Nature.com ಗೆ ಭೇಟಿ ನೀಡಿದ್ದಕ್ಕಾಗಿ ಧನ್ಯವಾದಗಳು. ನೀವು ಬಳಸುತ್ತಿರುವ ಬ್ರೌಸರ್ ಆವೃತ್ತಿಯು CSS ಗೆ ಸೀಮಿತ ಬೆಂಬಲವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ. ಉತ್ತಮ ಅನುಭವಕ್ಕಾಗಿ, ನೀವು ನವೀಕರಿಸಿದ ಬ್ರೌಸರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಬೇಕೆಂದು ನಾವು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡುತ್ತೇವೆ (ಅಥವಾ ಇಂಟರ್ನೆಟ್ ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ಲೋರರ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೊಂದಾಣಿಕೆ ಮೋಡ್ ಅನ್ನು ಆಫ್ ಮಾಡಿ). ಈ ಮಧ್ಯೆ, ನಿರಂತರ ಬೆಂಬಲವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು, ನಾವು ಶೈಲಿಗಳು ಮತ್ತು ಜಾವಾಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಇಲ್ಲದೆ ಸೈಟ್ ಅನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತೇವೆ.
ಕಶೇರುಕಗಳಿಗಿಂತ ಭಿನ್ನವಾಗಿ, ಕೀಟಗಳಲ್ಲಿ ಪುರುಷ-ಪಕ್ಷಪಾತದ ಲೈಂಗಿಕ ಸ್ಟೀರಾಯ್ಡ್ ಹಾರ್ಮೋನುಗಳು ಇರುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಭಾವಿಸಲಾಗಿದೆ. ಅನಾಫಿಲಿಸ್ ಗ್ಯಾಂಬಿಯಾದಲ್ಲಿ, ಎಕ್ಡಿಸೋನ್ ಸ್ಟೀರಾಯ್ಡ್ 20-ಹೈಡ್ರಾಕ್ಸಿಎಕ್ಡಿಸೋನ್ (20E) ಹೆಣ್ಣುಗಳಿಂದ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲ್ಪಟ್ಟಾಗ ಮೊಟ್ಟೆಯ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಲು ಮತ್ತು ಗಂಡುಗಳಿಂದ ಲೈಂಗಿಕವಾಗಿ ವರ್ಗಾವಣೆಯಾದಾಗ ಸಂಯೋಗ ವಕ್ರೀಭವನ ಅವಧಿಯನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸಲು ವಿಕಸನಗೊಂಡಂತೆ ಕಂಡುಬರುತ್ತದೆ3. ಮೊಟ್ಟೆಯ ಬೆಳವಣಿಗೆ ಮತ್ತು ಸಂಯೋಗವು ಅತ್ಯಗತ್ಯ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಲಕ್ಷಣಗಳಾಗಿರುವುದರಿಂದ, ಹೆಣ್ಣು ಅನಾಫಿಲಿಸ್ ಸೊಳ್ಳೆಗಳು ಈ ಹಾರ್ಮೋನುಗಳ ಸಂಕೇತಗಳನ್ನು ಹೇಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸುತ್ತವೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳುವುದು ಹೊಸ ಮಲೇರಿಯಾ ನಿಯಂತ್ರಣ ಕಾರ್ಯಕ್ರಮಗಳ ವಿನ್ಯಾಸವನ್ನು ಸುಗಮಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ. ಇಲ್ಲಿ, ಈ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಕಾರ್ಯಗಳನ್ನು ಎಕ್ಡಿಸ್ಟರಾಯ್ಡ್-ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವ/ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವ ಕಿಣ್ವಗಳ ಸಂಕೀರ್ಣ ಜಾಲದ ಮೂಲಕ ವಿಭಿನ್ನ ಲೈಂಗಿಕ ಸ್ಟೀರಾಯ್ಡ್‌ಗಳಿಂದ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸುತ್ತೇವೆ. ಲೈಂಗಿಕ ವರ್ಗಾವಣೆ ಮತ್ತು ಡಿಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಮೂಲಕ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯ ನಂತರ ಸ್ತ್ರೀ ಲೈಂಗಿಕ ಗ್ರಹಿಕೆಯನ್ನು ಸ್ಥಗಿತಗೊಳಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪೋಷಕರನ್ನು ರಕ್ಷಿಸುವ ಪುರುಷ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಆಕ್ಸಿಡೀಕೃತ ಎಕ್ಡಿಸೋನ್, 3-ಡಿಹೈಡ್ರೊ-20E (3D20E) ಅನ್ನು ನಾವು ಗುರುತಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, 3D20E ವರ್ಗಾವಣೆಯು ಪ್ಲಾಸ್ಮೋಡಿಯಂ ಸೋಂಕಿನ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಮೊಟ್ಟೆಯ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುವ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಜೀನ್‌ಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ, ಸೋಂಕಿತ ಹೆಣ್ಣುಗಳ ಆರೋಗ್ಯವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸುತ್ತದೆ. ಹೆಣ್ಣು-ಪಡೆದ 20E ಲೈಂಗಿಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುವುದಿಲ್ಲ, ಆದರೆ 20E-ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುವ ಕೈನೇಸ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಿದ ನಂತರ ಸಂಯೋಗದ ವ್ಯಕ್ತಿಗಳು ಮೊಟ್ಟೆಗಳನ್ನು ಇಡಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ. ಈ ಪುರುಷ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಕೀಟ ಸ್ಟೀರಾಯ್ಡ್ ಹಾರ್ಮೋನ್‌ನ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಸ್ತ್ರೀ ಲೈಂಗಿಕ ಗ್ರಹಿಕೆ, ಫಲವತ್ತತೆ ಮತ್ತು ಪ್ಲಾಸ್ಮೋಡಿಯಂನೊಂದಿಗಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವಲ್ಲಿ ಅದರ ಪಾತ್ರವು ಮಲೇರಿಯಾ-ಹರಡುವ ಸೊಳ್ಳೆಗಳ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಯಶಸ್ಸನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಮಾನವ ಮಲೇರಿಯಾ ಪರಾವಲಂಬಿಗಳ ಏಕೈಕ ವಾಹಕವಾದ ಅನಾಫಿಲಿಸ್ ಸೊಳ್ಳೆಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಾಪಕವಾದ ಕೀಟನಾಶಕ ನಿರೋಧಕತೆಯಿಂದಾಗಿ ಮಲೇರಿಯಾ ಪ್ರಕರಣಗಳು ಮತ್ತು ಸಾವುಗಳು ಮತ್ತೆ ಹೆಚ್ಚುತ್ತಿವೆ4. ಈ ಸೊಳ್ಳೆಗಳ ಸಂಯೋಗ ಜೀವಶಾಸ್ತ್ರವು ಹೊಸ ಮಲೇರಿಯಾ ನಿಯಂತ್ರಣ ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಗಳಿಗೆ ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಆಕರ್ಷಕ ಗುರಿಯಾಗಿದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಹೆಣ್ಣುಗಳು ಒಮ್ಮೆ ಮಾತ್ರ ಸಂಯೋಗ ಮಾಡುತ್ತವೆ5; ಈ ಒಂದೇ ಸಂಯೋಗದ ಘಟನೆಯನ್ನು ಬರಡಾದಂತೆ ಮಾಡುವುದರಿಂದ ಹೊಲದಲ್ಲಿ ಸೊಳ್ಳೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವಿರುತ್ತದೆ.
ಪುರುಷರಿಂದ ಹೆಚ್ಚಿನ ಟೈಟರ್ ಸ್ಟೀರಾಯ್ಡ್ ಹಾರ್ಮೋನುಗಳನ್ನು ಪಡೆದ ನಂತರ ಮಹಿಳೆಯರು ಲೈಂಗಿಕವಾಗಿ ಅಸಮರ್ಥರಾಗುತ್ತಾರೆ. ಮುಂದಿನ ಸಂಯೋಗದಲ್ಲಿ ತೊಂದರೆ ಉಂಟುಮಾಡುವ ಪ್ರಚೋದಕ 20-ಹೈಡ್ರಾಕ್ಸಿಎಕ್ಡಿಸೋನ್ (20E) ಎಂದು ಅಧ್ಯಯನಗಳು ತೋರಿಸಿವೆ, ಇದು ಲಾರ್ವಾ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಕರಗುವ ಚಕ್ರದ ನಿಯಂತ್ರಕ ಎಂದು ಕರೆಯಲ್ಪಡುವ ಸ್ಟೀರಾಯ್ಡ್ ಹಾರ್ಮೋನ್ ಆಗಿದೆ. 20E ಅನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸುವ ಮತ್ತು ವರ್ಗಾಯಿಸುವ ಪುರುಷರ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಅನಾಫಿಲಿಸ್ ಪ್ರಭೇದಗಳಲ್ಲಿ ವಿಕಸನಗೊಂಡಿದೆ, ಇದು ಆಫ್ರಿಕಾದಲ್ಲಿ ವಿತರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿರುವ ಮತ್ತು ಅನಾಫಿಲಿಸ್ ಗ್ಯಾಂಬಿಯಾ ಸೇರಿದಂತೆ ಮಲೇರಿಯಾದ ಅತ್ಯಂತ ಅಪಾಯಕಾರಿ ವಾಹಕಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಸೆಲ್ಲಿಯಾ7 ಉಪಜಾತಿಯ ಭಾಗವಾಗಿದೆ. ಇದು ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಈ ಜಾತಿಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಣ್ಣುಗಳು ಪ್ರತಿ ರಕ್ತದ ಊಟದ ನಂತರವೂ 20E ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು 20E ಓಜೆನೆಸಿಸ್ ಚಕ್ರವನ್ನು ನಡೆಸುತ್ತದೆ (ಉಲ್ಲೇಖ 8 ನೋಡಿ). ಆದಾಗ್ಯೂ, ಹೆಣ್ಣುಗಳು ತಮ್ಮ ಸ್ವಂತ ಸಂಯೋಗದ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ರಾಜಿ ಮಾಡಿಕೊಳ್ಳದೆ ಎಕ್ಡಿಸೋನ್‌ನ ಎರಡು ವಿಭಿನ್ನ ಮೂಲಗಳಿಂದ (ಪುರುಷ ವರ್ಗಾವಣೆ ಮತ್ತು ರಕ್ತ ಆಹಾರ ಪ್ರಚೋದನೆ) ಸಂಕೇತಗಳನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸುವ ವಿಧಾನದ ಬಗ್ಗೆ ಸ್ವಲ್ಪವೇ ತಿಳಿದಿಲ್ಲ. ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ಹೆಣ್ಣುಗಳು ಉತ್ಪಾದಿಸುವ 20E ಲೈಂಗಿಕ ಅಸಹಿಷ್ಣುತೆಯನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸಿದರೆ, ಇದು ಕನ್ಯೆ-ಆಹಾರ ನೀಡುವ ವ್ಯಕ್ತಿಗಳಲ್ಲಿ ಬಂಜೆತನಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ, ಈ ಸೊಳ್ಳೆಗಳಲ್ಲಿ ಇದು ತುಂಬಾ ಸಾಮಾನ್ಯವಾದ ನಡವಳಿಕೆಯಾಗಿದೆ5.
ಒಂದು ಸಂಭಾವ್ಯ ವಿವರಣೆಯೆಂದರೆ, A. ಗ್ಯಾಂಬಿಯಾ ಗಂಡುಗಳು ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಪುರುಷ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಎಕ್ಡಿಸೋನ್ ಅನ್ನು ವರ್ಗಾಯಿಸುತ್ತವೆ, ಇದು ಸ್ತ್ರೀ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಕ್ಯಾಸ್ಕೇಡ್ ಅನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಸಂಯೋಗದ ಅಸ್ಥಿರತೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಕಶೇರುಕಗಳು ಈಸ್ಟ್ರೊಜೆನ್ ಮತ್ತು ಆಂಡ್ರೊಜೆನ್‌ನಂತಹ ಬಹು ಸ್ಟೀರಾಯ್ಡ್ ಹಾರ್ಮೋನುಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದರೂ (ಉಲ್ಲೇಖ 9 ರಲ್ಲಿ ಪರಿಶೀಲಿಸಲಾಗಿದೆ), ನಮ್ಮ ಜ್ಞಾನದ ಪ್ರಕಾರ, ಆಂಡ್ರೊಜೆನಿಕ್-ಪಕ್ಷಪಾತ ಸ್ಟೀರಾಯ್ಡ್‌ಗಳನ್ನು ಕೀಟಗಳಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ.
ಲೈಂಗಿಕವಾಗಿ ಪ್ರಬುದ್ಧರಾದ A. ಗ್ಯಾಂಬಿಯಾ ಪುರುಷ ಪುರುಷ ಪರಿಕರ ಗ್ರಂಥಿಯಲ್ಲಿ (MAG) ಸ್ಟೀರಾಯ್ಡ್ ಹಾರ್ಮೋನುಗಳ ಸಂಗ್ರಹವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ನಾವು ಸಂಭಾವ್ಯ ಮಾರ್ಪಡಿಸುವ ಸ್ಟೀರಾಯ್ಡ್‌ಗಳನ್ನು ಹುಡುಕಲು ಹೊರಟಿದ್ದೇವೆ. ಹಿಂದೆ ಬಳಸಿದ ಕಡಿಮೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವಿಧಾನಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಾಗಿ, ಹೆಚ್ಚಿನ ಕಾರ್ಯಕ್ಷಮತೆಯ ದ್ರವ ವರ್ಣತಂತುಶಾಸ್ತ್ರವನ್ನು ಟಂಡೆಮ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ (HPLC-MS/MS) ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಿ, ಈ ಅಂಗಾಂಶದಲ್ಲಿ ಎಕ್ಡಿಸೋನ್ (E) ಮತ್ತು 20E ಅನ್ನು ನಾವು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಹಿಂದಿನ ಫಲಿತಾಂಶವನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸುತ್ತದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಮಾದರಿಯು 3-ಡಿಹೈಡ್ರೊ-20E-22-ಫಾಸ್ಫೇಟ್ (3D20E22P)12 (ಚಿತ್ರ 1) ಸೂತ್ರಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಆಕ್ಸಿಡೀಕೃತ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಟೆಡ್ ಸ್ಟೀರಾಯ್ಡ್‌ಗಳಿಂದ ಪ್ರಾಬಲ್ಯ ಹೊಂದಿತ್ತು. ಇತರ ರೂಪಗಳಲ್ಲಿ 3-ಡಿಹೈಡ್ರೊ-20E (3D20E) ಮತ್ತು 20E-22-ಫಾಸ್ಫೇಟ್ (20E22P) ಸೇರಿವೆ. 3D20E22P ಯ HPLC-MS/MS ಸಿಗ್ನಲ್ ತೀವ್ರತೆಯು ಅದರ ಡಿಫೊಸ್ಫೊರಿಲೇಟೆಡ್ ರೂಪವಾದ 3D20E ಗಿಂತ ಎರಡು ಆರ್ಡರ್‌ಗಳಷ್ಟು ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿತ್ತು ಮತ್ತು E ಮತ್ತು 20E ಗಿಂತ ಮೂರು ಆರ್ಡರ್‌ಗಳಷ್ಟು ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿತ್ತು (ಚಿತ್ರ 1).ದೇಹದ ಇತರ ಭಾಗಗಳಲ್ಲಿ ಮತ್ತು ಕೆಳಗಿನ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ (LRT; ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಚಿತ್ರ 1a). ಹೊಸದಾಗಿ ಮುಚ್ಚಿದ (<1 ದಿನ ವಯಸ್ಸಿನ) ಗಂಡು ಮತ್ತು ಹೆಣ್ಣುಗಳಲ್ಲಿ ಎಕ್ಡಿಸ್ಟೀರಾಯ್ಡ್‌ಗಳನ್ನು ನಾವು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು MAG ನಲ್ಲಿ ಮಾತ್ರ 3D20E ಮತ್ತು 3D20E22P ಅನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಿದ್ದೇವೆ; E, 20E ಮತ್ತು 20E22P ಎರಡೂ ಲಿಂಗಗಳಲ್ಲಿ ಇರುತ್ತವೆ (ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಚಿತ್ರ 1b).ಈ ದತ್ತಾಂಶವು A. ಗ್ಯಾಂಬಿಯಾ ವಯಸ್ಕ ಪುರುಷರು ತಮ್ಮ MAG ಗಳಲ್ಲಿ ಮಹಿಳೆಯರಿಂದ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲ್ಪಡದ ಮಾರ್ಪಡಿಸುವ ಹಾರ್ಮೋನುಗಳ ಹೆಚ್ಚಿನ ಟೈಟರ್‌ಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತಾರೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
MAG ಮತ್ತು ಹೆಣ್ಣು LRT (ಹೃತ್ಕರ್ಣ, ಸೆಮಿನಲ್ ವೆಸಿಕಲ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಪರೋವೇರಿಯಂ ಸೇರಿದಂತೆ) 4 ದಿನಗಳ (4 ದಿನಗಳ) ಕನ್ಯೆಯ ಗಂಡು ಮತ್ತು ಕನ್ಯೆ ಮತ್ತು ಸಂಯೋಗ ಹೊಂದಿದ ಹೆಣ್ಣು (0.5, 3, ಮತ್ತು 12 hpm) ಗಳಿಂದ ಛೇದಿಸಲಾಯಿತು. ಈ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿನ ಎಕ್ಡಿಸೋನ್ ಅನ್ನು HPLC-MS/MS (ಸರಾಸರಿ ± ಸೆಮ್; ಜೋಡಿಯಾಗದ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆ, ಎರಡು-ಬದಿಯ, ತಪ್ಪು ಆವಿಷ್ಕಾರ ದರ (FDR) ಸರಿಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ; NS, ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿಲ್ಲ; *P < 0.05, **P < 0.01 . 3D20E: 3 ಗಂಟೆಗಳು vs. 0.5 ಗಂಟೆಗಳು, P = 0.035; 12 ಗಂಟೆಗಳು vs. 3 ಗಂಟೆಗಳು, P = 0.0015; 12 ಗಂಟೆಗಳು vs. 0.5 ಗಂಟೆಗಳು, P = 0.030. 3D20E22P: 3 ಗಂಟೆಗಳು vs. 0.5 ಗಂಟೆಗಳು, P = 0.25; 12 ಗಂಟೆಗಳು vs. 3 ಗಂಟೆಗಳು, P = 0.0032; 12 ಗಂಟೆಗಳು vs. 0.5 ಗಂಟೆಗಳು, P = 0.015). ಮೂರು ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳಿಂದ ದತ್ತಾಂಶವನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ. ಆಸಕ್ತಿಯ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಎಕ್ಡಿಸೋನ್‌ನ ಗರಿಷ್ಠ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಸೊಳ್ಳೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯಿಂದ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಎಕ್ಡಿಸೋನ್ ಅನ್ನು ಈ ಕೆಳಗಿನಂತೆ ಬಣ್ಣದಿಂದ ಪ್ರತಿನಿಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ: E, ಹಸಿರು; 20E, ಕಿತ್ತಳೆ; 20E22P, ನೇರಳೆ; 3D20E, ನೀಲಿ; 3D20E22P, ಗುಲಾಬಿ. ಕಡಿಮೆ ಎಕ್ಡಿಸೋನ್ ಮಟ್ಟವನ್ನು ತೋರಿಸಲು ಇನ್ಸೆಟ್ y- ಅಕ್ಷದ ಮೇಲೆ ಮಾಪಕವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಸಂಯೋಗದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ 3D20E22P ಮತ್ತು 3D20E ವರ್ಗಾವಣೆಯಾಗಿದೆಯೇ ಎಂದು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲು, ನಾವು ಸಂಯೋಗದ ನಂತರ ವಿವಿಧ ಸಮಯ ಬಿಂದುಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಣ್ಣು LRT ಗಳನ್ನು ಛೇದಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಕನ್ಯೆಯರಲ್ಲಿ ಎಕ್ಡಿಸೋನ್ ಕಂಡುಬಂದಿಲ್ಲವಾದರೂ, ಸಂಯೋಗದ ನಂತರ ತಕ್ಷಣವೇ LRT ಯಲ್ಲಿ ಗಣನೀಯ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ 3D20E22P ಕಂಡುಬಂದಿದೆ (0.5 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ, hpm), ಕಾಲಾನಂತರದಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗುತ್ತದೆ, ಆದರೆ 3D20E ಮಟ್ಟಗಳು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಾದವು (ಚಿತ್ರ 1). ರಾಸಾಯನಿಕವಾಗಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾದ 3D20E ಅನ್ನು ಮಾನದಂಡವಾಗಿ ಬಳಸಿಕೊಂಡು, ಸಂಯೋಗ LRT ಗಳಲ್ಲಿ ಈ ಸ್ಟೀರಾಯ್ಡ್ ಹಾರ್ಮೋನ್ ಮಟ್ಟಗಳು 20E ಗಿಂತ ಕನಿಷ್ಠ 100 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಿವೆ ಎಂದು ನಾವು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ (ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಕೋಷ್ಟಕ 1). ಹೀಗಾಗಿ, 3D20E22P ಎಂಬುದು ಸಂಯೋಗದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಹೆಣ್ಣು LRT ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲ್ಪಡುವ ಪ್ರಮುಖ ಪುರುಷ ಎಕ್ಡಿಸೋನ್ ಆಗಿದೆ ಮತ್ತು ಅದರ ಡಿಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಟೆಡ್ ರೂಪ, 3D20E, ಸಂಯೋಗದ ನಂತರ ಸ್ವಲ್ಪ ಸಮಯದ ನಂತರ ಹೆಚ್ಚು ಹೇರಳವಾಗುತ್ತದೆ. ಇದು ಸ್ತ್ರೀ ಸಂಯೋಗದ ನಂತರದ ಜೀವಶಾಸ್ತ್ರದಲ್ಲಿ ನಂತರದ ಎಕ್ಡಿಸೋನ್‌ಗೆ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಕಸ್ಟಮ್-ನಿರ್ಮಿತ ಬಯೋಇನ್ಫರ್ಮ್ಯಾಟಿಕ್ಸ್ ಪೈಪ್‌ಲೈನ್ ಬಳಸಿ ಹೊಸ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ (ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ-ಸೀಕ್) ಡೇಟಾಸೆಟ್ ಅನ್ನು (ಚಿತ್ರ 2 ಎ) ರಚಿಸಿದ ನಂತರ, ನಾವು ಎಕ್ಡಿಸೋನ್ ಕೈನೇಸ್ (ಇಸಿಕೆ), ಎಕ್ಡಿಸೋನ್ ಆಕ್ಸಿಡೇಸ್ (ಇಒ) ಮತ್ತು ಎಕ್ಡಿಸೋನ್ ಎನ್‌ಕೋಡಿಂಗ್ 20 ಇ-ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಫಾಸ್ಫೇಟೇಸ್ ಜೀನ್‌ಗಾಗಿ ಹುಡುಕಿದೆವು. ಇಪಿಪಿ) ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತವಾಗುತ್ತದೆ. ನಾವು ಒಂದು ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ಇಪಿಪಿ ಜೀನ್ ಮತ್ತು ಎರಡು ಸಂಭಾವ್ಯ ಇಸಿಕೆ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು (ಇಸಿಕೆ 1 ಮತ್ತು ಇಸಿಕೆ 2) ಗುರುತಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಆದರೆ ಉತ್ತಮ ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ಇಒ ಜೀನ್ ಅನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗಲಿಲ್ಲ. ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, ಗ್ಯಾಂಬಿಯನ್ ಮ್ಯಾಗ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಇಪಿಪಿ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ (98.9 ನೇ ಶೇಕಡಾವಾರು) ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಆದರೆ ಸ್ತ್ರೀ ಎಲ್‌ಆರ್‌ಟಿಗಳಲ್ಲಿ ಅಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 2 ಬಿ), ಈ ಸ್ತ್ರೀ ಅಂಗಾಂಶದಲ್ಲಿ 3D20E22P ಯ ಡಿಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಸಂಭವಿಸಿದ್ದರಿಂದ ನಮ್ಮ ನಿರೀಕ್ಷೆಗಳಿಗೆ ವಿರುದ್ಧವಾಗಿ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಸಂಯೋಗದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಪುರುಷ ಇಪಿಪಿಯನ್ನು ವರ್ಗಾಯಿಸಬಹುದು ಎಂದು ನಾವು ನಂಬುತ್ತೇವೆ. ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ಸಂಯೋಗದ ನಂತರ ಸ್ತ್ರೀ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಮರೆಮಾಚಲು ನಾವು ಇನ್ ವಿವೋ ಸ್ಥಿರ ಐಸೊಟೋಪ್ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ, ಸ್ತ್ರೀ ಹೃತ್ಕರ್ಣದಲ್ಲಿ ಎಂಎಸ್ ಗುರುತಿಸಿದ ಕಿಣ್ವ (ಚಿತ್ರ 2 ಸಿ ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 1). MAG ಮತ್ತು ಸಂಯೋಗ ಹೊಂದಿದ (ಆದರೆ ಕನ್ಯೆಯಲ್ಲದ) ಮಹಿಳಾ LRT ಯಲ್ಲಿ EPP ಇರುವಿಕೆಯನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ದೃಢಪಡಿಸಲಾಯಿತು (ಚಿತ್ರ 2d).
a, EcKಗಳು, EOಗಳು ಮತ್ತು EPPಗಳನ್ನು ಎನ್ಕೋಡಿಂಗ್ ಮಾಡುವ ಜೀನ್‌ಗಳಿಗಾಗಿ ಪ್ರತಿ ಲಿಂಗದ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಅಂಗಾಂಶಗಳನ್ನು ಹುಡುಕಲು ಕಸ್ಟಮ್-ನಿರ್ಮಿತ ಬಯೋಇನ್ಫರ್ಮ್ಯಾಟಿಕ್ಸ್ ಪೈಪ್‌ಲೈನ್. ಬಾಣಗಳ ಪಕ್ಕದಲ್ಲಿರುವ ಸಂಖ್ಯೆಗಳು ಪ್ರತಿ ಹಂತದಲ್ಲೂ ಪುರುಷ ಮತ್ತು ಸ್ತ್ರೀ ಅಭ್ಯರ್ಥಿಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ. ಈ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಪುರುಷರಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತವಾಗುವ ಒಂದು EPP ಜೀನ್ (EPP) ಮತ್ತು ಒಂದು EcK ಜೀನ್ (EcK1) ಮತ್ತು ಎರಡೂ ಲಿಂಗಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತವಾಗುವ ಆದರೆ ಅಭ್ಯರ್ಥಿ EO ಜೀನ್ ಅನ್ನು ನೀಡದ ಒಂದು EcK ಜೀನ್ (EcK2) ಅನ್ನು ಗುರುತಿಸಿದೆ.b, ವರ್ಜಿನ್ (V) ಮತ್ತು ಸಂಯೋಗ (M) ಅನೋಫಿಲಿಸ್ ಗ್ಯಾಂಬಿಯಾ ಮತ್ತು ಅನೋಫಿಲಿಸ್ ಅಲ್ಬಿಕಾನ್ಸ್ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿ ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಹೋಲಿಸುವ ಹೀಟ್‌ಮ್ಯಾಪ್.Spca, ಫಲೀಕರಣ; MAGಗಳು, ಪುರುಷರಲ್ಲಿ ಸಹಾಯಕ ಗ್ರಂಥಿಗಳು; ಸ್ತನಗಳು, ರೆಕ್ಕೆಗಳು, ಕಾಲುಗಳು, ಕೊಬ್ಬಿನ ದೇಹಗಳು ಮತ್ತು ಎರಡೂ ಲಿಂಗಗಳಲ್ಲಿನ ಆಂತರಿಕ ಅಂಗಗಳು ಮತ್ತು ಮಹಿಳೆಯರಲ್ಲಿ ಅಂಡಾಶಯಗಳು ಸೇರಿದಂತೆ ದೇಹದ ಇತರ ಭಾಗಗಳು. ಗ್ಯಾಂಬಿಯಾದ MAG ಮತ್ತು ಹೃತ್ಕರ್ಣ ಎರಡರಲ್ಲೂ EcK2 ಹೆಚ್ಚು ವ್ಯಕ್ತವಾಗುತ್ತದೆ, ಆದರೆ EPP MAG.c ನಲ್ಲಿ ಮಾತ್ರ ಕಂಡುಬರುತ್ತದೆ, 3, 12 ಮತ್ತು 24 hpm ನಲ್ಲಿ ಪುರುಷ ಸ್ಖಲನ ಗುಂಪು ಸ್ತ್ರೀ ಹೃತ್ಕರ್ಣಕ್ಕೆ ವರ್ಗಾವಣೆಯ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ, ಇದು 67 ಹೆಚ್ಚು ಹೇರಳವಾಗಿರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲು (ಮತ್ತು ಮರೆಮಾಚಲು) 15N ಹೊಂದಿರುವ ಆಹಾರದಲ್ಲಿ ಹೆಣ್ಣುಗಳನ್ನು ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು. ಟ್ಯಾಗ್ ಮಾಡದ ಗಂಡುಗಳನ್ನು ಟ್ಯಾಗ್ ಮಾಡಲಾದ ಹೆಣ್ಣುಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಗ ಮಾಡಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಹೆಣ್ಣು LRT ಗಳನ್ನು ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ 3, 12 ಮತ್ತು 24 hpm ನಲ್ಲಿ ವಿಭಜಿಸಲಾಯಿತು (ಸ್ಖಲನ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಸಂಪೂರ್ಣ ಪಟ್ಟಿಗಾಗಿ ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 1 ನೋಡಿ). ಈ ಅಂಗಾಂಶಗಳ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ಕನ್ಯೆಯ ಪುರುಷರ MAG ನಲ್ಲಿ ಇನ್ಸೆಟ್, EPP, Eck1 ಮತ್ತು EcK2 ಪತ್ತೆಯಾಗಿವೆ.d, EPP ಅನ್ನು ಸಂಯೋಗಗೊಂಡ ಹೆಣ್ಣುಗಳ MAG ಮತ್ತು LRT ಯಲ್ಲಿ ವೆಸ್ಟರ್ನ್ ಬ್ಲಾಟ್ ಮೂಲಕ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ಕನ್ಯೆಯ ಮಹಿಳೆಯರು ಅಥವಾ ಪುರುಷರು ಅಥವಾ ಉಳಿದ ಸ್ತ್ರೀಯರಲ್ಲಿ ಅಲ್ಲ. ದೇಹದ ಪೊರೆಗಳನ್ನು ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ಆಂಟಿ-ಆಕ್ಟಿನ್ (ಲೋಡಿಂಗ್ ಕಂಟ್ರೋಲ್) ಮತ್ತು ಆಂಟಿ-ಇಪಿಪಿ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು. ಎಲ್ಲಾ ಪುರುಷರು ಕನ್ಯೆಯರು. ಜೆಲ್ ಮೂಲ ದತ್ತಾಂಶಕ್ಕಾಗಿ ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 1 ನೋಡಿ. ಪಾಶ್ಚಾತ್ಯ ಬ್ಲಾಟ್‌ಗಳನ್ನು ಎರಡು ಬಾರಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ನೀಡಲಾಯಿತು.
MAG ನಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾದ 3D20E22P ಯೊಂದಿಗೆ HPLC-MS/MS ಮೂಲಕ EPP ಯ ಎಕ್ಡಿಸ್ಟರಾಯ್ಡ್ ಫಾಸ್ಫೋಫಾಸ್ಫೇಟೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಲಾಯಿತು (ವಿಸ್ತೃತ ಡೇಟಾ ಚಿತ್ರ 2a). ಇದಲ್ಲದೆ, ನಾವು RNA-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ಹಸ್ತಕ್ಷೇಪದಿಂದ (RNAi) EPP ಅನ್ನು ನಿಶ್ಯಬ್ದಗೊಳಿಸಿದಾಗ, ಈ ಪುರುಷರ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿ ಫಾಸ್ಫೇಟೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಬಲವಾದ ಕಡಿತವನ್ನು ನಾವು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 3a), ಮತ್ತು EPP-ನಿಶ್ಯಬ್ದಗೊಳಿಸಿದ ಪುರುಷರೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಗಗೊಂಡ ಹೆಣ್ಣುಗಳು ಭಾಗಶಃ ಜೀನ್ ನಿಶ್ಯಬ್ದಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯ ಹೊರತಾಗಿಯೂ ಡಿಫಾಸ್ಫೋರಿಲೇಟೆಡ್ 3D20E (ಚಿತ್ರ 3b) ನ ಕಡಿಮೆ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ತೋರಿಸಿವೆ (ವಿಸ್ತೃತ ಡೇಟಾ ಚಿತ್ರ 2b,c). ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, ಅದೇ ಸೊಳ್ಳೆಗಳಲ್ಲಿ 20E22P/20E ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ನಾವು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಿಲ್ಲ, ಇದು ಕಿಣ್ವವು 3D20E22P ಗೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 3b).
a, ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ EPP RNA (dsEPP) ಅಥವಾ ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ GFP RNA (dsGFP) ನಿಯಂತ್ರಣಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು EPP ಸೈಲೆನ್ಸಿಂಗ್‌ನಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ MAG ನಲ್ಲಿ ಫಾಸ್ಫೇಟೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ. ಪ್ರತಿ ಪ್ರತಿಕೃತಿಯಲ್ಲಿ ಇಪ್ಪತ್ತು MAG ಪೂಲ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ (P = 0.0046, ಜೋಡಿಯಾದ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆ, ಎರಡು-ಬದಿಯ), ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಚುಕ್ಕೆಗಳಿಂದ ಪ್ರತಿನಿಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.b, EPP-ಸೈಲೆನ್ಸ್ಡ್ ಪುರುಷರೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಗಗೊಂಡ ಹೆಣ್ಣುಗಳು 3 hpm ನಲ್ಲಿ ಡಿಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಟೆಡ್ 3D20E ನ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದವು (P = 0.0043, ಜೋಡಿಯಾಗದ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆ, ಎರಡು-ಬದಿಯ), ಆದರೆ 20E ಮಟ್ಟಗಳು ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಲಿಲ್ಲ (P = 0.063, ಜೋಡಿಯಾಗದ). ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆ, ಎರಡು-ಬದಿಯ). ತಲಾ 13, 16 ಮತ್ತು 19 ಹೆಣ್ಣುಗಳ ಮೂರು ಪೂಲ್‌ಗಳಿಂದ ಡೇಟಾವನ್ನು ಸರಾಸರಿ ± ಸೆಮ್ ಆಗಿ ಪ್ರಸ್ತುತಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸಿ, ಇಪಿಪಿ-ಮೌನಗೊಳಿಸಿದ ಗಂಡುಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಗ ಮಾಡಿದ ಹೆಣ್ಣುಗಳು ಮರು-ಸಂಯೋಗದ ದರಗಳನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೊಂದಿದ್ದವು (ಪಿ = 0.0002, ಫಿಶರ್‌ನ ನಿಖರ ಪರೀಕ್ಷೆ, ಎರಡು-ಬದಿಯ). ಹೆಣ್ಣುಗಳನ್ನು ಮೊದಲು ತಮ್ಮ ಸಂಯೋಗದ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಸಂಯೋಗ ಮಾಡಲು ಒತ್ತಾಯಿಸಲಾಯಿತು; 2 ದಿನಗಳ ನಂತರ, ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಜೆನಿಕ್ ವೀರ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಇತರ ಪುರುಷರೊಂದಿಗೆ ಅವರನ್ನು ಸಂಪರ್ಕಿಸಲಾಯಿತು, ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಜೀನ್‌ನ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಪಿಸಿಆರ್ ಪತ್ತೆಯ ಮೂಲಕ ಮರು-ಸಂಯೋಗ ದರಗಳನ್ನು ನಿರ್ಣಯಿಸಲು. ಇಪಿಪಿ-ಮೌನಗೊಳಿಸಿದ ಪುರುಷರೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಗ ಮಾಡಿದ ರಕ್ತ-ಪಾನೀಯ ಹೆಣ್ಣುಗಳು ಫಲವತ್ತತೆಯನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿದ್ದವು (ಪಿ < 0.0001; ಮನ್-ವಿಟ್ನಿ ಪರೀಕ್ಷೆ, ಎರಡು-ಬದಿಯ) ಮತ್ತು ಸ್ವಲ್ಪ ಕಡಿಮೆಯಾದ ಮೊಟ್ಟೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ (ಪಿ = 0.088, ಮನ್-ವಿಟ್ನಿ ಪರೀಕ್ಷೆ, ಎರಡು-ಬದಿಯ), ಆದರೆ ಮೊಟ್ಟೆಯಿಡುವ ದರವು ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಲಿಲ್ಲ (ಪಿ = 0.94, ಫಿಶರ್‌ನ ನಿಖರ ಪರೀಕ್ಷೆ, ಎರಡು-ಬದಿಯ). ಎಲ್ಲಾ ಪ್ಯಾನೆಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ, n ಜೈವಿಕವಾಗಿ ಸ್ವತಂತ್ರ ಸೊಳ್ಳೆ ಮಾದರಿಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ.ಎನ್ಎಸ್, ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿಲ್ಲ.*ಪಿ < 0.05, **ಪಿ < 0.01, ***ಪಿ < 0.001, ****ಪಿ < 0.001.
ಮುಂದೆ, ಹೆಣ್ಣುಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಯೋಗ ಪ್ರತಿರೋಧವನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡಲು ಎಕ್ಡಿಸೋನ್ ಡಿಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಮುಖ್ಯವೇ ಎಂದು ನಾವು ನಿರ್ಣಯಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, ಹೆಚ್ಚುವರಿ (ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಜೆನಿಕ್) ಗಂಡುಗಳಿಗೆ ಒಡ್ಡಿಕೊಂಡಾಗ ನಿಯಂತ್ರಣ ಹೆಣ್ಣುಗಳಿಗಿಂತ (10.4%) ಹೆಚ್ಚಿನ ಆವರ್ತನದಲ್ಲಿ (44.9%) ಮರು-ಸಂಯೋಗ ಮಾಡಿದ EPP-ಕ್ಷೀಣಿಸಿದ ಗಂಡುಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಗ ಮಾಡಿದ ಹೆಣ್ಣುಗಳು (ಚಿತ್ರ 3c). ಫಲವತ್ತತೆಯಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಇಳಿಕೆ (ಚಿತ್ರ 3d, ಎಡ) ಮತ್ತು ಈ ಹೆಣ್ಣುಗಳು ಹಾಕಿದ ಮೊಟ್ಟೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿ ಸ್ವಲ್ಪ ಇಳಿಕೆ (ಚಿತ್ರ 3d, ಮಧ್ಯ) ಕಂಡುಬಂದಿದೆ, ಆದರೆ ಹೆಣ್ಣುಗಳು ಹಾಕಿದ ಮೊಟ್ಟೆಗಳ ಶೇಕಡಾವಾರು (ಸಂಯೋಗದ ಮೂಲಕ ಹೆಣ್ಣುಗಳಲ್ಲಿ ಹೊರಹೊಮ್ಮುವ ಮತ್ತೊಂದು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ)) ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಲಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 3d, ಬಲ). 3D20E22P ಗಾಗಿ EPP ಯ ಗಮನಿಸಿದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ನೀಡಿದರೆ, ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಸಂಯೋಗದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾದ EPP ಯಿಂದ 3D20E ನ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯು ಮತ್ತಷ್ಟು ಸಂಯೋಗಕ್ಕೆ ಸ್ತ್ರೀ ಗ್ರಹಿಕೆಯನ್ನು ಆಫ್ ಮಾಡುವಲ್ಲಿ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಹೊಂದಿರಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಈ ಹಿಂದೆ 20E ನ ಲೈಂಗಿಕ ವರ್ಗಾವಣೆಗೆ ಕಾರಣವಾದ ನಡವಳಿಕೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಈ ಪುರುಷ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಹಾರ್ಮೋನ್ ಸ್ತ್ರೀ ಫಲವತ್ತತೆಯನ್ನು ಬಲವಾಗಿ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ.
ಮುಂದೆ, ರಾಸಾಯನಿಕವಾಗಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ 3D20E (ಚಿತ್ರ 4a–c) ಮತ್ತು ವಾಣಿಜ್ಯಿಕವಾಗಿ ಲಭ್ಯವಿರುವ 20E ಬಳಸಿ ಲೈಂಗಿಕವಾಗಿ ಪ್ರಬುದ್ಧ ಕನ್ಯೆಯರಲ್ಲಿ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ 20E ಮತ್ತು 3D20E ಚಟುವಟಿಕೆಗಳನ್ನು ನಾವು ಹೋಲಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಎರಡೂ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ (ಚಿತ್ರ 4d) ಸಂಯೋಗಕ್ಕೆ ಸ್ತ್ರೀ ಸಂವೇದನೆಯನ್ನು ಸ್ಥಗಿತಗೊಳಿಸುವಲ್ಲಿ 3D20E 20E ಗಿಂತ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, LRT ಯಲ್ಲಿ 3D20E ನ ಅರ್ಧದಷ್ಟು ಶಾರೀರಿಕ ಮಟ್ಟ (1,066 ಪುಟಗಳು ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ನಂತರ vs. 2,022 ಪುಟಗಳು ಸಂಯೋಗದ ನಂತರ) ವಕ್ರೀಭವನದ ಹೆಣ್ಣುಗಳ ಅನುಪಾತವನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸಿತು, ಇದು 20E (361 ಪುಟಗಳು ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ನಂತರ) ಶಾರೀರಿಕ ಮಟ್ಟಕ್ಕಿಂತ 20 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ, ಇದು 24 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ ಅತ್ಯಧಿಕ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ 18 ಪುಟಗಳಲ್ಲಿ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ನಂತರ; ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಕೋಷ್ಟಕ 1).ಈ ಫಲಿತಾಂಶವು 20E ನ ಲೈಂಗಿಕ ವರ್ಗಾವಣೆಯು ಸಂಯೋಗದ ವಕ್ರೀಭವನ ಅವಧಿಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುವುದಿಲ್ಲ ಎಂಬ ಕಲ್ಪನೆಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪೋಷಕರು-ಮಗುವಿನ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳುವಲ್ಲಿ ಪ್ರಮುಖ ಅಂಶವಾಗಿ 3D20E ಅನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಕನ್ಯೆಯ ಹೆಣ್ಣುಗಳಲ್ಲಿ ಮೊಟ್ಟೆ ಇಡುವ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳಲ್ಲಿ 3D20E 20E ಗಿಂತ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚು ಸಕ್ರಿಯವಾಗಿತ್ತು (ಚಿತ್ರ 4e), ಭಾಗಶಃ EPP ಮೌನದ ನಂತರ ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ ಸಾಮಾನ್ಯ ಮೊಟ್ಟೆ ಇಡುವ ದರವು ಸಂಯೋಗ-ಪ್ರೇರಿತ ಸ್ತ್ರೀ ಅಂಶಗಳಿಂದ ಇನ್ನೂ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ಉಳಿದ 3D20E ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಿಂದಾಗಿ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
(a,b) 20E ನಿಂದ ರಾಸಾಯನಿಕವಾಗಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾದ 3D20E (a) ಅತಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪರಿವರ್ತನೆ/ದಕ್ಷತೆಯೊಂದಿಗೆ (ಮೂರು ಸ್ವತಂತ್ರ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಿಂದ ಸರಾಸರಿ ± sem ಎಂದು ಪ್ರಸ್ತುತಪಡಿಸಲಾದ ಡೇಟಾ) (b).c, ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್ (ಕೆಳಗಿನ ಅರ್ಧ) ನಿಖರವಾಗಿ ಸಂಯೋಗಗೊಂಡ ಹೆಣ್ಣು LRT (ಮೇಲಿನ ಅರ್ಧ) ದಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಎಕ್ಡಿಸೋನ್‌ಗೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುತ್ತದೆ.d, 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; ಫಿಷರ್‌ನ ನಿಖರ ಪರೀಕ್ಷೆ, ಎರಡು-ಬದಿಯ) ಮತ್ತು 10% ಎಥೆನಾಲ್ (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; ಫಿಷರ್‌ನ ನಿಖರ ಪರೀಕ್ಷೆ, 2-ಬದಿಯ) ನೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, 20E ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಮಾತ್ರ ನಿಯಂತ್ರಣಕ್ಕಿಂತ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿತ್ತು (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; ಫಿಶರ್‌ನ ನಿಖರ ಪರೀಕ್ಷೆ, 2-ಬದಿಯ).e, 3D20E ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ 10% ಎಥೆನಾಲ್ ನಿಯಂತ್ರಣಗಳಿಗಿಂತ ಕನ್ಯೆಯ ಹೆಣ್ಣುಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮೊಟ್ಟೆಯಿಡುವ ದರಗಳನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸಿತು (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; ಫಿಶರ್‌ನ ನಿಖರ ಪರೀಕ್ಷೆ, ಎರಡು-ಬದಿಯ), ಆದರೆ 20E ನಿಯಂತ್ರಣಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಮಾತ್ರ (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; ಫಿಶರ್‌ನ ನಿಖರ ಪರೀಕ್ಷೆ, ಎರಡು-ಬದಿಯ).3D20E ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ 20E ಗಿಂತ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮೊಟ್ಟೆಯಿಡುವ ದರಗಳನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸಿತು (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; ಫಿಶರ್‌ನ ನಿಖರ ಪರೀಕ್ಷೆ, ಎರಡು-ಬದಿಯ).ಎಲ್ಲಾ ಪ್ಯಾನೆಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ, n ಜೈವಿಕವಾಗಿ ಸ್ವತಂತ್ರ ಸೊಳ್ಳೆ ಮಾದರಿಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ.NS, ಅಲ್ಲ ಗಮನಾರ್ಹ.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. ಡೇಟಾ ಮೂರು ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳಿಂದ ಬಂದಿದೆ.
ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳಲ್ಲಿ, ಸ್ಟೀರಾಯ್ಡ್ ಹಾರ್ಮೋನುಗಳ ಲೈಂಗಿಕ ವರ್ಗಾವಣೆಯು MISO (ಓಜೆನೆಸಿಸ್‌ನ ಸಂಯೋಗ-ಪ್ರೇರಿತ ಉತ್ತೇಜಕ 11) ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು A. ಗ್ಯಾಂಬಿಯಾ ಮಹಿಳೆಯರನ್ನು P. ಫಾಲ್ಸಿಪ್ಯಾರಮ್ ಸೋಂಕಿನಿಂದ ರಕ್ಷಿಸುವ ಸ್ತ್ರೀ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಜೀನ್ ಆಗಿದೆ, ಇದು ಮಾನವ ಮಲೇರಿಯಾ ಪರಾವಲಂಬಿಗಳಲ್ಲಿ ಅತ್ಯಂತ ಮಾರಕವಾದ 13 ನಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ಆರೋಗ್ಯ ವೆಚ್ಚಗಳು. ಮಲೇರಿಯಾ-ಸ್ಥಳೀಯ ಪ್ರದೇಶಗಳಲ್ಲಿ ಅನಾಫಿಲಿಸ್‌ನ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಫಿಟ್‌ನೆಸ್‌ಗೆ MISO ನ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ನೀಡಿದರೆ, ಯಾವ ಹಾರ್ಮೋನ್ 3D20E ಅಥವಾ 20E ಈ ಜೀನ್‌ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ನಾವು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ. 20E ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚು ಪ್ರಬಲವಾಗಿ HR3 ಮತ್ತು HR4 ನಂತಹ ಕೆಲವು ಪರಮಾಣು ಹಾರ್ಮೋನ್ ಗ್ರಾಹಕಗಳನ್ನು (HR) ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಯೋಕ್ಜೆನಿಕ್ ಜೀನ್‌ಗಳಾದ Vg14, 15, 16 ನಂತಹ ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ಕೆಳಮಟ್ಟದ ಸ್ಟೀರಾಯ್ಡ್ ಗುರಿಗಳನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ, MISO ಅನ್ನು 3D20E ನಿಂದ ಹೆಚ್ಚು ಬಲವಾಗಿ ಪ್ರೇರೇಪಿಸಲಾಗಿದೆ (ವಿಸ್ತೃತ ಡೇಟಾ ಚಿತ್ರ 3). ಹೀಗಾಗಿ, ಈ ಆಂಡ್ರೊಜೆನಿಕ್ ಸ್ಟೀರಾಯ್ಡ್ ಹಾರ್ಮೋನ್‌ನ ಲೈಂಗಿಕ ವರ್ಗಾವಣೆಯು ಪರಾವಲಂಬಿ ಸೋಂಕಿನಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ವೆಚ್ಚಗಳಿಂದ ಮಹಿಳೆಯರನ್ನು ರಕ್ಷಿಸುವ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ. ಇದಲ್ಲದೆ, 3D20E E ಗ್ರಾಹಕ EcR ನ ಎರಡೂ ಐಸೋಫಾರ್ಮ್‌ಗಳ ಮೇಲೆ ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ, EcR-A ಅನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು EcR-B ಅನ್ನು ನಿಗ್ರಹಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು HPX15 ಸೇರಿದಂತೆ ಇತರ ಸಂಯೋಗ-ಪ್ರೇರೇಪಿಸುವ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ಬಲವಾಗಿ ಪ್ರಚೋದಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಮಹಿಳೆಯರ ಫಲವತ್ತತೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ. ಇದು EPP-ಮೌನಗೊಳಿಸಿದ ಪುರುಷರೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಗಗೊಂಡ ಮಹಿಳೆಯರಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಗಮನಾರ್ಹ ಬಂಜೆತನವನ್ನು ವಿವರಿಸಬಹುದು (ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಚಿತ್ರ 3). ಈ ದತ್ತಾಂಶವು ಲಿಂಗ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಕಾರ್ಯಕ್ಕೆ ಆಧಾರವಾಗಿರುವ ಎರಡು ಎಕ್ಡಿಸೋನ್ ಹಾರ್ಮೋನುಗಳಿಂದ ಆದ್ಯತೆಯಾಗಿ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲಾದ ಕೆಳಮುಖ ಮಾರ್ಗಗಳ ಅಸ್ತಿತ್ವವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಮುಂದೆ, ನಮ್ಮ ಬಯೋಇನ್ಫರ್ಮ್ಯಾಟಿಕ್ಸ್ ಪೈಪ್‌ಲೈನ್‌ನಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಎರಡು EcK ಜೀನ್‌ಗಳ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ನಾವು ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ್ದೇವೆ. EcK1 ಅಥವಾ EcK2 ಅನ್ನು ನಿಶ್ಯಬ್ದಗೊಳಿಸುವುದರಿಂದ ಪುರುಷರಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಮರಣ ಉಂಟಾಗುತ್ತದೆ (ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಚಿತ್ರ 4a), ಎಕ್ಡಿಸೋನ್ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಮತ್ತು ಹೀಗಾಗಿ ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯು ಬದುಕುಳಿಯಲು ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. EcK2 ಅನ್ನು EcK1 ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ಸ್‌ನಿಂದ MAG ಗಳಲ್ಲಿ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 2b,c ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 2), ನಾವು ಅದನ್ನು 20E ನೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡುವ ಮೂಲಕ ಅದರ ಎಕ್ಡಿಸ್ಟರಾಯ್ಡ್ ಕೈನೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಮೌಲ್ಯೀಕರಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ 20E22P (ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಚಿತ್ರ 2) ದೊರೆಯಿತು. 4b). 3D20E ಅನ್ನು ತಲಾಧಾರವಾಗಿ ಬಳಸುವಾಗ, ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಟೆಡ್ ಉತ್ಪನ್ನ 3D20E22P (ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಚಿತ್ರ 4c) ಅನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ನಮಗೆ ಸಾಧ್ಯವಾಗಲಿಲ್ಲ, ಇದು 3D20E ಗಿಂತ 20E EcK2 ನ ಆದ್ಯತೆಯ ಗುರಿಯಾಗಿರಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ನಮ್ಮ RNA-seq ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪ್ರಕಾರ, ಕನ್ಯೆಯ ಹೆಣ್ಣುಮಕ್ಕಳ LRT ಯಲ್ಲಿ EcK2 ಹೆಚ್ಚು ವ್ಯಕ್ತವಾಗಿತ್ತು, ಅಲ್ಲಿ ಸಂಯೋಗದ ನಂತರ ಅದನ್ನು ಆಫ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು (ಚಿತ್ರ 2b). ನಾವು ಈ ಡೇಟಾವನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು EcK2 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು ರಕ್ತ ಸೇವನೆಯಿಂದ ಪ್ರಭಾವಿತವಾಗಿಲ್ಲ ಎಂದು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ (ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಚಿತ್ರ 5a). ನಮ್ಮ ಆರಂಭಿಕ MS ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ವಿಸ್ತರಿಸುವಾಗ, 20E22P ಯ ಗರಿಷ್ಠವು 20E ಯ ಗರಿಷ್ಠಕ್ಕೆ ನಿಕಟ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ (ರಕ್ತ ಊಟದ ನಂತರ 22-26 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ; ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಚಿತ್ರ 5b). ಕನ್ಯೆಯ ಹೆಣ್ಣುಮಕ್ಕಳಲ್ಲಿ EcK2 ಅನ್ನು ಮೌನಗೊಳಿಸುವುದರಿಂದ ರಕ್ತದ ಊಟದ ನಂತರ 26 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ 20E ನಿಂದ 20E22P ಯ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ 3 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಳವಾಯಿತು (ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಚಿತ್ರ 2c ಮತ್ತು 5c), ಇದು EcK2 ಮಹಿಳೆಯರಲ್ಲಿ 20E ಅನ್ನು ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಟ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ದೃಢಪಡಿಸುತ್ತದೆ. ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, EcK2-ಕ್ಷೀಣಿಸಿದ ಕನ್ಯೆಯರು ಪೂರ್ಣ ಲೈಂಗಿಕ ಗ್ರಹಿಕೆಯನ್ನು ಕಾಯ್ದುಕೊಂಡರು (ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಚಿತ್ರ 5d,e), 20E ಯ ಸ್ತ್ರೀ ಉತ್ಪಾದನೆಯು ಸಂಯೋಗ ವಕ್ರೀಭವನವನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಮತ್ತಷ್ಟು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಋತುಚಕ್ರ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ಹೆಣ್ಣುಗಳು ನಿಯಂತ್ರಣ ಪ್ರಾಣಿಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಮೊಟ್ಟೆ ಇಡುವ ದರವನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿಸಿವೆ, 30% ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಕನ್ಯೆಯರು ಮೊಟ್ಟೆ ಇಡುತ್ತಾರೆ (ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಚಿತ್ರ 5f).ರಕ್ತ ಹೀರಿದ ನಂತರ ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ Eck2 RNA (dsEcK2) ಚುಚ್ಚುಮದ್ದನ್ನು ನಡೆಸಿದರೆ, ಮೊಟ್ಟೆ ಇಡುವುದು ಸಂಭವಿಸಲಿಲ್ಲ, ಆ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ರಕ್ತ ಸೇವನೆಯಿಂದಾಗಿ 20E ಗರಿಷ್ಠ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ.ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ರಕ್ತ ಹೀರಿದ ನಂತರ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ 20E ಮೊಟ್ಟೆ ಇಡುವುದನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತವೆ, ಆದರೆ ಮೊಟ್ಟೆ ಇಡುವ ಬ್ಲಾಕ್ (EcK2 ಮತ್ತು ಬಹುಶಃ ಇತರ ಅಂಶಗಳು) ಸಂಯೋಗದಿಂದ ಆಫ್ ಮಾಡಿದಾಗ ಮಾತ್ರ.20E ಅಥವಾ 3D20E ಇಂಜೆಕ್ಷನ್‌ಗಳು ಕನ್ಯೆಯರಲ್ಲಿ EcK2 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಲಿಲ್ಲ (ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಚಿತ್ರ 5g), ಇತರ ಅಂಶಗಳು ಈ ಕೈನೇಸ್‌ನ ಪ್ರತಿಬಂಧವನ್ನು ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ವಹಿಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ರಕ್ತ ಸೇವನೆಯ ನಂತರದ 20E ಮಟ್ಟಗಳು ಸಂಯೋಗದ ಅಸ್ವಸ್ಥತೆಯನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡಲು ಸಾಕಾಗುವುದಿಲ್ಲ, ಆದರೆ ಲೈಂಗಿಕವಾಗಿ ವರ್ಗಾವಣೆಯಾದ 3D20E ನ ಹೆಚ್ಚಿನ ಟೈಟರ್‌ಗಳಿಂದ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಪ್ರಚೋದಿಸಲ್ಪಟ್ಟವು.
ನಮ್ಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು A. ಗ್ಯಾಂಬಿಯಾ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿಯ ಯಶಸ್ಸನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ಬಗ್ಗೆ ಪ್ರಮುಖ ಒಳನೋಟಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತವೆ. ಗಂಡುಗಳು 3D20E ನ ಹೆಚ್ಚಿನ ಟೈಟರ್‌ಗಳನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲು ವಿಕಸನಗೊಂಡಿರುವ ಮಾದರಿ ಹೊರಹೊಮ್ಮಿದೆ, ಇದು ಗಂಡು-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಎಕ್ಡಿಸೋನ್ ಆಗಿದ್ದು, ಇದು ಹೆಣ್ಣುಗಳನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಸಂಯೋಗಕ್ಕೆ ಸಂವೇದನಾಶೀಲವಾಗಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪೋಷಕರನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸುತ್ತದೆ. ಅದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಈ ಮಲೇರಿಯಾ ವಾಹಕಗಳು ಪುರುಷ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ EPP ಯ ಲೈಂಗಿಕ ವರ್ಗಾವಣೆಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ ಮಹಿಳೆಯರಲ್ಲಿ 3D20E ಅನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಸಹ ವಿಕಸನಗೊಳಿಸಿವೆ. ನಮ್ಮ ಜ್ಞಾನಕ್ಕೆ, ಇದು ಗಂಡು ಮತ್ತು ಹೆಣ್ಣು ಪ್ರಾಬಲ್ಯದ ಸ್ಟೀರಾಯ್ಡ್ ಹಾರ್ಮೋನ್ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯು ಕೀಟಗಳಲ್ಲಿ ವಿಶಿಷ್ಟ ಮತ್ತು ನಿರ್ಣಾಯಕ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುವ ಮೊದಲ ಉದಾಹರಣೆಯಾಗಿದೆ. ಪುರುಷ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಎಕ್ಡಿಸೋನ್ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಪ್ರತಿಪಾದಿಸಲಾಗಿದೆ ಆದರೆ ನಿರ್ಣಾಯಕವಾಗಿ ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ. ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ನಿರಾಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಊಹೆ 18 ಎಂದರೆ ಈ ಕಾರ್ಯಗಳನ್ನು 20E ಪೂರ್ವಗಾಮಿ E1 ನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು. ಡ್ರೊಸೊಫಿಲಾದಲ್ಲಿ, ಮೊನಾಂಡ್ರಿಯು ಸಣ್ಣ ಲೈಂಗಿಕ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಲೈಂಗಿಕ ವರ್ಗಾವಣೆಯಿಂದ ಪ್ರಚೋದಿಸಲ್ಪಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ಎಲ್ಲರಿಗೂ ತಿಳಿದಿದೆ19,20 ಅದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಲೈಂಗಿಕ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಮೂಲಕ ಸ್ತ್ರೀ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ನರಮಂಡಲಗೊಳಿಸುವ ನರಕೋಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸುತ್ತದೆ. ಗ್ರಾಹಕಗಳು21,22. A. ಗ್ಯಾಂಬಿಯಾ ಹೆಣ್ಣು ಸೊಳ್ಳೆಗಳಲ್ಲಿ 3D20E ನಿಂದ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲ್ಪಡುವ ಕೆಳಮುಖ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಕ್ಯಾಸ್ಕೇಡ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಮತ್ತು ಸೊಳ್ಳೆಗಳು ಮತ್ತು ಡ್ರೊಸೊಫಿಲಾ ನಡುವೆ ಈ ಕ್ಯಾಸ್ಕೇಡ್‌ಗಳನ್ನು ಸಂರಕ್ಷಿಸಬಹುದೇ ಎಂದು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಹೆಚ್ಚಿನ ಕೆಲಸ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.
ನಮ್ಮ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಸ್ತ್ರೀ ಫಲವತ್ತತೆ ಮತ್ತು ನಡವಳಿಕೆಯ ಮೇಲೆ 3D20E ಯ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರವನ್ನು ನೀಡಿದರೆ, 3D20E ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುವ ಮಾರ್ಗಗಳು ಭವಿಷ್ಯದ ಸೊಳ್ಳೆ ನಿಯಂತ್ರಣ ತಂತ್ರಗಳಿಗೆ ಹೊಸ ಅವಕಾಶಗಳನ್ನು ನೀಡುತ್ತವೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ಕೀಟ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನ ತಂತ್ರಗಳಲ್ಲಿ ಸ್ಪರ್ಧಾತ್ಮಕ ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ಗಂಡುಗಳ ಉತ್ಪಾದನೆ. ಕಾಡು ಬಿಡುಗಡೆಗಾಗಿ ಬಳಸಿ ಅಥವಾ ಕನ್ಯೆಯ ಆಟದಲ್ಲಿ 3D20E ಅನ್ನು ಅನುಕರಿಸಲು. A. ಗ್ಯಾಂಬಿಯಾ ಮತ್ತು ಇತರ ಸೆಲ್ಲಿಯಾ ಪ್ರಭೇದಗಳು ತಮ್ಮ ವೀರ್ಯವನ್ನು ಸಂಯೋಗ ಪ್ಲಗ್‌ಗಳಾಗಿ ಹೆಪ್ಪುಗಟ್ಟುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಪಡೆದಾಗ 3D20E ಯ ಪುರುಷ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಕಾರ್ಯವು ವಿಕಸನಗೊಂಡಿರಬಹುದು, ಏಕೆಂದರೆ ಇದು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಹಾರ್ಮೋನುಗಳು ಮತ್ತು ಹಾರ್ಮೋನ್-ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವ ಕಿಣ್ವಗಳ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ವರ್ಗಾವಣೆಗೆ ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ. ಪ್ರತಿಯಾಗಿ, 3D20E ವಿಕಸನವನ್ನು ಕಾರ್ಯಗತಗೊಳಿಸುವ ಮೊನಾಂಡ್ರಿಯು ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಲೇರಿಯಾ ಹರಡುವಿಕೆಯ ಪ್ರದೇಶಗಳಲ್ಲಿ ತಮ್ಮ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಫಿಟ್‌ನೆಸ್ ಅನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸಲು ಹೆಣ್ಣುಗಳಿಗೆ (MISO ನ ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಮೂಲಕ) ಒಂದು ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಪರೋಕ್ಷವಾಗಿ ಪ್ಲಾಸ್ಮೋಡಿಯಂ ಪ್ರಸರಣಕ್ಕೆ ಕೊಡುಗೆ ನೀಡುತ್ತದೆ. ಹೆಣ್ಣು ಅನಾಫಿಲಿಸ್ ಸೊಳ್ಳೆಗಳಲ್ಲಿ P. ಫಾಲ್ಸಿಪ್ಯಾರಮ್‌ನ ಬದುಕುಳಿಯುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಮೇಲೆ ಹೆಣ್ಣು 20E ಆಳವಾದ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಬೀರುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ,24 ಗಂಡು ಮತ್ತು ಹೆಣ್ಣು ಸ್ಟೀರಾಯ್ಡ್ ಹಾರ್ಮೋನ್ ಮಾರ್ಗಗಳು ಈಗ ಸೊಳ್ಳೆ-ಪರಾವಲಂಬಿ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯ ಪ್ರಮುಖ ಅಂಶಗಳಾಗಿವೆ.
A. ಗ್ಯಾಂಬಿಯಾ G3 ತಳಿಗಳನ್ನು ಪ್ರಮಾಣಿತ ಕೀಟ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ (26-28 °C, 65-80% ಸಾಪೇಕ್ಷ ಆರ್ದ್ರತೆ, 12:12 ಗಂಟೆ ಬೆಳಕು/ಗಾಢ ದ್ಯುತಿ ಅವಧಿ) ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು. ಲಾರ್ವಾಗಳಿಗೆ ಪುಡಿಮಾಡಿದ ಮೀನಿನ ಆಹಾರವನ್ನು (ಟೆಟ್ರಾಮಿನ್ ಟ್ರಾಪಿಕಲ್ ಫ್ಲೇಕ್ಸ್, ಕೋಯಿ ಪೆಲೆಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಟೆಟ್ರಾ ಪಾಂಡ್ ಸ್ಟಿಕ್‌ಗಳನ್ನು 7:7:2 ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ) ನೀಡಲಾಯಿತು. ವಯಸ್ಕ ಸೊಳ್ಳೆಗಳಿಗೆ ಆಡ್ ಲಿಬಿಟಮ್ 10% ಡೆಕ್ಸ್ಟ್ರೋಸ್ ದ್ರಾವಣ ಮತ್ತು ವಾರಕ್ಕೊಮ್ಮೆ ಮಾನವ ರಕ್ತವನ್ನು ನೀಡಲಾಗುತ್ತಿತ್ತು (ರಕ್ತದ ಘಟಕಗಳನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಿ). ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕದ ಮೂಲಕ ತುದಿಗಳನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ ನಂತರ ಪ್ಯೂಪಲ್ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಲಿಂಗಗಳನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸುವ ಮೂಲಕ ವರ್ಜಿನ್ ಸೊಳ್ಳೆಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಯಿತು. DsRed ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಜೀನ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಗಂಡು ಸೊಳ್ಳೆಗಳನ್ನು ಈ ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್‌ಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಬಲವಂತದ ಸಂಯೋಗ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ನೈಸರ್ಗಿಕ ಸಂಯೋಗಕ್ಕಾಗಿ, 4 ದಿನಗಳ ಕನ್ಯೆಯ ಹೆಣ್ಣುಗಳನ್ನು ಲೈಂಗಿಕವಾಗಿ ಪ್ರಬುದ್ಧ ಕನ್ಯೆಯ ಗಂಡುಗಳೊಂದಿಗೆ 1:3 ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ಎರಡು ರಾತ್ರಿಗಳ ಕಾಲ ಇರಿಸಲಾಗಿತ್ತು. ಪುರುಷರಿಗೆ dsEPP ಚುಚ್ಚುಮದ್ದನ್ನು ನೀಡಿದ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗೆ, ಫಾಸ್ಫೇಟೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಗರಿಷ್ಠವಾಗಿ ನಿಶ್ಯಬ್ದಗೊಳಿಸಿದಾಗ, ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ನಂತರ 3-4 ದಿನಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಹ-ಪಂಜರ ಹಾಕುವಿಕೆಯು ಹೊಂದಿಕೆಯಾಯಿತು (ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಚಿತ್ರ 2b).
ಸೊಳ್ಳೆ ಅಂಗಾಂಶಗಳು, ಉಳಿದ ಶವಗಳು (ದೇಹದ ಉಳಿದ ಭಾಗ), ಅಥವಾ ಇಡೀ ದೇಹವನ್ನು 100% ಮೆಥನಾಲ್ ಆಗಿ ವಿಭಜಿಸಿ ಬೀಡರ್ (2 ಮಿಮೀ ಗಾಜಿನ ಮಣಿಗಳು, 2,400 rpm, 90 ಸೆಕೆಂಡುಗಳು) ನೊಂದಿಗೆ ಏಕರೂಪಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. ಅಂಗಾಂಶದ ಪ್ರಮಾಣಗಳು ಮತ್ತು ಮೆಥನಾಲ್ ಪರಿಮಾಣಗಳು ಈ ಕೆಳಗಿನಂತಿವೆ: ದೇಹದ ಉಳಿದ ಭಾಗ, 1,000 µl ನಲ್ಲಿ 50; MAG, 50–100 80 µl; ಹೆಣ್ಣು LRT, 25–50 80 µl. ಅವಕ್ಷೇಪವನ್ನು ಅದೇ ಪ್ರಮಾಣದ ಮೆಥನಾಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಎರಡನೇ ಮೆಥನಾಲ್ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಜೀವಕೋಶದ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮೂಲಕ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು. ಎರಡೂ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಗಳಿಂದ ಮೆಥನಾಲ್ ಅನ್ನು ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸಿ ಸಾರಜನಕ ಹರಿವಿನ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಒಣಗಿಸಲಾಯಿತು, ನಂತರ ನೀರಿನಲ್ಲಿ 80% ಮೆಥನಾಲ್‌ನ ಕೆಳಗಿನ ಸಂಪುಟಗಳಲ್ಲಿ ಮತ್ತೆ ಜೋಡಿಸಲಾಯಿತು: ದೇಹದ ಉಳಿದ ಭಾಗ, 50 µl; MAG ಗಳು ಮತ್ತು ಹೆಣ್ಣು LRT, 30 µl.
ಮಾದರಿಗಳನ್ನು LC ಉಪಕರಣ (ವ್ಯಾಂಕ್ವಿಶ್, ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್) ಗೆ ಜೋಡಿಸಲಾದ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ (ID-X, ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್) ನಲ್ಲಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. 5 µl ಮಾದರಿಯನ್ನು 25 °C ನಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾದ 3 µm, 100 × 4.6 mm ಕಾಲಮ್ (ಇನ್ಸ್‌ಪೈರ್ C8, ಡಿಕ್ಮಾ) ಮೇಲೆ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು. LC ಗಾಗಿ ಮೊಬೈಲ್ ಹಂತಗಳು A (ನೀರು, 0.1% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲ) ಮತ್ತು B (ಅಸಿಟೋನಿಟ್ರೈಲ್, 0.1% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲ). LC ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಈ ಕೆಳಗಿನಂತಿತ್ತು: 1 ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ 5% B, ನಂತರ 11 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ 100% B ಗೆ ಹೆಚ್ಚಾಯಿತು. 100% ನಲ್ಲಿ 8 ನಿಮಿಷಗಳ ನಂತರ, 4 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 5% B ನಲ್ಲಿ ಕಾಲಮ್ ಅನ್ನು ಮರು-ಸಮತೋಲನಗೊಳಿಸಿ. ಹರಿವಿನ ಪ್ರಮಾಣ 0.3 ಮಿಲಿ ನಿಮಿಷ-1 ಆಗಿತ್ತು. MS ಮೂಲದಲ್ಲಿ ಅಯಾನೀಕರಣವನ್ನು ಧನಾತ್ಮಕ ಮತ್ತು ಋಣಾತ್ಮಕ ವಿಧಾನಗಳಲ್ಲಿ ಬಿಸಿಮಾಡಿದ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಪ್ರೇ ಅಯಾನೀಕರಣದ ಮೂಲಕ ಸಾಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ ಪೂರ್ಣ MS ಮೋಡ್‌ನಲ್ಲಿ 60,000 ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್‌ನಲ್ಲಿ 350 ರಿಂದ 680 ರವರೆಗಿನ m/z ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿ ಡೇಟಾವನ್ನು ಅಳೆಯುತ್ತದೆ. [M + H]+ (ಎಲ್ಲಾ ಗುರಿಗಳು), [M - H2O + H]+ (ಎಲ್ಲಾ ಗುರಿಗಳು), ಮತ್ತು [M - H]- (ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಟೆಡ್ ಗುರಿಗಳು) ನಲ್ಲಿ MS/MS ಡೇಟಾವನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ. ಯಾವುದೇ ಮಾನದಂಡ ಲಭ್ಯವಿಲ್ಲದ ಗುರಿಗಳ ಎಕ್ಡಿಸೋನ್ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸಲು MS/MS ಡೇಟಾವನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ. ಗುರಿಯಿಲ್ಲದ ಎಕ್ಡಿಸ್ಟರಾಯ್ಡ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು, >15% ಸಾಪೇಕ್ಷ ಸಮೃದ್ಧಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಎಲ್ಲಾ HPLC ಶಿಖರಗಳಿಗೆ MS/MS ಡೇಟಾವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಶುದ್ಧ ಮಾನದಂಡಗಳಿಂದ (20E, 3D20E) ರಚಿಸಲಾದ ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಿ, ಒಂದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಮಾದರಿಯ (ಎಲ್ಲಾ ಇತರ ಗುರಿಗಳು) ಸಂಪೂರ್ಣ ಪ್ರಮಾಣಗಳು ಅಥವಾ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆಗಳನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲು ಒಬ್ಬ ಪುರುಷನಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಪ್ರಮಾಣಗಳಿಗೆ ಅವುಗಳ ಸಮಾನತೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲು. 3D20E ಗಾಗಿ, ಈ ಕೆಳಗಿನ ಸಂಯೋಜಕಗಳ ಮೊತ್ತವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. ಟ್ರೇಸ್‌ಫೈಂಡರ್ (ಆವೃತ್ತಿ 4.1) ಬಳಸಿ ಡೇಟಾವನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲಾಯಿತು. MS/MS ಡೇಟಾವನ್ನು Xcalibur (ಆವೃತ್ತಿ 4.4) ಬಳಸಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. E, 20E ಮತ್ತು 3D20E ನ MS ವರ್ಣಪಟಲವನ್ನು ಆಯಾ ಮಾನದಂಡಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಲಾಯಿತು. 3D20E22P ಅನ್ನು ಗಿರಾರ್ಡ್‌ನ ಕಾರಕದೊಂದಿಗೆ ವ್ಯುತ್ಪನ್ನದ ಮೂಲಕ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. 20E22P ಅನ್ನು m/z ಅನುಪಾತದಿಂದ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು.
MAG ನಿಂದ 3D20E22P ಅನ್ನು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಯಿತು. HPLC-MS/MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಂತೆಯೇ ಅದೇ LC ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಕ್ವಾಡ್ರುಪೋಲ್ ಮಾಸ್-ಆಧಾರಿತ ಡಿಟೆಕ್ಟರ್ (QDa, ಅಕ್ವಿಟಿ, ವಾಟರ್ಸ್) ಹೊಂದಿರುವ ಅಲ್ಟ್ರಾ-ಪರ್ಫಾರ್ಮೆನ್ಸ್ ಲಿಕ್ವಿಡ್ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಾಫ್ (ಅಕ್ವಿಟಿ, ವಾಟರ್ಸ್) ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ವಿಶ್ಲೇಷಣಾತ್ಮಕ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಶುದ್ಧೀಕರಣವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಹಿಂದೆ ನಿರ್ಧರಿಸಿದ ಅದೇ ಧಾರಣ ಸಮಯದಲ್ಲಿ 3D20E22P ಗೆ ಅನುಗುಣವಾದ m/z ಪತ್ತೆಯಾದಾಗ ಭಿನ್ನರಾಶಿ ಸಂಗ್ರಹವನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಸಂಯುಕ್ತಗಳ ಶುದ್ಧತೆಯನ್ನು ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ HPLC-MS/MS ಪರಿಶೀಲಿಸಿತು.
ತಯಾರಕರ ಸೂಚನೆಗಳನ್ನು ಅನುಸರಿಸಿ TRI ಕಾರಕ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್) ಬಳಸಿ 10-12 ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಅಂಗಾಂಶಗಳಿಂದ ಅಥವಾ ದೇಹದ ಇತರ ಭಾಗಗಳಿಂದ (ತಲೆಯಿಲ್ಲದ) ಒಟ್ಟು RNA ಅನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಯಿತು. RNA ಅನ್ನು TURBO DNase (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್) ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಲಾಯಿತು. ತಯಾರಕರ ಸೂಚನೆಗಳನ್ನು ಅನುಸರಿಸಿ cDNA ಅನ್ನು ಮೊಲೊನಿ ಮುರೈನ್ ಲ್ಯುಕೇಮಿಯಾ ವೈರಸ್ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ (M-MLV RT; ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್) ಬಳಸಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಕ್ವಾಂಟಿಟೇಟಿವ್ PCR (RT-qPCR; ವಿಸ್ತೃತ ಡೇಟಾ ಟೇಬಲ್ 2) ಗಾಗಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಈ ಹಿಂದೆ ಪ್ರಕಟಿಸಲಾಗಿತ್ತು24 ಅಥವಾ ಪ್ರೈಮರ್-BLAST26 ಬಳಸಿ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾಗಿತ್ತು, 70-150 bp ಗಾತ್ರ ಮತ್ತು ವ್ಯಾಪಿಸಿರುವ ಎಕ್ಸಾನ್-ಎಕ್ಸಾನ್ ಜಂಕ್ಷನ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಪ್ರೈಮರ್ ಜೋಡಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಉತ್ಪನ್ನಗಳಿಗೆ ಆದ್ಯತೆ ನೀಡಲಾಯಿತು. RT-qPCR ಗಾಗಿ ಮೂರರಿಂದ ನಾಲ್ಕು ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳಿಂದ cDNA ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ನೀರಿನಲ್ಲಿ ನಾಲ್ಕು ಪಟ್ಟು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. 1× ಪವರ್‌ಅಪ್ SYBR ಗ್ರೀನ್ ಮಾಸ್ಟರ್ ಮಿಕ್ಸ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್), ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು 5 µl ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿದ cDNA ಹೊಂದಿರುವ 15 µl ಪ್ರತಿಕೃತಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು a ನಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು ಕ್ವಾಂಟ್‌ಸ್ಟುಡಿಯೋ 6 ಪ್ರೊ ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪಿಸಿಆರ್ ವ್ಯವಸ್ಥೆ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್) ಮತ್ತು ಡೇಟಾವನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸ ಮತ್ತು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (ಆವೃತ್ತಿ 2.4.3) ಬಳಸಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಪ್ರದರ್ಶಿಸಿದಂತೆ, ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪ್ರಮಾಣಗಳನ್ನು ರೈಬೋಸೋಮಲ್ ಜೀನ್ RpL19 (AGAP004422) ಗೆ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಲಾಯಿತು, ಇದರ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ರಕ್ತ 27 ಅಥವಾ ಸಂಯೋಗ 3 ರೊಂದಿಗೆ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಬದಲಾಗಲಿಲ್ಲ.
ಅಜಿಲೆಂಟ್ ಬಯೋಅನಾಲೈಜರ್ 2100 ಬಯೋಅನಾಲೈಜರ್ (ಅಜಿಲೆಂಟ್) ಬಳಸಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಲಾಯಿತು. ಇಲ್ಯುಮಿನಾ ಜೋಡಿ-ಅಂತ್ಯ ಗ್ರಂಥಾಲಯಗಳನ್ನು MIT ಮತ್ತು ಹಾರ್ವರ್ಡ್‌ನ ಬ್ರಾಡ್ ಇನ್‌ಸ್ಟಿಟ್ಯೂಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಿದ್ಧಪಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಅನುಕ್ರಮ ಓದುವಿಕೆಗಳನ್ನು HISAT2 (ಆವೃತ್ತಿ 2.0.5) ಬಳಸಿ A. ಗ್ಯಾಂಬಿಯಾ ಜೀನೋಮ್ (PEST ಸ್ಟ್ರೈನ್, ಆವೃತ್ತಿ 4.12) ಗೆ ಜೋಡಿಸಲಾಯಿತು. ಮ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಗುಣಮಟ್ಟ (MAPQ) ಸ್ಕೋರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಓದುವಿಕೆಗಳನ್ನು <30 ಅನ್ನು ಸ್ಯಾಮ್‌ಟೂಲ್ಸ್ (ಆವೃತ್ತಿ 1.3.1) ಬಳಸಿ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು. ಜೀನ್‌ಗಳಿಗೆ ಮ್ಯಾಪ್ ಮಾಡಲಾದ ಓದುವಿಕೆಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಡೀಫಾಲ್ಟ್ ನಿಯತಾಂಕಗಳೊಂದಿಗೆ htseq-count (ಆವೃತ್ತಿ 0.9.1) ಬಳಸಿ ಎಣಿಸಲಾಯಿತು. ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಿದ ಓದುವಿಕೆ ಎಣಿಕೆಗಳನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಯಿತು ಮತ್ತು R (ಆವೃತ್ತಿ 4.0.3) ನಲ್ಲಿ DESeq2 ಪ್ಯಾಕೇಜ್ (ಆವೃತ್ತಿ 1.28.1) ಬಳಸಿ ವಿಭಿನ್ನ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು.
ಎಕ್ಡಿಸೋನ್-ಮಾರ್ಪಡಿಸುವ ಜೀನ್ ಅಭ್ಯರ್ಥಿಗಳನ್ನು ಮೊದಲು PSI-BLAST ಅಲ್ಗಾರಿದಮ್ (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) ಬಳಸಿ A. ಗ್ಯಾಂಬಿಯಾ ಜೀನೋಮ್ ಅನ್ನು ಹುಡುಕುವ ಮೂಲಕ ಗುರುತಿಸಲಾಯಿತು, ಡೀಫಾಲ್ಟ್ ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಈ ಕೆಳಗಿನ ಪ್ರಶ್ನೆ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳೊಂದಿಗೆ ನಿಯತಾಂಕಗಳು: ಬಾಂಬಿಕ್ಸ್ ಮೋರಿ (ಪ್ರವೇಶ ಸಂಖ್ಯೆ NP_001038956.1), ಮಸ್ಕಾ ಡೊಮೆಸ್ಟಿಕಾ (ಪ್ರವೇಶ ಸಂಖ್ಯೆ XP_005182020.1, XP_005175332.1 ಮತ್ತು XP_011294434.1) ಮತ್ತು ಮೈಕ್ರೋಪ್ಲೈಟಿಸ್ ಡೆಮೋಲಿಟರ್ (ಪ್ರವೇಶ ಸಂಖ್ಯೆ XP_008552646.1 ಮತ್ತು XP_008552645.1) ನಿಂದ EcK ಬಿ. ಮೋರಿ (ಪ್ರವೇಶ ಸಂಖ್ಯೆ NP_001036900), ಡ್ರೊಸೊಫಿಲಾ ಮೆಲನೊಗ್ಯಾಸ್ಟರ್ (ಪ್ರವೇಶ ಸಂಖ್ಯೆ NP_651202), ಅಪಿಸ್ ಮೆಲ್ಲಿಫೆರಾ (ಪ್ರವೇಶ ಸಂಖ್ಯೆ. XP_394838) ಮತ್ತು ಅಸಿರ್ಥೋಸಿಫಾನ್ ಪಿಸಮ್ (ಪ್ರವೇಶ ಸಂಖ್ಯೆ. XP_001947166); ಮತ್ತು ಬಿ. ಮೋರಿ (ಪ್ರವೇಶ ಸಂಖ್ಯೆ. XP_001947166) NP_001177919.1 ಮತ್ತು NP_001243996.1) ಮತ್ತು ಡಿ. ಮೆಲನೋಗಾಸ್ಟರ್‌ನ EO (ಪ್ರವೇಶ ಸಂಖ್ಯೆ. NP_572986.1) (ಹಂತ 1) ನಿಂದ EPP. ಮುಂದೆ, ಗ್ಯಾಂಬಿಯಾದಲ್ಲಿ (ಹಂತ 2) ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಅಂಗಾಂಶದಲ್ಲಿ (ಸ್ತ್ರೀ LRT ಅಥವಾ MAG) ಹೆಚ್ಚಿನ mRNA ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ (> 100 ತುಣುಕುಗಳು/ಕಿಲೋಬೇಸ್ ಎಕ್ಸಾನ್‌ಗಳು ಪ್ರತಿ ಮಿಲಿಯನ್ ಮ್ಯಾಪ್ಡ್ ರೀಡ್‌ಗಳು (FPKM) ಅಥವಾ >85%) ಆಧರಿಸಿ ಫಿಲ್ಟರ್ ಹಿಟ್‌ಗಳು. ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಲು, ನಾವು ಎ. ಅಲ್ಬಿಮಾನಸ್‌ನ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಅಂಗಾಂಶದಲ್ಲಿಯೂ ವ್ಯಕ್ತವಾಗುವ ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಅನಾಫಿಲಿಸ್ ಪ್ರಭೇದವಾಗಿದ್ದು, ಇದು ಸಂಯೋಗದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಎಕ್ಡಿಸೋನ್ ಅನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸುವುದಿಲ್ಲ ಅಥವಾ ವರ್ಗಾಯಿಸುವುದಿಲ್ಲ. ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಎ. ಅಲ್ಬಿಮಾನಸ್ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಅಂಗಾಂಶದಲ್ಲಿ (ಹಂತ 3) ಕಡಿಮೆ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ (<100 FPKM ಅಥವಾ <85 ನೇ ಶೇಕಡಾವಾರು) ಆಧರಿಸಿ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಅಂತಿಮ ಫಿಲ್ಟರ್ ಆಗಿ (ಹಂತ 4), ಅಭ್ಯರ್ಥಿ ಜೀನ್‌ಗಳು ಈ ಕೆಳಗಿನವುಗಳಲ್ಲಿ ಕನಿಷ್ಠ ಒಂದನ್ನು ಪೂರೈಸಬೇಕು: (1) ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಿದ ಜೀನ್‌ಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪ್ರಕಾರ ಸಂಯೋಗದ ನಂತರ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಮೇಲಕ್ಕೆ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲ್ಪಡುತ್ತದೆ (P < 0.05) ಮತ್ತು (2) ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಮಾಡದ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿ (< 85 % ಅಥವಾ <100 FPKM).
ಸಂಪೂರ್ಣ ಜೀವಿ ಐಸೊಟೋಪಿಕ್ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಸಾಧಿಸಲು ನಾವು ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು 28,29,30 ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, ಕಾಡು-ಪ್ರಕಾರದ ಸ್ಯಾಕರೊಮೈಸಸ್ ಸೆರೆವಿಸಿಯಾ ಟೈಪ್ II (YSC2, ಸಿಗ್ಮಾ) ಅನ್ನು ಯೀಸ್ಟ್ ಸಾರಜನಕ ಬೇಸ್ (BD Difco, DF0335) ನಲ್ಲಿ (wt/vol) 2% ಗ್ಲೂಕೋಸ್ (G7528, ಸಿಗ್ಮಾ), 1.7% ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ-ಮುಕ್ತ ಮತ್ತು ಅಮೋನಿಯಂ ಸಲ್ಫೇಟ್. ಸಂಸ್ಕೃತಿ ಮಾಧ್ಯಮ) ಮತ್ತು 5% 15N ಅಮೋನಿಯಂ ಸಲ್ಫೇಟ್ (NLM-713, >99%, ಕೇಂಬ್ರಿಡ್ಜ್ ಐಸೊಟೋಪ್ ಪ್ರಯೋಗಾಲಯಗಳು) ಹೊಂದಿರುವ ಸಾರಜನಕದ ಏಕೈಕ ಮೂಲವಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು. ಯೀಸ್ಟ್ ಅನ್ನು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿತ್ವದ ಮೂಲಕ ಮರುಪಡೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸೊಳ್ಳೆ ಲಾರ್ವಾಗಳಿಗೆ ಪ್ಯೂಪೇಶನ್ ತನಕ ಉಚಿತ ಆಹಾರವನ್ನು ನೀಡಲಾಯಿತು. ನಾಲ್ಕನೇ ಇನ್‌ಸ್ಟಾರ್ ಮರಣವನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟಲು ಮೀನಿನ ಹಿಟ್ಟು (300 ಲಾರ್ವಾಗಳಿಗೆ 0.5 ಮಿಗ್ರಾಂ) ಪೂರಕ. ನಂತರ ಸಂಯೋಗದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾದ ಪುರುಷ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್ ಅನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡದ ಗಂಡುಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಗ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಣ್ಣುಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಬಳಸಲಾಯಿತು.
4-6 ದಿನಗಳ ವಯಸ್ಸಿನ 15N-ಟ್ಯಾಗ್ ಮಾಡಲಾದ ಕನ್ಯೆಯ ಹೆಣ್ಣುಗಳನ್ನು ವಯಸ್ಸಿಗೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗದ ಟ್ಯಾಗ್ ಮಾಡದ ಕನ್ಯೆಯ ಗಂಡುಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಗ ಮಾಡಲು ಒತ್ತಾಯಿಸಲಾಯಿತು. ಎಪಿಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿಯ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಸಂಯೋಗ ಪ್ಲಗ್‌ಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವ ಮೂಲಕ ಯಶಸ್ವಿ ಸಂಯೋಗವನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಲಾಯಿತು. 3, 12, ಮತ್ತು 24 hpm ನಲ್ಲಿ, 45-55 ಸಂಯೋಗ ಮಾಡಿದ ಹೆಣ್ಣುಗಳ ಹೃತ್ಕರ್ಣವನ್ನು 50 µl ಅಮೋನಿಯಂ ಬೈಕಾರ್ಬನೇಟ್ ಬಫರ್ (pH 7.8) ಆಗಿ ವಿಭಜಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕೀಟದಿಂದ ಏಕರೂಪಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. ಏಕರೂಪಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು 50 mM ಅಮೋನಿಯಂ ಬೈಕಾರ್ಬನೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ 0.1% RapiGest (186001860, ವಾಟರ್ಸ್) ನ 50 µl ನೊಂದಿಗೆ ಬೆರೆಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಯಿಂದ ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಮತ್ತು ಪೆಲೆಟ್ ಅನ್ನು ಒಣ ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ ಸ್ನ್ಯಾಪ್ ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಿ ವಾಷಿಂಗ್ಟನ್ ವಿಶ್ವವಿದ್ಯಾಲಯದ ಮ್ಯಾಕ್‌ಕಾಸ್ ಪ್ರಯೋಗಾಲಯಕ್ಕೆ ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ರವಾನಿಸಲಾಯಿತು, ಅಲ್ಲಿ LC-MS/MS ಗಾಗಿ ಮಾದರಿ ತಯಾರಿಕೆ ಪೂರ್ಣಗೊಂಡಿತು. 50 mM ಅಮೋನಿಯಂನಲ್ಲಿ 0.1% RapiGest ನ 50 µl ನಲ್ಲಿ ಗುಳಿಗೆಯನ್ನು ಮರುಹೊಂದಿಸಿ. ನೀರಿನ ಸ್ನಾನದಲ್ಲಿ ಬೈಕಾರ್ಬನೇಟ್ ಮತ್ತು ಸೋನಿಕೇಟ್. ಪೆಲೆಟ್ ಮತ್ತು ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್‌ನ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು BCA ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ಅಳೆಯಲಾಯಿತು, ಮಾದರಿಗಳನ್ನು 5 mM ಡೈಥಿಯೋಥ್ರೈಟಾಲ್ (DTT; ಸಿಗ್ಮಾ) ನೊಂದಿಗೆ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು, 15 mM ಅಯೋಡೋಅಸೆಟಮೈಡ್ (ಸಿಗ್ಮಾ) ನೊಂದಿಗೆ ಆಲ್ಕೈಲೇಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 37 °C (1:0 50) ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ ಟ್ರಿಪ್ಸಿನೀಕರಣ: ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್:ತಲಾಧಾರ ಅನುಪಾತದೊಂದಿಗೆ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ರಾಪಿಗೆಸ್ಟ್ ಅನ್ನು 200 mM HCl ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು, ನಂತರ 37 °C ನಲ್ಲಿ 45 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಶಿಲಾಖಂಡರಾಶಿಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 4 °C ನಲ್ಲಿ ಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಗೇಶನ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಡ್ಯುಯಲ್-ಮೋಡ್ ಘನ-ಹಂತದ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆ (ಓಯಸಿಸ್ MCX ಕಾರ್ಟ್ರಿಡ್ಜ್‌ಗಳು, ವಾಟರ್ಸ್) ಮೂಲಕ ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 0.33 µg µl-1 ರ ಅಂತಿಮ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಾಗಿ 0.1% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲದಲ್ಲಿ ಮರುಹೊಂದಿಸಲಾಯಿತು. ಲೇಬಲ್ ಮಾಡದ MAG ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್‌ಗಳನ್ನು ಕನ್ಯೆಯ ಪುರುಷರಿಂದ ಇದೇ ರೀತಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. ಎರಡು ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಗೆ ವಿಶ್ಲೇಷಣಾತ್ಮಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮುಂದೆ, ಪ್ರತಿಯೊಂದರ 1 µg ಅನ್ನು 25-ಸೆಂ.ಮೀ. ಫ್ಯೂಸ್ಡ್ ಸಿಲಿಕಾ 75-μm ಕಾಲಮ್ ಅನ್ನು 4-ಸೆಂ.ಮೀ. ಫ್ಯೂಸ್ಡ್ ಸಿಲಿಕಾ ಕಾಸಿಲ್ 1 (PQ) ಫ್ರಿಟ್ ಟ್ರ್ಯಾಪ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಜುಪಿಟರ್ C12 ರಿವರ್ಸ್ಡ್-ಫೇಸ್ ರೆಸಿನ್ (ಫೆನೋಮೆನೆಕ್ಸ್) ಮತ್ತು 180-ನಿಮಿಷಗಳ ಲಿಕ್ವಿಡ್ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿಯಿಂದ ಪ್ಯಾಕ್ ಮಾಡಲಾದ ಬಳಸಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮಾದರಿ ಡೈಜೆಸ್ಟ್‌ಗಳು - MS/MS ಅನ್ನು ನ್ಯಾನೊACQUITY UPLC ಸಿಸ್ಟಮ್ (ವಾಟರ್ಸ್) ಹೊಂದಿರುವ Q-Exactive HF ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್) ನಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿ ರನ್‌ಗೆ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ಡೇಟಾ-ಸಂಬಂಧಿತ ಸ್ವಾಧೀನ ಡೇಟಾವನ್ನು ಪ್ರೋಟಿಯೋವಿಜಾರ್ಡ್ (ಆವೃತ್ತಿ 3.0.20287) ಬಳಸಿ ಮತ್ತು ಕಾಮೆಟ್31 (ಆವೃತ್ತಿ 3.2) ಬಳಸಿ ಅನೋಫಿಲಿಸ್ ಗ್ಯಾಂಬಿಯಾ (ವೆಕ್ಟರ್‌ಬೇಸ್ ಆವೃತ್ತಿ 54), ಅನೋಫಿಲಿಸ್ ಕೊಲುಝಿಯಿಂದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ FASTA ಡೇಟಾಬೇಸ್ ವಿರುದ್ಧ mzML ಸ್ವರೂಪಕ್ಕೆ ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾಯಿತು. ಮಾಲಿ-NIH (ವೆಕ್ಟರ್‌ಬೇಸ್ ಆವೃತ್ತಿ 54), ಸ್ಯಾಕರೊಮೈಸಸ್ ಸೆರೆವಿಸಿಯಾ (ಯುನಿಪ್ರಾಟ್, ಮಾರ್ಚ್ 2021), A. ಗ್ಯಾಂಬಿಯಾ RNA-seq ಮತ್ತು ತಿಳಿದಿರುವ ಮಾನವ ಮಾಲಿನ್ಯಕಾರಕಗಳ ಮೂರು-ಫ್ರೇಮ್ ಅನುವಾದಗಳಲ್ಲಿ ಹುಡುಕಾಟವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ನಕ್ಷೆ-ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ FDR ಗಳನ್ನು 0.01 ರ ಮಿತಿಯೊಂದಿಗೆ ಪರ್ಕೊಲೇಟರ್32 (ಆವೃತ್ತಿ 3.05) ಬಳಸಿ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪಾರ್ಸಿಮನಿ ಬಳಸಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಗಳಾಗಿ ಜೋಡಿಸಲಾಯಿತು. ಲೈಮ್‌ಲೈಟ್33 (ಆವೃತ್ತಿ 2.2.0).ಈ ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಪ್ರತಿ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗೆ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿದ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಿದ ರೋಹಿತದ ಸಮೃದ್ಧಿ ಅಂಶ (NSAF) ಬಳಸಿ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಮೃದ್ಧಿಯನ್ನು ಅಂದಾಜಿಸಲಾಗಿದೆ. ಪ್ರತಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ NSAF ಅನ್ನು ಎರಡು ವಿಭಿನ್ನ ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳಿಂದ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಸರಾಸರಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು. 15N ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಸ್ತ್ರೀ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್ ಅನ್ನು ಯಶಸ್ವಿಯಾಗಿ ಮರೆಮಾಡಿತು, ಆದರೂ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡದ ಕನ್ಯೆಯರಿಂದ ಸಣ್ಣ ಪ್ರಮಾಣದ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಬಹುದು. ತಾಂತ್ರಿಕ ರನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಮಾತ್ರ ಸ್ತ್ರೀ ಕಚ್ಚಾ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಪುರುಷ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕಡಿತ (1-5 ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾ) ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವಿಕೆಯನ್ನು ನಾವು ದಾಖಲಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಅಲ್ಲಿ HPLC "ಕ್ಯಾರಿ ಓವರ್" ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಪುರುಷ/ಸಂಯೋಗದ ಮಾದರಿಗಳ ನಂತರ ಕಚ್ಚಾ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಕನ್ಯೆಯರಿಂದ 'ಮಾಲಿನ್ಯಕಾರಕಗಳು' ಎಂದು ಕಂಡುಬರುವ ಸಾಂದರ್ಭಿಕ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 1 ರಲ್ಲಿ ಪಟ್ಟಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.
ಜೆನ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಎರಡು ಪ್ರತಿಜನಕ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು, QTTDRVAPAPDQQQ (ಐಸೊಟೈಪ್ PA ಒಳಗೆ) ಮತ್ತು MESDGTTPSGDSEQ (ಐಸೊಟೈಪ್ PA ಮತ್ತು PB ಒಳಗೆ). ಎರಡು ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಯಿತು, ನಂತರ ವಾಹಕ ಪ್ರೋಟೀನ್ KLH ಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನ್ಯೂಜಿಲೆಂಡ್ ಮೊಲಗಳಿಗೆ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು. ನಾಲ್ಕನೇ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ನಂತರ ಮೊಲಗಳನ್ನು ಬಲಿ ನೀಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಒಟ್ಟು IgG ಅನ್ನು ಅಫಿನಿಟಿ ಶುದ್ಧೀಕರಣದಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಯಿತು. ಹೆಚ್ಚಿನ EPP-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಮೊಲದಿಂದ IgG ಅನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಪಾಶ್ಚಾತ್ಯ ಬ್ಲಾಟಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು.
ಪಾಶ್ಚಾತ್ಯ ಬ್ಲಾಟ್‌ಗಳಿಗೆ, MAG (n = 10, ಇಲ್ಲಿ n ಜೈವಿಕವಾಗಿ ಸ್ವತಂತ್ರ ಸೊಳ್ಳೆ ಮಾದರಿಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ) ಮತ್ತು 4 ದಿನಗಳ ಕನ್ಯೆಯ ಗಂಡು ಮತ್ತು ಕನ್ಯೆ ಅಥವಾ ಬಲವಂತದ-ಸಂಯೋಗದ ಹೆಣ್ಣುಗಳಿಂದ (<10 ಸಂಯೋಗದ ನಂತರ), ಪ್ರೋಟೀನ್ ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಬಫರ್ (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% ಸೋಡಿಯಂ ಡಿಯೋಕ್ಸಿಕೋಲೇಟ್; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× ಪ್ರೋಟಿಯೇಸ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್ ಕಾಕ್ಟೈಲ್ (ರೋಚೆ)) ಅನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ಬೀಡರ್ (2 ಮಿಮೀ ಗಾಜಿನ ಮಣಿಗಳು, 2,400 rpm, 90 ಸೆಕೆಂಡ್) ನೊಂದಿಗೆ ಛೇದನದ ನಂತರ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ತಕ್ಷಣವೇ ಏಕರೂಪಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. ಕರಗದ ಶಿಲಾಖಂಡರಾಶಿಗಳನ್ನು 4 °C ನಲ್ಲಿ 20,000 ಗ್ರಾಂನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮೂಲಕ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು. ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಬ್ರಾಡ್‌ಫೋರ್ಡ್ ಅಸ್ಸೇ (ಬಯೋ-ರಾಡ್) ಮೂಲಕ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ, 20 µg MAG ಪ್ರೋಟೀನ್, 40 µg LRT ಪ್ರೋಟೀನ್, ಮತ್ತು 20 µg ಉಳಿದಿರುವ ಬೃಹತ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು MOPS ಬಫರ್ ಬಳಸಿ 10% Bis-Tris NuPAGE ನಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು iBlot2 ವರ್ಗಾವಣೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್) ಬಳಸಿ ಪಾಲಿವಿನೈಲಿಡಿನ್ ಫ್ಲೋರೈಡ್ ಪೊರೆಗಳಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು. ಪೊರೆಗಳನ್ನು 1× PBS-T (PBS ನಲ್ಲಿ 0.1% Tween-20) ನಲ್ಲಿ ಎರಡು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಒಡಿಸ್ಸಿ ಬ್ಲಾಕಿಂಗ್ ಬಫರ್ (Li-Cor) ನಲ್ಲಿ 22°C ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲಾಯಿತು. ಕಸ್ಟಮ್ ಮೊಲದ ವಿರೋಧಿ EPP ಪಾಲಿಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯ (ಬ್ಲಾಕಿಂಗ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ 1:700) ಮತ್ತು ಇಲಿ ವಿರೋಧಿ ಆಕ್ಟಿನ್ ಮಾನೋಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯ MAC237 (Abeam; 1:4,000) ನೊಂದಿಗೆ ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ 4 °C ನಲ್ಲಿ ಪೊರೆಗಳನ್ನು ಅಲ್ಲಾಡಿಸಲಾಯಿತು. ಪೊರೆಗಳನ್ನು PBS-T ಯಿಂದ ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ದ್ವಿತೀಯ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳೊಂದಿಗೆ (ಕತ್ತೆ ವಿರೋಧಿ ಮೊಲ 800CW ಮತ್ತು ಮೇಕೆ ವಿರೋಧಿ ಇಲಿ 680LT (Li-Cor), ಎರಡೂ 1:20,000) 0.01% ಹೊಂದಿರುವ ಬ್ಲಾಕಿಂಗ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. 22 °C ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆಯವರೆಗೆ SDS ಮತ್ತು 0.2% Tween -20. ಪೊರೆಗಳನ್ನು PBS-T ಯಿಂದ ತೊಳೆದು ಒಡಿಸ್ಸಿ CLx ಸ್ಕ್ಯಾನರ್‌ನಿಂದ ಚಿತ್ರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ ಇಮೇಜ್ ಸ್ಟುಡಿಯೋದಲ್ಲಿ ಸಂಸ್ಕರಿಸಲಾಗಿದೆ (ಆವೃತ್ತಿ 5.2). EPP-RA ಐಸೋಫಾರ್ಮ್ (82 kDa) ಗೆ ಅನುಗುಣವಾದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಬ್ಯಾಂಡ್ ಪತ್ತೆಯಾಗಿಲ್ಲ.
EPP ಯ ಕೋಡಿಂಗ್ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು (ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್ ಫಾಸ್ಫೇಟೇಸ್ ಡೊಮೇನ್ ಹೊಂದಿರುವ ಐಸೋಫಾರ್ಮ್ AGAP002463-RB, NCBI ಸಂರಕ್ಷಿತ ಡೊಮೇನ್ ಹುಡುಕಾಟ 34) ಮತ್ತು EcK2 (AGAP002181) pET-21a(+) ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ (ನೊವಾಜೆನ್ ಮಿಲಿಪೋರ್ ಸಿಗ್ಮಾ) ಆಗಿ ಕ್ಲೋನ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ; ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಕೋಷ್ಟಕ 2 ರಲ್ಲಿ ಪಟ್ಟಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. pET-21a(+)-EcK2 ರಚನೆಯ C-ಟರ್ಮಿನಲ್ 6xHis ಟ್ಯಾಗ್‌ಗೆ ಮೊದಲು ಎಂಟು GS4 ಲಿಂಕರ್‌ಗಳನ್ನು (ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ) ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. NEBExpress ಕೋಶ-ಮುಕ್ತ E. ಕೋಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂಶ್ಲೇಷಣಾ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು (ನ್ಯೂ ಇಂಗ್ಲೆಂಡ್ ಬಯೋಲ್ಯಾಬ್ಸ್) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮರುಸಂಯೋಜಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲಾಯಿತು. NEBExpress Ni ಸ್ಪಿನ್ ಕಾಲಮ್‌ಗಳನ್ನು (ನ್ಯೂ ಇಂಗ್ಲೆಂಡ್ ಬಯೋಲ್ಯಾಬ್ಸ್) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮರುಸಂಯೋಜಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಯಿತು. NEBExpress ಕೋಶ-ಮುಕ್ತ E. ಕೋಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂಶ್ಲೇಷಣಾ ಕಿಟ್‌ನಿಂದ DNA ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಬಳಸಿ ಡೈಹೈಡ್ರೊಫೊಲೇಟ್ ರಿಡಕ್ಟೇಸ್ (DHFR) ನಿಯಂತ್ರಣ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು PBS ನಲ್ಲಿ -20 °C ನಲ್ಲಿ 3 ತಿಂಗಳವರೆಗೆ 50% ಗ್ಲಿಸರಾಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ.
EPP ಮತ್ತು ಅಂಗಾಂಶ ಸಾರಗಳ ಫಾಸ್ಫೇಟೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು 4-ನೈಟ್ರೋಫಿನೈಲ್ ಫಾಸ್ಫೇಟ್ (pNPP; ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) ಬಳಸಿ ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾ ಬಫರ್ 25 mM ಟ್ರಿಸ್, 50 mM ಅಸಿಟಿಕ್ ಆಮ್ಲ, 25 mM ಬಿಸ್-ಟ್ರಿಸ್, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, ಮತ್ತು 1 mM DTT ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿತ್ತು. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಅಂಗಾಂಶವನ್ನು ಏಕರೂಪಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮೂಲಕ ಜೀವಕೋಶದ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು. 2.5 mg ml-1 pNPP ಹೊಂದಿರುವ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾ ಬಫರ್‌ಗೆ ಕಿಣ್ವ ಅಥವಾ ಅಂಗಾಂಶ ಸಾರವನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿ. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು pNPP ಯಿಂದ ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾದ pNP ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ವಿವಿಧ ಸಮಯಗಳಲ್ಲಿ 405 nm ನಲ್ಲಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲಾಯಿತು.
ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ EcK ಚಟುವಟಿಕೆಗಾಗಿ, ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು 27 °C ನಲ್ಲಿ 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP ಮತ್ತು 10 mM MgCl2 ಹೊಂದಿರುವ 200 µl ಬಫರ್ (pH 7.5) ನಲ್ಲಿ 0.2 mg 20E ಅಥವಾ 3D20E ನೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. 800 µl ಮೆಥನಾಲ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಿಲ್ಲಿಸಲಾಯಿತು, ನಂತರ -20 °C ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ ತಂಪಾಗಿಸಿ, ನಂತರ 4 °C ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 20,000 ಗ್ರಾಂ ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಸೂಪರ್ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು HPLC-MS/MS ಮೂಲಕ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. ನಿಯಂತ್ರಣ ಗುಂಪಿನಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಶಾಖ-ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲು, ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು PBS ನಲ್ಲಿ 50% ಗ್ಲಿಸರಾಲ್‌ನಲ್ಲಿ 95 °C ನಲ್ಲಿ 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು.
ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಇಪಿಪಿ ಚಟುವಟಿಕೆಗಾಗಿ, ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು 27 °C ನಲ್ಲಿ 3 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ 25 mM Tris, 50 mM ಅಸಿಟಿಕ್ ಆಮ್ಲ, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, ಮತ್ತು 1 mM DTT ಹೊಂದಿರುವ 100 µl ಬಫರ್ (pH 7.5) ನಲ್ಲಿ 3D20E22P (HPLC-MS/MS ನಿಂದ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟ 18 ಜೋಡಿ MAG ಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಪ್ರಮಾಣಕ್ಕೆ ಸಮನಾಗಿರುತ್ತದೆ) ನೊಂದಿಗೆ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. 400 µl ಮೆಥನಾಲ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಿಲ್ಲಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು -20 °C ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ ತಂಪಾಗಿಸಲಾಯಿತು, ನಂತರ 4 °C ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 20,000 ಗ್ರಾಂ ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಸೂಪರ್ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು HPLC-MS/MS ನಿಂದ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು.
ಮಿಶ್ರ-ಲಿಂಗದ ತಲೆಯಿಲ್ಲದ ಸೊಳ್ಳೆ ಶವಗಳಿಂದ ತಯಾರಿಸಿದ ಸಿಡಿಎನ್‌ಎಯಿಂದ ಇಪಿಪಿ (362 ಬಿಪಿ), ಇಸಿಕೆ 1 (ಎಜಿಎಪಿ 004574, 365 ಬಿಪಿ) ಮತ್ತು ಇಸಿಕೆ 2 (556 ಬಿಪಿ) ಗಾಗಿ ಪಿಸಿಆರ್ ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ವರ್ಧಿಸಲಾಯಿತು. ಇಜಿಎಫ್‌ಪಿ ನಿಯಂತ್ರಣದ ಪಿಸಿಆರ್ ತುಣುಕು (495 ಬಿಪಿ) ಅನ್ನು ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದ ಪಿಸಿಆರ್ 2.1-ಇಜಿಎಫ್‌ಪಿಯಿಂದ ವರ್ಧಿಸಲಾಗಿದೆ; PCR ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಕೋಷ್ಟಕ 2 ರಲ್ಲಿ ಪಟ್ಟಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. PCR ತುಣುಕನ್ನು pL4440 ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ನಲ್ಲಿ ತಲೆಕೆಳಗಾದ T7 ಪ್ರವರ್ತಕಗಳ ನಡುವೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ರಚನೆಗಳನ್ನು NEB 5-α ಸಮರ್ಥ E. ಕೋಲಿ (ನ್ಯೂ ಇಂಗ್ಲೆಂಡ್ ಬಯೋಲಾಬ್ಸ್) ನಿಂದ ಮರುಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಬಳಕೆಗೆ ಮೊದಲು DNA ಅನುಕ್ರಮದಿಂದ ಪರಿಶೀಲಿಸಲಾಗಿದೆ (ಇನ್ಸರ್ಟ್ ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕಾಗಿ ಪೂರಕ ದತ್ತಾಂಶ 1 ನೋಡಿ). T7 ಪ್ರವರ್ತಕಕ್ಕೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುವ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು (ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಕೋಷ್ಟಕ 2) pL4440-ಆಧಾರಿತ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ನಿಂದ ಇನ್ಸರ್ಟ್ ಅನ್ನು ವರ್ಧಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ. PCR ಉತ್ಪನ್ನದ ಗಾತ್ರವನ್ನು ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಮೂಲಕ ದೃಢಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮೆಗಾಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ T7 ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಕಿಟ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್) ಬಳಸಿ PCR ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಂದ dsRNA ಅನ್ನು ಲಿಪ್ಯಂತರ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳೊಂದಿಗೆ ತಯಾರಕರ ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಯಿತು.
ಡಿಎಸ್ಆರ್ಎನ್ಎ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್‌ಗಾಗಿ, 1,380 ಎನ್ಜಿ ಡಿಎಸ್ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ (ಡಿಎಸ್‌ಜಿಎಫ್‌ಪಿ, ಡಿಎಸ್‌ಇಸಿಕೆ1, ಡಿಎಸ್‌ಇಸಿಕೆ2, ಡಿಎಸ್‌ಇಪಿಪಿ) ಅನ್ನು 10 ಎನ್ಜಿ ಎನ್ಎಲ್-1 ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ವಯಸ್ಕ ಗಂಡು ಅಥವಾ ಹೆಣ್ಣು (ನ್ಯಾನೊಜೆಕ್ಟ್ III, ಡ್ರಮ್ಮಂಡ್) ಎದೆಗೂಡಿಗೆ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು. ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆ, ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು ಆರ್‌ಟಿ-ಕ್ಯೂಪಿಸಿಆರ್ ಮೂಲಕ ಕನಿಷ್ಠ ಮೂರು ಜೈವಿಕ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳಲ್ಲಿ ಜೀನ್ ನಾಕ್‌ಡೌನ್ ಮಟ್ಟವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಯಿತು. ಎಕ್ಡಿಸೋನ್ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್‌ಗಾಗಿ, 4 ದಿನಗಳ ಕನ್ಯೆ ಅಥವಾ 6 ದಿನಗಳ ಕನ್ಯೆ ರಕ್ತ-ಪಾನ ಮಾಡಿದ ಹೆಣ್ಣುಮಕ್ಕಳಿಗೆ ಕ್ರಮವಾಗಿ 1.3, 2.1 ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ 20E ನ 0.13, 0.21, ಅಥವಾ 0.63 µg ಅಥವಾ 3D20E (ನ್ಯಾನೊಜೆಕ್ಟ್ III, ಡ್ರಮ್ಮಂಡ್) ಅನ್ನು ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು, ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ವಿನ್ಯಾಸ ಅಥವಾ 6.3 ಎನ್ಜಿ ಎನ್ಎಲ್-1 ಅನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿ. 10% ನ 100 ಎನ್ಎಲ್ ಅನ್ನು ಚುಚ್ಚುಮದ್ದು ಮಾಡಿ. (ಸಂಪುಟ/ಸಂಪುಟ) ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಎಥೆನಾಲ್; 10% ಎಥೆನಾಲ್‌ನಲ್ಲಿ 3D20E22P ನ 100 nl (ಒಂದು ಜೋಡಿ MAG ಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಪ್ರಮಾಣದ 75% ಗೆ ಸಮ). ಸೊಳ್ಳೆಗಳನ್ನು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕವಾಗಿ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಗುಂಪಿಗೆ ನಿಯೋಜಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಮೊಟ್ಟೆಯಿಡುವ ಪರೀಕ್ಷೆಗಳಿಗಾಗಿ, 3 ದಿನಗಳ ಹೆಣ್ಣು ಹೆಣ್ಣುಗಳಿಗೆ ಮಾನವ ರಕ್ತವನ್ನು ಉಚಿತವಾಗಿ ನೀಡಲಾಗುತ್ತಿತ್ತು. ಭಾಗಶಃ ಆಹಾರ ನೀಡಿದ ಅಥವಾ ಆಹಾರ ನೀಡದ ಸೊಳ್ಳೆಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ. ಚಿಕಿತ್ಸೆಯನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿ, ರಕ್ತದ ಊಟದ ನಂತರ ಕನಿಷ್ಠ 48 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಹೆಣ್ಣುಮಕ್ಕಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಮೊಟ್ಟೆಯಿಡುವ ಕಪ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ನಾಲ್ಕು ರಾತ್ರಿಗಳವರೆಗೆ ಇರಿಸಲಾಗುತ್ತಿತ್ತು. ಮೊಟ್ಟೆಗಳನ್ನು ಸ್ಟೀರಿಯೊಸ್ಕೋಪ್ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಎಣಿಸಲಾಗುತ್ತಿತ್ತು (ಸ್ಟೆಮಿ 508, ಝೈಸ್); ಸಂಯೋಗ ಹೊಂದಿದ ಹೆಣ್ಣುಗಳಿಗೆ, ಲಾರ್ವಾಗಳಾಗಿ ಹೊರಬಂದ ಮೊಟ್ಟೆಗಳನ್ನು ಫಲವತ್ತಾಗಿ ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗುತ್ತಿತ್ತು.
ಸಂಯೋಗ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗಾಗಿ, ಚಿಕಿತ್ಸೆಯನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿ ಹೆಣ್ಣು ಪ್ರಾಣಿಗಳಿಗೆ ಸಂಯೋಗಕ್ಕೆ ಪ್ರತಿರೋಧವನ್ನು ಬೆಳೆಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಕನಿಷ್ಠ 2 ದಿನಗಳವರೆಗೆ ಅವಕಾಶ ನೀಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕಾಡು-ಪ್ರಕಾರದ ವಯಸ್ಸಿಗೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುವ ಗಂಡು ಪ್ರಾಣಿಗಳನ್ನು ತರುವಾಯ ಅದೇ ಪಂಜರದಲ್ಲಿ ಪರಿಚಯಿಸಲಾಯಿತು. ಎರಡು ರಾತ್ರಿಗಳ ನಂತರ, ಹೆಣ್ಣು ಫಲವತ್ತಾದ ಕೋಶಕಗಳನ್ನು ಛೇದಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, ಮತ್ತು 25 mM NaCl (pH 8.2) ಹೊಂದಿರುವ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಫ್ರೀಜ್-ಲೇಪ ಮತ್ತು ಸೋನಿಕೇಶನ್ ಮೂಲಕ ಜೀನೋಮಿಕ್ DNA ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಮಾದರಿಗಳನ್ನು 55 °C ನಲ್ಲಿ 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಪ್ರೋಟೀನೇಸ್ K (0.86 µg µl-1) ನೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು, ನಂತರ 95 °C ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಇಡಲಾಯಿತು. ಕಚ್ಚಾ ಜೀನೋಮಿಕ್ DNA ಸಿದ್ಧತೆಗಳನ್ನು 10 ಪಟ್ಟು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು Y ಕ್ರೋಮೋಸೋಮ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳ qPCR ಪತ್ತೆಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು; ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿಸ್ತೃತ ಡೇಟಾ ಕೋಷ್ಟಕ 2 ರಲ್ಲಿ ಪಟ್ಟಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. Y ಕ್ರೋಮೋಸೋಮ್ ಅನುಕ್ರಮದ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯು ಸಂಯೋಗವಿಲ್ಲ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಮರು-ಸಂಯೋಗ ಪರೀಕ್ಷೆಗಳಿಗಾಗಿ, ಬಲವಂತದ-ಸಂಯೋಗಗೊಂಡ ಹೆಣ್ಣುಗಳನ್ನು ಸಂಯೋಗದ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸಲು ಸಂಯೋಗದ ಪ್ಲಗ್‌ಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಗಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ 36 ಗಂಡುಗಳ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಸಂಯೋಗಕ್ಕೆ ವಕ್ರೀಭವನವನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಲು 2 ದಿನಗಳವರೆಗೆ ಅವಕಾಶ ನೀಡಲಾಯಿತು. ನಂತರ DsRed ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಜೆನಿಕ್ ವೀರ್ಯವನ್ನು ಹೊತ್ತ ಗಂಡುಗಳನ್ನು ಹೆಣ್ಣು ಪಂಜರಗಳಿಗೆ ಪರಿಚಯಿಸಲಾಯಿತು. ಎರಡು ರಾತ್ರಿಗಳ ನಂತರ, ಫಲೀಕರಣಗೊಳ್ಳುವ ಕೋಶಕಗಳನ್ನು ಹೆಣ್ಣುಗಳಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ತಯಾರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಡಿಎಸ್‌ರೆಡ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಜೀನ್‌ನ qPCR ಪತ್ತೆಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು; ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿಸ್ತೃತ ದತ್ತಾಂಶ ಕೋಷ್ಟಕ 2 ರಲ್ಲಿ ಪಟ್ಟಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಡಿಎಸ್‌ರೆಡ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಜೀನ್‌ನ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯು ಯಾವುದೇ ಮರು-ಸಂಯೋಗ ಸಂಭವಿಸಿಲ್ಲ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
3D20E ಅನ್ನು ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು 37. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, 20E (ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) ನ 10 ಮಿಗ್ರಾಂ ಅನ್ನು 10 ಮಿಲಿ ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಕರಗಿಸಿ, ನಂತರ 30 ಮಿಗ್ರಾಂ ಪ್ಲಾಟಿನಂ ಕಪ್ಪು (ಪುಡಿ ರೂಪದಲ್ಲಿ, ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಕಲಕಿದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾ ಮಿಶ್ರಣಕ್ಕೆ O2 ನ ಸೌಮ್ಯವಾದ ಹರಿವನ್ನು ನಿರಂತರವಾಗಿ ಗುಳ್ಳೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು. 6 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಿಲ್ಲಿಸಲು 30 ಮಿಲಿ ಮೆಥನಾಲ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ವೇಗವರ್ಧಕ ಕಣಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಾತದಲ್ಲಿ ಸೂಪರ್ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಒಣಗಲು ಆವಿಯಾಯಿತು. ಒಣಗಿದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾ ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು HPLC-MS/MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ಗಾಗಿ 10% ಎಥೆನಾಲ್ ಮತ್ತು ಮೆಥನಾಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಕರಗಿಸಲಾಯಿತು. ಪರಿವರ್ತನೆ ದರ (20E ನಿಂದ 3D20E ವರೆಗೆ) ಸರಿಸುಮಾರು 97% (ಚಿತ್ರ 4b), ಮತ್ತು ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ 3D20E ನ MS ವರ್ಣಪಟಲವು ಸಂಯೋಗಗೊಂಡ ಹೆಣ್ಣುಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವಂತೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಯಿತು (ಚಿತ್ರ 4c).
ಲೆಜೆಂಡ್ ನಡೆಸಿದ ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ಪರೀಕ್ಷೆಗಳ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವಿವರಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ. ಫಿಶರ್‌ನ ನಿಖರ ಪರೀಕ್ಷೆ, ಮಾಂಟೆಲ್-ಕಾಕ್ಸ್ ಪರೀಕ್ಷೆ ಮತ್ತು ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿಗಳ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ಗ್ರಾಫ್‌ಪ್ಯಾಡ್ (ಆವೃತ್ತಿ 9.0) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಕೊಕ್ರಾನ್-ಮಾಂಟೆಲ್-ಹೇನ್ಸ್‌ಜೆಲ್ ಪರೀಕ್ಷೆಗಳನ್ನು ಕಸ್ಟಮ್ ಆರ್ ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಬಳಸಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test ನಲ್ಲಿ ಲಭ್ಯವಿದೆ). 0.05 ರ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯ ಮಿತಿಯೊಂದಿಗೆ ಶಾಪಿರೊ-ವಿಲ್ಕ್ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಡೇಟಾ ವಿತರಣೆಯನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯತೆಗಾಗಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು. ಡೇಟಾವು ಸಾಮಾನ್ಯತೆಯ ಪರೀಕ್ಷೆಯಲ್ಲಿ ವಿಫಲವಾದಾಗ, ಮನ್-ವಿಟ್ನಿ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಮಾಂಟೆಲ್-ಕಾಕ್ಸ್ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಬದುಕುಳಿಯುವ ಡೇಟಾವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. RNA-seq ಜೀನ್-ಮಟ್ಟದ ಡಿಫರೆನ್ಷಿಯಲ್ ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ರೆಶನ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು DESeq2 ಪ್ಯಾಕೇಜ್ (ಆವೃತ್ತಿ 1.28.1) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು.ಗ್ರಾಫ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಸಮತಲ ಪಟ್ಟಿಯು ಸರಾಸರಿಯನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. ಎಲ್ಲಾ ಪರೀಕ್ಷೆಗಳಿಗೆ P = 0.05 ರ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯ ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಮಿತಿಯಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.
ಅಧ್ಯಯನ ವಿನ್ಯಾಸದ ಕುರಿತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಾಹಿತಿಗಾಗಿ, ಈ ಲೇಖನಕ್ಕೆ ಲಿಂಕ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರಕೃತಿ ಸಂಶೋಧನಾ ವರದಿಯ ಸಾರಾಂಶವನ್ನು ನೋಡಿ.
MS ಪ್ರೋಟಿಯೋಮಿಕ್ ಡೇಟಾವನ್ನು PRIDE ಪಾಲುದಾರ ರೆಪೊಸಿಟರಿ (https://www.ebi.ac.uk/pride/) ಮೂಲಕ PXD032157 ಡೇಟಾಸೆಟ್ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಪ್ರೋಟಿಯೋಮ್‌ಎಕ್ಸ್‌ಚೇಂಜ್ ಕನ್ಸೋರ್ಟಿಯಂ (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ಗೆ ಠೇವಣಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.
RNA-seq ಡೇಟಾಸೆಟ್ ಅನ್ನು ಜೀನ್ ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ರೆಶನ್ ಕಾಂಪ್ರಹೆನ್ಸಿವ್ ಲೈಬ್ರರಿಯಲ್ಲಿ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) GSE198665 ಸರಣಿ ದಾಖಲೆಯ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಪ್ರಸ್ತುತ ಅಧ್ಯಯನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ರಚಿಸಲಾದ ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾದ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಡೇಟಾಸೆಟ್‌ಗಳನ್ನು ಸಮಂಜಸವಾದ ವಿನಂತಿಯ ಮೇರೆಗೆ ಸಂಬಂಧಿತ ಲೇಖಕರಿಂದ ಪಡೆಯಬಹುದು. ಈ ಲೇಖನವು ಮೂಲ ಡೇಟಾವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.
ಡಿ ಲೂಫ್, ಎ. ಎಕ್ಡಿಸ್ಟೀರಾಯ್ಡ್ಸ್: ನಿರ್ಲಕ್ಷ್ಯಗೊಂಡ ಕೀಟ ಲೈಂಗಿಕ ಸ್ಟೀರಾಯ್ಡ್‌ಗಳು? ಪುರುಷ: ಬ್ಲಾಕ್ ಬಾಕ್ಸ್. ಕೀಟ ವಿಜ್ಞಾನ.13, 325–338 (2006).
ರೆಡ್‌ಫರ್ನ್, ಸಿಪಿಎಫ್ 20-ಹೈಡ್ರಾಕ್ಸಿಎಕ್ಡಿಸೋನ್ ಮತ್ತು ಅನಾಫಿಲಿಸ್ ಸ್ಟೀಫನ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಅಂಡಾಶಯದ ಬೆಳವಣಿಗೆ. ಜೆ. ಕೀಟ ಶರೀರಶಾಸ್ತ್ರ. 28, 97–109 (1982).