ns ಒಳಗೆ Emp24 ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯ 2D ಲ್ಯಾಟರಲ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ನಕ್ಷೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಲು GROMACS ಉಪಕರಣವನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಸೆರಾಮೈಡ್‌ನ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ/ಕ್ಷಯಿಸುವಿಕೆ ನಕ್ಷೆಯನ್ನು ಪಡೆಯಲು, Cer ನ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ನಕ್ಷೆಯನ್ನು Cer ಮತ್ತು DOPC ನಕ್ಷೆಯ ಮೊತ್ತದಿಂದ ಭಾಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ದೇಹದಲ್ಲಿನ Cer ನ ಸಾಂದ್ರತೆಯಿಂದ ಭಾಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಅದೇ ಬಣ್ಣದ ನಕ್ಷೆಯ ಮಾಪಕವನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಈ ಲೇಖನಕ್ಕೆ ಪೂರಕ ಸಾಮಗ್ರಿಗಳಿಗಾಗಿ, ದಯವಿಟ್ಟು http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 ನೋಡಿ.
ಇದು ಕ್ರಿಯೇಟಿವ್ ಕಾಮನ್ಸ್ ಅಟ್ರಿಬ್ಯೂಷನ್-ವಾಣಿಜ್ಯೇತರ ಪರವಾನಗಿಯ ನಿಯಮಗಳ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ವಿತರಿಸಲಾದ ಮುಕ್ತ ಪ್ರವೇಶ ಲೇಖನವಾಗಿದ್ದು, ಅಂತಿಮ ಬಳಕೆಯು ವಾಣಿಜ್ಯ ಲಾಭಕ್ಕಾಗಿ ಅಲ್ಲದಿರುವವರೆಗೆ ಮತ್ತು ಮೂಲ ಕೃತಿ ಸರಿಯಾಗಿದೆ ಎಂಬ ಪ್ರಮೇಯವಿರುವವರೆಗೆ ಯಾವುದೇ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಬಳಕೆ, ವಿತರಣೆ ಮತ್ತು ಪುನರುತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ. ಉಲ್ಲೇಖ.
ಗಮನಿಸಿ: ನೀವು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಿದ ವ್ಯಕ್ತಿಗೆ ನೀವು ಇಮೇಲ್ ಅನ್ನು ನೋಡಬೇಕೆಂದು ಬಯಸುತ್ತೀರಿ ಮತ್ತು ಅದು ಸ್ಪ್ಯಾಮ್ ಅಲ್ಲ ಎಂದು ತಿಳಿಯುವಂತೆ ನಿಮ್ಮ ಇಮೇಲ್ ವಿಳಾಸವನ್ನು ಒದಗಿಸುವಂತೆ ಮಾತ್ರ ನಾವು ಕೇಳುತ್ತೇವೆ. ನಾವು ಯಾವುದೇ ಇಮೇಲ್ ವಿಳಾಸಗಳನ್ನು ಸೆರೆಹಿಡಿಯುವುದಿಲ್ಲ.
ನೀವು ಸಂದರ್ಶಕರೇ ಎಂಬುದನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ಮತ್ತು ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಸ್ಪ್ಯಾಮ್ ಸಲ್ಲಿಕೆಯನ್ನು ತಡೆಯಲು ಈ ಪ್ರಶ್ನೆಯನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಸೋಫಿಯಾ ರೊಡ್ರಿಗಸ್-ಗಲ್ಲಾರ್ಡೊ, ಕಜುವೊ ಕುರೊಕಾವಾ, ಸುಸಾನಾ ಸಬಿಡೊ-ಬೋಜೊ, ಅಲೆಜಾಂಡ್ರೊ ಕೊರ್ಟೆಜ್ · ಗೊಮೆಜ್ (ಅಲೆಜಾಂಡ್ರೊ ಕೊರ್ಟೆಸ್-ಗೊಮೆಜ್), ಅಟ್ಸುಕೊ ಇಕೆಡಾ (ಅಟ್ಸುಕೊ ಇಕೆಡಾ), ವಲೇರಿಯಾ ಝೊನಿ (ವಲೇರಿಯಾ ಝೊನಿ), ಆಕ್ಸಿಲಿಯಾಡೊರಾ ಅಗುಲೆರೊಜ್ ಮರಿಯೊರೊಮೆರೊ, (ಸೆರ್ಗಿಯೋ ಲೋಪೆಜ್), ಮಿಹೋ ವಾಗಾ (ಮಿಹೋ ವಾಗಾ), ಮಿಸಾಕೊ ಅರ್ಮಾನ್ (ಮಿಸಾಕೊ ಅರ್ಮಾನ್), ಮಿಯಾಕೊ ರಿಮಾನ್ (ಮಿಯಾಕೊ ರಿಮಾನ್), ಪ್ರೊವ್ ಅಕಿರಾ, ಸ್ಟೆಫಾನೊ ಫ್ಯಾನಿ, ಅಕಿಹಿಕೊ ನಕಾನೊ, ಮ್ಯಾನುಯೆಲ್ ಮುನಿಜ್
ಆಯ್ದ ಔಟ್‌ಪುಟ್ ಸೈಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ವಿಂಗಡಣೆಗಾಗಿ ಸೆರಾಮೈಡ್ ಸರಪಳಿ ಉದ್ದದ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು 3D ಹೈ-ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ನೈಜ-ಸಮಯದ ಚಿತ್ರಣವು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸುತ್ತದೆ.
ಸೋಫಿಯಾ ರೊಡ್ರಿಗಸ್-ಗಲ್ಲಾರ್ಡೊ, ಕಜುವೊ ಕುರೊಕಾವಾ, ಸುಸಾನಾ ಸಬಿಡೊ-ಬೋಜೊ, ಅಲೆಜಾಂಡ್ರೊ ಕೊರ್ಟೆಜ್ · ಗೊಮೆಜ್ (ಅಲೆಜಾಂಡ್ರೊ ಕೊರ್ಟೆಸ್-ಗೊಮೆಜ್), ಅಟ್ಸುಕೊ ಇಕೆಡಾ (ಅಟ್ಸುಕೊ ಇಕೆಡಾ), ವಲೇರಿಯಾ ಝೊನಿ (ವಲೇರಿಯಾ ಝೊನಿ), ಆಕ್ಸಿಲಿಯಾಡೊರಾ ಅಗುಲೆರೊಜ್ ಮರಿಯೊರೊಮೆರೊ, (ಸೆರ್ಗಿಯೋ ಲೋಪೆಜ್), ಮಿಹೋ ವಾಗಾ (ಮಿಹೋ ವಾಗಾ), ಮಿಸಾಕೊ ಅರ್ಮಾನ್ (ಮಿಸಾಕೊ ಅರ್ಮಾನ್), ಮಿಯಾಕೊ ರಿಮಾನ್ (ಮಿಯಾಕೊ ರಿಮಾನ್), ಪ್ರೊವ್ ಅಕಿರಾ, ಸ್ಟೆಫಾನೊ ಫ್ಯಾನಿ, ಅಕಿಹಿಕೊ ನಕಾನೊ, ಮ್ಯಾನುಯೆಲ್ ಮುನಿಜ್
ಆಯ್ದ ಔಟ್‌ಪುಟ್ ಸೈಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ವಿಂಗಡಣೆಗಾಗಿ ಸೆರಾಮೈಡ್ ಸರಪಳಿ ಉದ್ದದ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು 3D ಹೈ-ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ನೈಜ-ಸಮಯದ ಚಿತ್ರಣವು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸುತ್ತದೆ.
©2020 ಅಮೇರಿಕನ್ ಅಸೋಸಿಯೇಷನ್ ​​ಫಾರ್ ದಿ ಅಡ್ವಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಟ್ ಆಫ್ ಸೈನ್ಸ್. ಎಲ್ಲಾ ಹಕ್ಕುಗಳನ್ನು ಕಾಯ್ದಿರಿಸಲಾಗಿದೆ. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ಮತ್ತು COUNTER ನ ಪಾಲುದಾರ. ಸೈನ್ಸ್ ಅಡ್ವಾನ್ಸ್ ISSN 2375-2548.