ಇಮ್ಯುನೊಮಾಡ್ಯುಲೇಟರಿ ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್‌ಗಳು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಪರಿಸರದ (TME) ಪ್ರಮುಖ ಲಕ್ಷಣವಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ಕೆಲವು ವಿನಾಯಿತಿಗಳೊಂದಿಗೆ, ಅವುಗಳ ಗುರುತುಗಳು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ತಿಳಿದಿಲ್ಲ. ಇಲ್ಲಿ, ಈ ವಿಭಿನ್ನ TME ವಿಭಾಗಗಳ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಲು ನಾವು ಹೈ-ಗ್ರೇಡ್ ಸೀರಸ್ ಕಾರ್ಸಿನೋಮ (HGSC) ಹೊಂದಿರುವ ರೋಗಿಗಳ ಗೆಡ್ಡೆಗಳು ಮತ್ತು ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳಿಂದ ಗೆಡ್ಡೆಗಳು ಮತ್ತು T ಕೋಶಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆ ಕೋಶಗಳು ವ್ಯಾಪಕವಾದ ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ. ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ಗೆಡ್ಡೆ-ಒಳನುಸುಳುವ T ಕೋಶಗಳು 1-ಮೀಥೈಲ್ನಿಕೋಟಿನಮೈಡ್ (MNA) ನಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಸಮೃದ್ಧವಾಗಿವೆ. T ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ MNA ಮಟ್ಟವು ಹೆಚ್ಚಿದ್ದರೂ, ನಿಕೋಟಿನಮೈಡ್ N-ಮೀಥೈಲ್‌ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫರೇಸ್ (S-ಅಡೆನೊಸಿಲ್ಮೆಥಿಯೋನಿನ್‌ನಿಂದ ನಿಕೋಟಿನಮೈಡ್‌ಗೆ ಮೀಥೈಲ್ ಗುಂಪುಗಳ ವರ್ಗಾವಣೆಯನ್ನು ವೇಗವರ್ಧಿಸುವ ಕಿಣ್ವ) ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಫೈಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆ ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ. ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕವಾಗಿ, MNA ಗೆಡ್ಡೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುವ ಸೈಟೊಕಿನ್ ಟ್ಯೂಮರ್ ನೆಕ್ರೋಸಿಸ್ ಫ್ಯಾಕ್ಟರ್ ಆಲ್ಫಾವನ್ನು ಸ್ರವಿಸಲು T ಕೋಶಗಳನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, TME-ಪಡೆದ MNA T ಜೀವಕೋಶಗಳ ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ನಿಯಂತ್ರಣಕ್ಕೆ ಕೊಡುಗೆ ನೀಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮಾನವ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಾಗಿ ಸಂಭಾವ್ಯ ಇಮ್ಯುನೊಥೆರಪಿ ಗುರಿಯನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ.
ಗೆಡ್ಡೆಯಿಂದ ಪಡೆದ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಗಳು ಗೆಡ್ಡೆ-ವಿರೋಧಿ ರೋಗನಿರೋಧಕ ಶಕ್ತಿಯ ಮೇಲೆ ಆಳವಾದ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಬೀರುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ರೋಗದ ಪ್ರಗತಿಗೆ ಅವು ಪ್ರಮುಖ ಪ್ರೇರಕ ಶಕ್ತಿಯಾಗಿಯೂ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ಹೆಚ್ಚು ಹೆಚ್ಚು ಪುರಾವೆಗಳು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ (1). ವಾರ್ಬರ್ಗ್ ಪರಿಣಾಮದ ಜೊತೆಗೆ, ಗೆಡ್ಡೆಯ ಕೋಶಗಳ ಚಯಾಪಚಯ ಸ್ಥಿತಿ ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಪರಿಸರದ (TME) ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ಸ್ಥಿತಿಯೊಂದಿಗಿನ ಅದರ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು ಇತ್ತೀಚಿನ ಕೆಲಸಗಳು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿವೆ. ಮೌಸ್ ಮಾದರಿಗಳು ಮತ್ತು ಮಾನವ ಟಿ ಕೋಶಗಳ ಮೇಲಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಗ್ಲುಟಾಮಿನ್ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆ (2), ಆಕ್ಸಿಡೇಟಿವ್ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆ (3) ಮತ್ತು ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆ (4) ವಿವಿಧ ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ಕೋಶ ಉಪಗುಂಪುಗಳ ಮೇಲೆ ಸ್ವತಂತ್ರವಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು ಎಂದು ತೋರಿಸಿವೆ. ಈ ಮಾರ್ಗಗಳಲ್ಲಿನ ಹಲವಾರು ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಗಳು ಟಿ ಕೋಶಗಳ ಆಂಟಿ-ಟ್ಯೂಮರ್ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತವೆ. ಟೆಟ್ರಾಹೈಡ್ರೊಬಯೋಪ್ಟೆರಿನ್ (BH4) ಎಂಬ ಸಹಕಿಣ್ವದ ದಿಗ್ಬಂಧನವು T ಕೋಶಗಳ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ಹಾನಿಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ದೇಹದಲ್ಲಿ BH4 ನ ಹೆಚ್ಚಳವು CD4 ಮತ್ತು CD8 ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ವಹಿಸುವ ಆಂಟಿ-ಟ್ಯೂಮರ್ ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸಾಬೀತಾಗಿದೆ. ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, BH4 (5) ನ ಆಡಳಿತದಿಂದ ಕೈನುರೆನೈನ್‌ನ ಇಮ್ಯುನೊಸಪ್ರೆಸಿವ್ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಉಳಿಸಬಹುದು. ಐಸೊಸಿಟ್ರೇಟ್ ಡಿಹೈಡ್ರೋಜಿನೇಸ್ (IDH) ರೂಪಾಂತರಿತ ಗ್ಲಿಯೊಬ್ಲಾಸ್ಟೊಮಾದಲ್ಲಿ, ಎನಾಂಟಿಯೊಮೆಟಾಬಾಲಿಕ್ (R)-2-ಹೈಡ್ರಾಕ್ಸಿಗ್ಲುಟರೇಟ್ (R-2-HG) ಸ್ರವಿಸುವಿಕೆಯು T ಕೋಶ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆ, ಪ್ರಸರಣ ಮತ್ತು ಸೈಟೋಲಿಸಿಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ (6). ಇತ್ತೀಚೆಗೆ, ಗ್ಲೈಕೋಲಿಸಿಸ್‌ನ ಉಪ-ಉತ್ಪನ್ನವಾದ ಮೀಥೈಲ್ಗ್ಲಿಯಾಕ್ಸಲ್, ಮೈಲೋಯ್ಡ್ ಮೂಲದ ಸಪ್ರೆಸರ್ ಕೋಶಗಳಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮೀಥೈಲ್ಗ್ಲಿಯಾಕ್ಸಲ್‌ನ T ಕೋಶ ವರ್ಗಾವಣೆಯು ಎಫೆಕ್ಟರ್ T ಕೋಶ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಚಿಕಿತ್ಸೆಯಲ್ಲಿ, ಮೀಥೈಲ್ಗ್ಲಿಯಾಕ್ಸಲ್‌ನ ತಟಸ್ಥೀಕರಣವು ಮೈಲೋಯ್ಡ್-ಪಡೆದ ಸಪ್ರೆಸರ್ ಕೋಶಗಳ (MDSC) ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಿವಾರಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮೌಸ್ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಚೆಕ್‌ಪಾಯಿಂಟ್ ದಿಗ್ಬಂಧನ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯನ್ನು ಸಿನರ್ಜಿಸ್ಟಿಕಲ್ ಆಗಿ ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ (7). ಈ ಅಧ್ಯಯನಗಳು T ಕೋಶ ಕಾರ್ಯ ಮತ್ತು ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವಲ್ಲಿ TME-ಪಡೆದ ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್‌ಗಳ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಒಟ್ಟಾಗಿ ಒತ್ತಿಹೇಳುತ್ತವೆ.
ಅಂಡಾಶಯದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ನಲ್ಲಿ ಟಿ ಕೋಶ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ವರದಿಯಾಗಿದೆ (8). ಇದು ಹೈಪೋಕ್ಸಿಯಾ ಮತ್ತು ಅಸಹಜ ಗೆಡ್ಡೆಯ ನಾಳೀಯ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಲ್ಲಿ ಅಂತರ್ಗತವಾಗಿರುವ ಚಯಾಪಚಯ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳಿಂದಾಗಿ (9), ಇದು ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಮತ್ತು ಟ್ರಿಪ್ಟೊಫಾನ್ ಅನ್ನು ಲ್ಯಾಕ್ಟಿಕ್ ಆಮ್ಲ ಮತ್ತು ಕೈನುರೆನಿನ್‌ನಂತಹ ಉಪ-ಉತ್ಪನ್ನಗಳಾಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಲು ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. ಅತಿಯಾದ ಬಾಹ್ಯಕೋಶೀಯ ಲ್ಯಾಕ್ಟೇಟ್ ಇಂಟರ್ಫೆರಾನ್-γ (IFN-γ) ಉತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮೈಲೋಸಪ್ರೆಸಿವ್ ಉಪಗುಂಪುಗಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ (10, 11). ಟ್ರಿಪ್ಟೊಫಾನ್ ಸೇವನೆಯು ನೇರವಾಗಿ ಟಿ ಕೋಶ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಟಿ ಕೋಶ ಗ್ರಾಹಕ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ (12-14). ಈ ಅವಲೋಕನಗಳ ಹೊರತಾಗಿಯೂ, ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಸುತ್ತಲಿನ ಬಹಳಷ್ಟು ಕೆಲಸವನ್ನು ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಟಿ ಕೋಶ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯಲ್ಲಿ ಅತ್ಯುತ್ತಮ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನಡೆಸಲಾಯಿತು, ಅಥವಾ ಇನ್ ವಿವೊದಲ್ಲಿ ಹೋಮೋಲೋಗಸ್ ಮೌಸ್ ಮಾದರಿಗಳಿಗೆ ಸೀಮಿತವಾಗಿತ್ತು, ಇವೆರಡೂ ಮಾನವ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ಗಳ ವೈವಿಧ್ಯತೆ ಮತ್ತು ಶಾರೀರಿಕ ಮ್ಯಾಕ್ರೋ ಮತ್ತು ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಪರಿಸರವನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುವುದಿಲ್ಲ.
ಅಂಡಾಶಯದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ನ ಸಾಮಾನ್ಯ ಲಕ್ಷಣವೆಂದರೆ ಪೆರಿಟೋನಿಯಲ್ ಹರಡುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳ ನೋಟ. ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಜೀವಕೋಶದ ದ್ರವದ ಶೇಖರಣೆಯು ಮುಂದುವರಿದ ಕಾಯಿಲೆ ಮತ್ತು ಕಳಪೆ ಮುನ್ನರಿವಿನೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ (15). ವರದಿಗಳ ಪ್ರಕಾರ, ಈ ವಿಶಿಷ್ಟ ವಿಭಾಗವು ಹೈಪೋಕ್ಸಿಕ್ ಆಗಿದೆ, ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟದ ನಾಳೀಯ ಎಂಡೋಥೀಲಿಯಲ್ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಅಂಶ (VEGF) ಮತ್ತು ಇಂಡೋಲಿಯಮೈನ್ 2,3-ಡಯಾಕ್ಸಿಜೆನೇಸ್ (IDO) ಅನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಮತ್ತು T ನಿಯಂತ್ರಕ ಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು ಮೈಲೋಯ್ಡ್ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಕೋಶಗಳಿಂದ ಒಳನುಸುಳುತ್ತದೆ (15-18). ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳ ಚಯಾಪಚಯ ಪರಿಸರವು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಪರಿಸರಕ್ಕಿಂತ ಭಿನ್ನವಾಗಿರಬಹುದು, ಆದ್ದರಿಂದ ಪೆರಿಟೋನಿಯಲ್ ಜಾಗದಲ್ಲಿ T ಕೋಶಗಳ ಮರು ಪ್ರೋಗ್ರಾಮಿಂಗ್ ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿಲ್ಲ. ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಗೆಡ್ಡೆಯ ಪರಿಸರದಲ್ಲಿ ಇರುವ ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್‌ಗಳ ನಡುವಿನ ಪ್ರಮುಖ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳು ಮತ್ತು ವೈವಿಧ್ಯತೆಯು ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ಕೋಶಗಳ ಒಳನುಸುಳುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಗಳ ಮೇಲೆ ಅವುಗಳ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ತಡೆಯಬಹುದು ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಶೋಧನೆ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.
ಈ ಸಮಸ್ಯೆಗಳನ್ನು ಪರಿಹರಿಸಲು, ನಾವು ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಕೋಶ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ ಮತ್ತು ದ್ರವ ವರ್ಣತಂತು ಟ್ಯಾಂಡೆಮ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ (LC-MS/MS) ವಿಧಾನವನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ವಿವಿಧ ಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳನ್ನು (CD4 + ಮತ್ತು CD8 + T ಕೋಶಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಂತೆ) ಹಾಗೂ ಗೆಡ್ಡೆಗಳ ಒಳಗೆ ಮತ್ತು ನಡುವೆ ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಇದರ ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್‌ಗಳು ರೋಗಿಯ ಅದೇ ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಪರಿಸರದಲ್ಲಿ ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ವ್ಯಾಪಿಸುತ್ತವೆ. ಈ ಪ್ರಮುಖ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯ ಚಯಾಪಚಯ ಸ್ಥಿತಿಯ ಹೆಚ್ಚು ಪರಿಹರಿಸಲಾದ ಭಾವಚಿತ್ರವನ್ನು ಒದಗಿಸಲು ನಾವು ಈ ವಿಧಾನವನ್ನು ಹೈ-ಡೈಮೆನ್ಷನಲ್ ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿ ಮತ್ತು ಸಿಂಗಲ್-ಸೆಲ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ (scRNA-seq) ನೊಂದಿಗೆ ಬಳಸುತ್ತೇವೆ. ಈ ವಿಧಾನವು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಟಿ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ 1-ಮೀಥೈಲ್ನಿಕೋಟಿನಮೈಡ್ (MNA) ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು ಮತ್ತು ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಪ್ರಯೋಗಗಳು ಟಿ ಕೋಶ ಕಾರ್ಯದ ಮೇಲೆ MNA ಯ ಇಮ್ಯುನೊಮಾಡ್ಯುಲೇಟರಿ ಪರಿಣಾಮವು ಹಿಂದೆ ತಿಳಿದಿಲ್ಲ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ. ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಈ ವಿಧಾನವು ಗೆಡ್ಡೆಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ಕೋಶಗಳ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಚಯಾಪಚಯ ಸಂವಹನಗಳನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ನಿಯಂತ್ರಣ ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್‌ಗಳ ಬಗ್ಗೆ ಅನನ್ಯ ಒಳನೋಟಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಟಿ ಕೋಶ-ಆಧಾರಿತ ಅಂಡಾಶಯದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಇಮ್ಯುನೊಥೆರಪಿ ಚಿಕಿತ್ಸೆಗೆ ಉಪಯುಕ್ತವಾಗಬಹುದು. ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ಅವಕಾಶಗಳು.
ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಸೇವನೆಯನ್ನು [2-(N-(7-ನೈಟ್ರೋಫಿನೈಲ್-2-ಆಕ್ಸಾ-1,3-ಡಯಾಜಾ-4-ಯ್ಲ್)ಅಮೈನೊ)-2-ಡಿಯೋಕ್ಸಿಗ್ಲುಕೋಸ್ (2-NBDG) ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲು ನಾವು ಹೈ-ಡೈಮೆನ್ಷನಲ್ ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿಯನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಕೋಶಗಳ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸುವ ಪಕ್ಕಪಕ್ಕದ ವಿಶಿಷ್ಟ ಗುರುತುಗಳಾಗಿವೆ (ಟೇಬಲ್ S2 ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ S1A). ಈ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಟಿ ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಕೋಶಗಳು ಹೆಚ್ಚಿನ ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಸೇವನೆಯ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ, ಆದರೆ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಸಣ್ಣ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ. ಗೆಡ್ಡೆಯ ಕೋಶಗಳ ಸರಾಸರಿ ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಸೇವನೆ [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ಟಿ ಕೋಶಗಳಿಗಿಂತ ಮೂರರಿಂದ ನಾಲ್ಕು ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚು, ಮತ್ತು CD4 + T ಕೋಶಗಳ ಸರಾಸರಿ ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಸೇವನೆಯು CD8 + T ಕೋಶಗಳಿಗಿಂತ 1.2 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚು, ಇದು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಒಳನುಸುಳುವ ಲಿಂಫೋಸೈಟ್‌ಗಳು (TIL) ಒಂದೇ TME ನಲ್ಲಿಯೂ ಸಹ ವಿಭಿನ್ನ ಚಯಾಪಚಯ ಅವಶ್ಯಕತೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 1A). ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, ಗೆಡ್ಡೆಯ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿನ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯು CD4 + T ಕೋಶಗಳಂತೆಯೇ ಇರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಎರಡೂ ಜೀವಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯು CD8 + T ಕೋಶಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಾಗಿರುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 1B). ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಚಯಾಪಚಯ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸುತ್ತವೆ. ಗೆಡ್ಡೆಯ ಕೋಶಗಳ ಚಯಾಪಚಯ ಚಟುವಟಿಕೆಯು CD4 + T ಕೋಶಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು CD4 + T ಕೋಶಗಳ ಚಯಾಪಚಯ ಚಟುವಟಿಕೆಯು CD8 + T ಕೋಶಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಾಗಿರುತ್ತದೆ. ಜೀವಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳಲ್ಲಿ ಈ ಪರಿಣಾಮಗಳ ಹೊರತಾಗಿಯೂ, ಗೆಡ್ಡೆಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ CD4 + ಮತ್ತು CD8 + T ಕೋಶಗಳ ಚಯಾಪಚಯ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಅಥವಾ ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಅವುಗಳ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಸ್ಥಿರ ವ್ಯತ್ಯಾಸವಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 1C). ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, CD45-ಕೋಶದ ಭಾಗದಲ್ಲಿ, ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಗೆಡ್ಡೆಯಲ್ಲಿ EpCAM+ ಕೋಶಗಳ ಪ್ರಮಾಣವು ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 1D). EpCAM+ ಮತ್ತು EpCAM- ಕೋಶ ಘಟಕಗಳ ನಡುವೆ ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ಚಯಾಪಚಯ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ಸಹ ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ. EpCAM+ (ಗೆಡ್ಡೆ) ಜೀವಕೋಶಗಳು EpCAM- ಕೋಶಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ, ಇದು TME ಯಲ್ಲಿನ ಗೆಡ್ಡೆ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿನ ಫೈಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟ್‌ಗಳ ಚಯಾಪಚಯ ಚಟುವಟಿಕೆಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನದಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 1, E ಮತ್ತು F).
(A ಮತ್ತು B) ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಸೇವನೆಯ ಮಧ್ಯದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ತೀವ್ರತೆ (MFI) (2-NBDG) (A) ಮತ್ತು CD4 + T ಕೋಶಗಳ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಟುವಟಿಕೆ (MitoTracker ಗಾಢ ಕೆಂಪು) (B) ಪ್ರಾತಿನಿಧಿಕ ಗ್ರಾಫ್‌ಗಳು (ಎಡ) ಮತ್ತು ಕೋಷ್ಟಕ ಡೇಟಾ (ಬಲ), CD8 + T ಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು ಆಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯಿಂದ EpCAM + CD45- ಗೆಡ್ಡೆ ಕೋಶಗಳು. (C) ಆಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯಲ್ಲಿ CD4 + ಮತ್ತು CD8 + ಜೀವಕೋಶಗಳ ಅನುಪಾತ (CD3 + T ಕೋಶಗಳ). (D) ಆಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯಲ್ಲಿ EpCAM + ಗೆಡ್ಡೆ ಕೋಶಗಳ ಅನುಪಾತ (CD45−). (E ಮತ್ತು F) EpCAM + CD45- ಗೆಡ್ಡೆ ಮತ್ತು EpCAM-CD45- ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಸೇವನೆ (2-NBDG) (E) ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಟುವಟಿಕೆ (MitoTracker ಗಾಢ ಕೆಂಪು) (F) ಪ್ರಾತಿನಿಧಿಕ ಗ್ರಾಫ್‌ಗಳು (ಎಡ) ಮತ್ತು ಕೋಷ್ಟಕ ಡೇಟಾ (ಬಲ) ಆಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆ ಕೋಶಗಳು. (G) ಹರಿವಿನ ಸೈಟೊಮೆಟ್ರಿಯಿಂದ CD25, CD137 ಮತ್ತು PD1 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಪ್ರತಿನಿಧಿ ಗ್ರಾಫ್‌ಗಳು. (H ಮತ್ತು I) CD4 + T ಕೋಶಗಳು (H) ಮತ್ತು CD8 + T ಕೋಶಗಳು (I) ಮೇಲೆ CD25, CD137 ಮತ್ತು PD1 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ. (J ಮತ್ತು K) CCR7 ಮತ್ತು CD45RO ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಆಧರಿಸಿದ ನೈವ್, ಸೆಂಟ್ರಲ್ ಮೆಮೊರಿ (Tcm), ಎಫೆಕ್ಟರ್ (Teff) ಮತ್ತು ಎಫೆಕ್ಟರ್ ಮೆಮೊರಿ (Tem) ಫಿನೋಟೈಪ್‌ಗಳು. ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಗಳಲ್ಲಿ CD4 + T ಕೋಶಗಳು (J) ಮತ್ತು CD8 + T ಕೋಶಗಳು (K) ನ ಪ್ರತಿನಿಧಿ ಚಿತ್ರಗಳು (ಎಡ) ಮತ್ತು ಕೋಷ್ಟಕ ಡೇಟಾ (ಬಲ). ಜೋಡಿಯಾಗಿರುವ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಯಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಲ್ಪಟ್ಟ P ಮೌಲ್ಯಗಳು (*P<0.05, **P<0.01 ಮತ್ತು ***P<0.001). ರೇಖೆಯು ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ ರೋಗಿಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ (n = 6). FMO, ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಮೈನಸ್ ಒನ್; MFI, ಸರಾಸರಿ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ತೀವ್ರತೆ.
ಹೆಚ್ಚಿನ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಹೆಚ್ಚು ಪರಿಹರಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಟಿ ಕೋಶ ಫಿನೋಟೈಪಿಕ್ ಸ್ಥಿತಿಯ ನಡುವಿನ ಇತರ ಗಮನಾರ್ಹ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು. ಗೆಡ್ಡೆಗಳಲ್ಲಿ ಸಕ್ರಿಯಗೊಂಡ (ಚಿತ್ರ 1, G ನಿಂದ I) ಮತ್ತು ಎಫೆಕ್ಟರ್ ಮೆಮೊರಿ (ಚಿತ್ರ 1, J ಮತ್ತು K) ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳಿಗಿಂತ (CD3 + T ಕೋಶಗಳ ಅನುಪಾತ) ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಕಂಡುಬರುತ್ತದೆ. ಅದೇ ರೀತಿ, ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವ ಗುರುತುಗಳ (CD25 ಮತ್ತು CD137) ಮತ್ತು ಸವಕಳಿ ಗುರುತುಗಳ [ಪ್ರೋಗ್ರಾಮ್ ಮಾಡಲಾದ ಕೋಶ ಸಾವಿನ ಪ್ರೋಟೀನ್ 1 (PD1)] ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಿಂದ ಫಿನೋಟೈಪ್ ಅನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸುವುದರಿಂದ ಈ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯ ಚಯಾಪಚಯ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳು ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿದ್ದರೂ (ಚಿತ್ರ S1, B ನಿಂದ E), ಆದರೆ ನಿಷ್ಕಪಟ, ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಅಥವಾ ಮೆಮೊರಿ ಉಪವಿಭಾಗಗಳ ನಡುವೆ ಯಾವುದೇ ಗಮನಾರ್ಹ ಚಯಾಪಚಯ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಸ್ಥಿರವಾಗಿ ಗಮನಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ S1, F ನಿಂದ I). ಜೀವಕೋಶದ ಫಿನೋಟೈಪ್‌ಗಳನ್ನು ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತವಾಗಿ ನಿಯೋಜಿಸಲು ಯಂತ್ರ ಕಲಿಕೆಯ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸುವ ಮೂಲಕ ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಲಾಯಿತು (21), ಇದು ರೋಗಿಯ ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಮೂಳೆ ಮಜ್ಜೆಯ ಕೋಶಗಳ (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ಉಪಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು (ಚಿತ್ರ S2A). ಗುರುತಿಸಲಾದ ಎಲ್ಲಾ ಜೀವಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳಲ್ಲಿ, ಈ ಮೈಲೋಯ್ಡ್ ಜೀವಕೋಶ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯು ಅತ್ಯಧಿಕ ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ S2, B ನಿಂದ G). ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು HGSC ರೋಗಿಗಳಲ್ಲಿ ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಬಹು ಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳ ನಡುವಿನ ಬಲವಾದ ಚಯಾಪಚಯ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಎತ್ತಿ ತೋರಿಸುತ್ತವೆ.
TIL ನ ಮೆಟಾಬೊನೊಮಿಕ್ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳುವಲ್ಲಿನ ಪ್ರಮುಖ ಸವಾಲು ಎಂದರೆ ಗೆಡ್ಡೆಗಳಿಂದ ಸಾಕಷ್ಟು ಶುದ್ಧತೆ, ಗುಣಮಟ್ಟ ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣದ T ಕೋಶ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸುವ ಅಗತ್ಯ. ಇತ್ತೀಚಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಹರಿವಿನ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿಯನ್ನು ಆಧರಿಸಿದ ವಿಂಗಡಣೆ ಮತ್ತು ಮಣಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ವಿಧಾನಗಳು ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ಪ್ರೊಫೈಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಬದಲಾವಣೆಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು ಎಂದು ತೋರಿಸಿವೆ (22-24). ಈ ಸಮಸ್ಯೆಯನ್ನು ನಿವಾರಿಸಲು, LC-MS/MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ಮೊದಲು ಶಸ್ತ್ರಚಿಕಿತ್ಸೆಯಿಂದ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾದ ಮಾನವ ಅಂಡಾಶಯದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ನಿಂದ TIL ಅನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ಮತ್ತು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ನಾವು ಮಣಿ ಪುನರುತ್ಪಾದನಾ ವಿಧಾನವನ್ನು ಅತ್ಯುತ್ತಮವಾಗಿಸಿದೆ (ವಸ್ತುಗಳು ಮತ್ತು ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ನೋಡಿ; ಚಿತ್ರ 2A). ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ಬದಲಾವಣೆಗಳ ಮೇಲೆ ಈ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್‌ನ ಒಟ್ಟಾರೆ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ನಿರ್ಣಯಿಸಲು, ಮೇಲಿನ ಮಣಿ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ ಹಂತದ ನಂತರ ಆರೋಗ್ಯಕರ ದಾನಿಗಳು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿದ T ಕೋಶಗಳ ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ಪ್ರೊಫೈಲ್‌ಗಳನ್ನು ಮಣಿ ಬೇರ್ಪಡದ ಆದರೆ ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ ಉಳಿದಿರುವ ಜೀವಕೋಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಈ ಗುಣಮಟ್ಟ ನಿಯಂತ್ರಣ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಈ ಎರಡು ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳ ನಡುವೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧವಿದೆ ಎಂದು ಕಂಡುಹಿಡಿದಿದೆ (r = 0.77), ಮತ್ತು 86 ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್‌ಗಳ ಗುಂಪಿನ ತಾಂತ್ರಿಕ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯು ಹೆಚ್ಚಿನ ಪುನರಾವರ್ತನೀಯತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ (ಚಿತ್ರ 2B). ಆದ್ದರಿಂದ, ಈ ವಿಧಾನಗಳು ಜೀವಕೋಶ ಪ್ರಕಾರದ ಪುಷ್ಟೀಕರಣಕ್ಕೆ ಒಳಗಾಗುವ ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ನಿಖರವಾದ ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಮಾಡಬಹುದು, ಹೀಗಾಗಿ HGSC ಯಲ್ಲಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಮೊದಲ ಹೆಚ್ಚಿನ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ವೇದಿಕೆಯನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಜನರು ಜೀವಕೋಶದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯ ಲೈಂಗಿಕ ಚಯಾಪಚಯ ಕಾರ್ಯಕ್ರಮದ ಬಗ್ಗೆ ಆಳವಾದ ತಿಳುವಳಿಕೆಯನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ.
(ಎ) ಕಾಂತೀಯ ಮಣಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಣದ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ. LC-MS/MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ಮೊದಲು, ಜೀವಕೋಶಗಳು ಸತತ ಮೂರು ಸುತ್ತಿನ ಕಾಂತೀಯ ಮಣಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಣಕ್ಕೆ ಒಳಗಾಗುತ್ತವೆ ಅಥವಾ ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ ಉಳಿಯುತ್ತವೆ. (ಬಿ) ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್‌ಗಳ ಸಮೃದ್ಧಿಯ ಮೇಲೆ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ಪ್ರಕಾರದ ಪರಿಣಾಮ. ಪ್ರತಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ಪ್ರಕಾರಕ್ಕೆ ಸರಾಸರಿ ಮೂರು ಅಳತೆಗಳು ± SE. ಬೂದು ರೇಖೆಯು 1:1 ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. ಅಕ್ಷದ ಲೇಬಲ್‌ನಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಅಳತೆಗಳ ಇಂಟ್ರಾ-ಕ್ಲಾಸ್ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ (ICC). NAD, ನಿಕೋಟಿನಮೈಡ್ ಅಡೆನಿನ್ ಡೈನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್. (ಸಿ) ರೋಗಿಯ ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಕೆಲಸದ ಹರಿವಿನ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ. ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಗೆಡ್ಡೆಗಳನ್ನು ರೋಗಿಗಳಿಂದ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ ಕ್ರಯೋಪ್ರೆಸರ್ವ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಯ ಒಂದು ಸಣ್ಣ ಭಾಗವನ್ನು ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿಯಿಂದ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು, ಆದರೆ ಉಳಿದ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು CD4+, CD8+ ಮತ್ತು CD45- ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಮೂರು ಸುತ್ತಿನ ಪುಷ್ಟೀಕರಣಕ್ಕೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಈ ಜೀವಕೋಶದ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳನ್ನು LC-MS/MS ಬಳಸಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ. (ಡಿ) ಪ್ರಮಾಣೀಕೃತ ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್ ಸಮೃದ್ಧಿಯ ಶಾಖ ನಕ್ಷೆ. ಡೆಂಡ್ರೋಗ್ರಾಮ್ ಮಾದರಿಗಳ ನಡುವಿನ ಯೂಕ್ಲಿಡಿಯನ್ ಅಂತರಗಳ ವಾರ್ಡ್‌ನ ಕ್ಲಸ್ಟರಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. (ಇ) ಮಾದರಿ ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ನಕ್ಷೆಯ ಪ್ರಧಾನ ಘಟಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (ಪಿಸಿಎ), ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಯ ಮೂರು ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಒಂದೇ ರೋಗಿಯಿಂದ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಒಂದು ರೇಖೆಯ ಮೂಲಕ ಸಂಪರ್ಕಿಸಲಾಗಿದೆ. (ಎಫ್) ರೋಗಿಯ ಮೇಲೆ ನಿಯಮಾಧೀನಗೊಳಿಸಲಾದ ಮಾದರಿಯ ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ಪ್ರೊಫೈಲ್‌ನ ಪಿಸಿಎ (ಅಂದರೆ, ಭಾಗಶಃ ಪುನರುಕ್ತಿ ಬಳಸಿ); ಮಾದರಿ ಪ್ರಕಾರವು ಪೀನ ಹಲ್‌ನಿಂದ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ. ಪಿಸಿ 1, ಮುಖ್ಯ ಘಟಕ 1; ಪಿಸಿ 2, ಮುಖ್ಯ ಘಟಕ 2.
ಮುಂದೆ, ಆರು HGSC ರೋಗಿಗಳ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಗಳಲ್ಲಿನ CD4 +, CD8 + ಮತ್ತು CD45-ಕೋಶ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳಲ್ಲಿನ 99 ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ನಾವು ಈ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ವಿಧಾನವನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 2C, ಚಿತ್ರ S3A ಮತ್ತು ಕೋಷ್ಟಕ S3 ಮತ್ತು S4). ಆಸಕ್ತಿಯ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯು ಮೂಲ ದೊಡ್ಡ ಜೀವಂತ ಕೋಶಗಳ ಮಾದರಿಯ 2% ರಿಂದ 70% ರಷ್ಟಿದೆ ಮತ್ತು ಜೀವಕೋಶಗಳ ಅನುಪಾತವು ರೋಗಿಗಳ ನಡುವೆ ಬಹಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ. ಮಣಿಗಳನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸಿದ ನಂತರ, ಆಸಕ್ತಿಯ ಪುಷ್ಟೀಕರಣದ ಭಾಗವು (CD4+, CD8+ ಅಥವಾ CD45-) ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿರುವ ಎಲ್ಲಾ ಜೀವಂತ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಸರಾಸರಿ 85% ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು. ಈ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ವಿಧಾನವು ಮಾನವ ಗೆಡ್ಡೆಯ ಅಂಗಾಂಶ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯಿಂದ ಜೀವಕೋಶ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ನಮಗೆ ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ, ಇದನ್ನು ದೊಡ್ಡ ಮಾದರಿಗಳಿಂದ ಮಾಡಲು ಅಸಾಧ್ಯ. ಈ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಬಳಸಿ, ಎಲ್-ಕೈನುರೆನೈನ್ ಮತ್ತು ಅಡೆನೊಸಿನ್, ಈ ಎರಡು ಉತ್ತಮವಾಗಿ ನಿರೂಪಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಇಮ್ಯುನೊಸಪ್ರೆಸಿವ್ ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್‌ಗಳು ಗೆಡ್ಡೆ ಟಿ ಕೋಶಗಳು ಅಥವಾ ಗೆಡ್ಡೆ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಎತ್ತರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿವೆ ಎಂದು ನಾವು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ S3, B ಮತ್ತು C). ಆದ್ದರಿಂದ, ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ರೋಗಿಯ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿ ಜೈವಿಕವಾಗಿ ಪ್ರಮುಖವಾದ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯುವಲ್ಲಿ ನಮ್ಮ ಕೋಶ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ ಮತ್ತು ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನದ ನಿಷ್ಠೆ ಮತ್ತು ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತವೆ.
ನಮ್ಮ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ರೋಗಿಗಳ ಒಳಗೆ ಮತ್ತು ರೋಗಿಗಳ ನಡುವೆ ಜೀವಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳ ಬಲವಾದ ಚಯಾಪಚಯ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 2D ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ S4A). ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಇತರ ರೋಗಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ರೋಗಿಯು 70 ವಿಭಿನ್ನ ಚಯಾಪಚಯ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಿದರು (ಚಿತ್ರ 2E ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ S4B), ರೋಗಿಗಳ ನಡುವೆ ಗಣನೀಯ ಚಯಾಪಚಯ ವೈವಿಧ್ಯತೆ ಇರಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಇತರ ರೋಗಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ (1.2 ರಿಂದ 2 ಲೀಟರ್; ಟೇಬಲ್ S1), ರೋಗಿಯು 70 (80 ಮಿಲಿ) ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾದ ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳ ಒಟ್ಟು ಪ್ರಮಾಣವು ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದೆ ಎಂಬುದು ಗಮನಿಸಬೇಕಾದ ಸಂಗತಿ. ಪ್ರಧಾನ ಘಟಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ (ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಭಾಗಶಃ ಪುನರುಕ್ತಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಳಸುವುದು) ಅಂತರ-ರೋಗಿಯ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯ ನಿಯಂತ್ರಣವು ಜೀವಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳ ನಡುವೆ ಸ್ಥಿರವಾದ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಜೀವಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳು ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಪರಿಸರವನ್ನು ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ಪ್ರೊಫೈಲ್ ಪ್ರಕಾರ ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 2F). ಏಕ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಈ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಒತ್ತಿಹೇಳಿತು ಮತ್ತು ಜೀವಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳು ಮತ್ತು ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಪರಿಸರದ ನಡುವಿನ ಗಮನಾರ್ಹ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು. ಗಮನಿಸಿದ ಅತ್ಯಂತ ತೀವ್ರವಾದ ವ್ಯತ್ಯಾಸವೆಂದರೆ MNA, ಇದು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ CD45- ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯನ್ನು ಒಳನುಸುಳುವ CD4+ ಮತ್ತು CD8+ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಸಮೃದ್ಧವಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3A). CD4 + ಜೀವಕೋಶಗಳಿಗೆ, ಈ ಪರಿಣಾಮವು ಅತ್ಯಂತ ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು CD8 + ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿನ MNA ಸಹ ಪರಿಸರದಿಂದ ಬಲವಾಗಿ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರುತ್ತದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಇದು ಮುಖ್ಯವಲ್ಲ, ಏಕೆಂದರೆ ಆರು ರೋಗಿಗಳಲ್ಲಿ ಕೇವಲ ಮೂವರನ್ನು ಮಾತ್ರ ಗೆಡ್ಡೆಯ CD8+ ಸ್ಕೋರ್‌ಗಳಿಗಾಗಿ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಬಹುದು. MNA ಜೊತೆಗೆ, ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಗಳಲ್ಲಿನ ವಿವಿಧ ರೀತಿಯ ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ, TIL ನಲ್ಲಿ ಕಳಪೆಯಾಗಿ ನಿರೂಪಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಇತರ ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್‌ಗಳು ಸಹ ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿ ಸಮೃದ್ಧವಾಗಿವೆ (ಚಿತ್ರಗಳು S3 ಮತ್ತು S4). ಆದ್ದರಿಂದ, ಈ ಡೇಟಾವು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಶೋಧನೆಗಾಗಿ ಇಮ್ಯುನೊಮಾಡ್ಯುಲೇಟರಿ ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್‌ಗಳ ಭರವಸೆಯ ಗುಂಪನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸುತ್ತದೆ.
(ಎ) ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯಿಂದ CD4+, CD8+ ಮತ್ತು CD45- ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ MNA ಯ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಣದ ಅಂಶ. ಬಾಕ್ಸ್ ಪ್ಲಾಟ್ ಮಧ್ಯದ (ರೇಖೆ), ಇಂಟರ್‌ಕ್ವಾರ್ಟೈಲ್ ಶ್ರೇಣಿ (ಫ್ರೇಮ್ ಹಿಂಜ್) ಮತ್ತು ಡೇಟಾ ಶ್ರೇಣಿಯನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಇಂಟರ್‌ಕ್ವಾರ್ಟೈಲ್ ಶ್ರೇಣಿಯ 1.5 ಪಟ್ಟು ವರೆಗೆ (ಫ್ರೇಮ್ ವಿಸ್ಕರ್). ರೋಗಿಯ ಸಾಮಗ್ರಿಗಳು ಮತ್ತು ವಿಧಾನಗಳಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ, P ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ರೋಗಿಯ ಲಿಮ್ಮಾ ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಬಳಸಿ (*P<0.05 ಮತ್ತು **P<0.01). (ಬಿ) MNA ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ (60). ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್‌ಗಳು: S-ಅಡೆನೊಸಿಲ್-1-ಮೆಥಿಯೋನಿನ್; SAH, S-ಅಡೆನೊಸಿನ್-1-ಹೋಮೋಸಿಸ್ಟೈನ್; NA, ನಿಕೋಟಿನಮೈಡ್; MNA, 1-ಮೀಥೈಲ್ನಿಕೋಟಿನಮೈಡ್; 2-PY, 1-ಮೀಥೈಲ್- 2-ಪಿರಿಡೋನ್-5-ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಮೈಡ್; 4-PY, 1-ಮೀಥೈಲ್-4-ಪಿರಿಡೋನ್-5-ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಮೈಡ್; NR, ನಿಕೋಟಿನಮೈಡ್ ರೈಬೋಸ್; NMN, ನಿಕೋಟಿನಮೈಡ್ ಮಾನೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್. ಕಿಣ್ವಗಳು (ಹಸಿರು): NNMT, ನಿಕೋಟಿನಮೈಡ್ N-ಮೀಥೈಲ್‌ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫರೇಸ್; SIRT, ಸಿರ್ಟುಯಿನ್‌ಗಳು; NAMPT, ನಿಕೋಟಿನಮೈಡ್ ಫಾಸ್ಫೊರಿಬೊಸಿಲ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫರೇಸ್; AOX1, ಆಲ್ಡಿಹೈಡ್ ಆಕ್ಸಿಡೇಸ್ 1; NRK, ನಿಕೋಟಿನಮೈಡ್ ರೈಬೋಸೈಡ್ ಕೈನೇಸ್; NMNAT, ನಿಕೋಟಿನಮೈಡ್ ಮೊನೊ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ ಅಡೆನೈಲೇಟ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫರೇಸ್; Pnp1, ಪ್ಯೂರಿನ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಸೈಡ್ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಸ್. (C) ಅಸೈಟ್‌ಗಳು (ಬೂದು) ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯ (ಕೆಂಪು; n = 3 ರೋಗಿಗಳು) scRNA-seq ನ t-SNE. (D) scRNA-seq ಬಳಸಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ವಿಭಿನ್ನ ಜೀವಕೋಶ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿ NNMT ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ. (E) SK-OV-3, ಮಾನವ ಭ್ರೂಣ ಮೂತ್ರಪಿಂಡ (HEK) 293T, T ಜೀವಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು MNA-ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಪಡೆದ T ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ NNMT ಮತ್ತು AOX1 ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ. ಮಡಿಸಿದ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು SK-OV-3 ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. SEM ನೊಂದಿಗೆ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಾದರಿಯನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ (n = 6 ಆರೋಗ್ಯಕರ ದಾನಿಗಳು). 35 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ Ct ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗದ (UD) ಎಂದು ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. (F) SK-OV-3, HEK293T, T ಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು 8mM MNA ಯೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಪಡೆದ T ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ SLC22A1 ಮತ್ತು SLC22A2 ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ. ಮಡಿಸಿದ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು SK-OV-3 ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. SEM ನೊಂದಿಗೆ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಾದರಿಯನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ (n = 6 ಆರೋಗ್ಯಕರ ದಾನಿಗಳು). 35 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ Ct ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗದ (UD) ಎಂದು ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. (G) MNA ಯೊಂದಿಗೆ 72 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾವು ನಂತರ ಸಕ್ರಿಯ ಆರೋಗ್ಯಕರ ದಾನಿ T ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಜೀವಕೋಶ MNA ವಿಷಯ. SEM ನೊಂದಿಗೆ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಾದರಿಯನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ (n = 4 ಆರೋಗ್ಯಕರ ದಾನಿಗಳು).
ನಿಕೋಟಿನಮೈಡ್ N-ಮೀಥೈಲ್‌ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫರೇಸ್ (NNMT; ಚಿತ್ರ 3B) ಮೂಲಕ ಮೀಥೈಲ್ ಗುಂಪನ್ನು S-ಅಡೆನೊಸಿಲ್-1-ಮೆಥಿಯೋನಿನ್ (SAM) ನಿಂದ ನಿಕೋಟಿನಮೈಡ್ (NA) ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸುವ ಮೂಲಕ MNA ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುತ್ತದೆ. NNMT ವಿವಿಧ ರೀತಿಯ ಮಾನವ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಅತಿಯಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತವಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಸರಣ, ಆಕ್ರಮಣ ಮತ್ತು ಮೆಟಾಸ್ಟಾಸಿಸ್‌ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ (25-27). TME ಯಲ್ಲಿನ T ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ MNA ಯ ಮೂಲವನ್ನು ಚೆನ್ನಾಗಿ ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು, ನಾವು ಮೂರು HGSC ರೋಗಿಗಳ ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಗಳಲ್ಲಿ ಜೀವಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳಲ್ಲಿ NNMT ಯ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು scRNA-seq ಅನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ (ಟೇಬಲ್ S5). ಸರಿಸುಮಾರು 6,500 ಜೀವಕೋಶಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆ ಪರಿಸರಗಳಲ್ಲಿ, NNMT ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು ಊಹಿಸಲಾದ ಫೈಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟ್ ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆ ಕೋಶ ಜನಸಂಖ್ಯೆಗೆ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3, C ಮತ್ತು D). PTPRC (CD45 +) ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಯಾವುದೇ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿ ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ NNMT ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಇಲ್ಲ ಎಂಬುದು ಗಮನಿಸಬೇಕಾದ ಸಂಗತಿ (ಚಿತ್ರ 3D ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ S5A), ಇದು ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್‌ನಲ್ಲಿ ಪತ್ತೆಯಾದ MNA ಅನ್ನು T ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಪರಿಚಯಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಆಲ್ಡಿಹೈಡ್ ಆಕ್ಸಿಡೇಸ್ 1 (AOX1) ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು MNA ಅನ್ನು 1-ಮೀಥೈಲ್-2-ಪೈರಿಡೋನ್-5-ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಮೈಡ್ (2-PYR) ಅಥವಾ 1-ಮೀಥೈಲ್-4-ಪೈರಿಡೋನ್-5-ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಮೈಡ್ (4-PYR) ಆಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸುತ್ತದೆ; ಚಿತ್ರ 3B) COL1A1 (ಚಿತ್ರ S5A) ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಫೈಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟ್‌ಗಳ ಜನಸಂಖ್ಯೆಗೆ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ, ಇದು ಒಟ್ಟಾಗಿ T ಜೀವಕೋಶಗಳು ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ MNA ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಈ MNA-ಸಂಬಂಧಿತ ಜೀನ್‌ಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಾದರಿಯನ್ನು HGSC ರೋಗಿಗಳಿಂದ ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳಿಂದ ಎರಡನೇ ಸ್ವತಂತ್ರ ಕೋಶ ದತ್ತಾಂಶ ಸೆಟ್ ಬಳಸಿ ಪರಿಶೀಲಿಸಲಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ S5B; n = 6) (16). ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, MNA ಯೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಪಡೆದ ಆರೋಗ್ಯಕರ ದಾನಿ T ಕೋಶಗಳ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಸರಪಳಿ ಕ್ರಿಯೆ (qPCR) ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ನಿಯಂತ್ರಣ SK-OV-3 ಅಂಡಾಶಯದ ಗೆಡ್ಡೆ ಕೋಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, NNMT ಅಥವಾ AOX1 ಬಹುತೇಕ ವ್ಯಕ್ತವಾಗಿಲ್ಲ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3E). ಈ ಅನಿರೀಕ್ಷಿತ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು MNA ಅನ್ನು ಫೈಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಗೆಡ್ಡೆಗಳಿಂದ TME ನಲ್ಲಿ ಪಕ್ಕದ T ಕೋಶಗಳಾಗಿ ಸ್ರವಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಕರಗುವ ವಾಹಕ 22 (SLC22) ಕುಟುಂಬದಿಂದ (SLC22A1, SLC22A2 ಮತ್ತು SLC22A3) ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡಲಾದ ಸಾವಯವ ಕ್ಯಾಟಯಾನ್ ಸಾಗಣೆದಾರರು 1 ರಿಂದ 3 (OCT1, OCT2 ಮತ್ತು OCT3) ಕುಟುಂಬವನ್ನು ಅಭ್ಯರ್ಥಿಗಳು ಒಳಗೊಂಡಿದ್ದರೂ, MNA ಯ ಸಂಭಾವ್ಯ ಸಾಗಣೆದಾರರು ಇನ್ನೂ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿಲ್ಲ (28). ಆರೋಗ್ಯಕರ ದಾನಿ T ಕೋಶಗಳಿಂದ mRNA ಯ QPCR SLC22A1 ನ ಕಡಿಮೆ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಟ್ಟವನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ ಆದರೆ SLC22A2 ನ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗದ ಮಟ್ಟವನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ, ಇದು ಹಿಂದೆ ಸಾಹಿತ್ಯದಲ್ಲಿ ವರದಿಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ದೃಢಪಡಿಸಿತು (ಚಿತ್ರ 3F) (29). ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, SK-OV-3 ಅಂಡಾಶಯದ ಗೆಡ್ಡೆಯ ಕೋಶ ರೇಖೆಯು ಎರಡೂ ಸಾಗಣೆದಾರರ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟವನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಿತು (ಚಿತ್ರ 3F).
ವಿದೇಶಿ MNA ಯನ್ನು ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ T ಕೋಶಗಳ ಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, ಆರೋಗ್ಯಕರ ದಾನಿ T ಕೋಶಗಳನ್ನು MNA ಯ ವಿಭಿನ್ನ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ 72 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕಲ್ಚರ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಬಾಹ್ಯ MNA ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ, MNA ಯ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಅಂಶವನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 3G). ಆದಾಗ್ಯೂ, ಬಾಹ್ಯ MNA ಯೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಲಾದ ಸಕ್ರಿಯ T ಕೋಶಗಳು ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ MNA ವಿಷಯದಲ್ಲಿ ಡೋಸ್-ಅವಲಂಬಿತ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ತೋರಿಸಿದವು, 6 mM MNA ವರೆಗೆ (ಚಿತ್ರ 3G). ಈ ಫಲಿತಾಂಶವು ಕಡಿಮೆ ಮಟ್ಟದ ಸಾಗಣೆದಾರ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮತ್ತು ಅಂತರ್ಜೀವಕೋಶದ MNA ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಗೆ ಕಾರಣವಾದ ಮುಖ್ಯ ಕಿಣ್ವದ ಕೊರತೆಯ ಹೊರತಾಗಿಯೂ, TIL ಇನ್ನೂ MNA ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ರೋಗಿಗಳ ಟಿ ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿನ ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್‌ಗಳ ವರ್ಣಪಟಲ ಮತ್ತು ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ MNA ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಪ್ರಯೋಗಗಳು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್-ಸಂಬಂಧಿತ ಫೈಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟ್‌ಗಳು (CAF) MNA ಅನ್ನು ಸ್ರವಿಸುವ ಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಕೋಶಗಳು TIL ನ ಫಿನೋಟೈಪ್ ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಬಹುದು. T ಜೀವಕೋಶಗಳ ಮೇಲೆ MNA ಯ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು, ಆರೋಗ್ಯಕರ ದಾನಿ T ಕೋಶಗಳನ್ನು MNA ಇರುವಿಕೆ ಅಥವಾ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಪ್ರಸರಣ ಮತ್ತು ಸೈಟೊಕಿನ್ ಉತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ MNA ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಿದ 7 ದಿನಗಳ ನಂತರ, ಜನಸಂಖ್ಯೆಯ ದ್ವಿಗುಣಗೊಳಿಸುವ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಮಧ್ಯಮವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು, ಆದರೆ ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಚೈತನ್ಯವನ್ನು ಕಾಯ್ದುಕೊಳ್ಳಲಾಯಿತು (ಚಿತ್ರ 4A). ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಬಾಹ್ಯ MNA ಚಿಕಿತ್ಸೆಯು ಗೆಡ್ಡೆಯ ನೆಕ್ರೋಸಿಸ್ ಅಂಶ-α ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ CD4 + ಮತ್ತು CD8 + T ಕೋಶಗಳ ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಳಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಯಿತು (TNFα; ಚಿತ್ರ 4B). ಇದಕ್ಕೆ ವಿರುದ್ಧವಾಗಿ, IFN-γ ನ ಅಂತರ್ಜೀವಕೋಶದ ಉತ್ಪಾದನೆಯು CD4 + T ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ, ಆದರೆ CD8 + T ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಅಲ್ಲ, ಮತ್ತು ಇಂಟರ್ಲ್ಯೂಕಿನ್ 2 (IL-2; ಚಿತ್ರ 4, C ಮತ್ತು D) ನಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಗಮನಾರ್ಹ ಬದಲಾವಣೆ ಕಂಡುಬಂದಿಲ್ಲ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಈ MNA-ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಪಡೆದ T ಕೋಶ ಸಂಸ್ಕೃತಿಗಳಿಂದ ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್‌ಗಳ ಕಿಣ್ವ-ಸಂಯೋಜಿತ ಇಮ್ಯುನೊಸರ್ಬೆಂಟ್ ಅಸ್ಸೇ (ELISA) TNFα ನಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಹೆಚ್ಚಳ, IFN-γ ನಲ್ಲಿ ಇಳಿಕೆ ಮತ್ತು IL-2 ನಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಬದಲಾವಣೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಲಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 4, E ನಿಂದ G). . IFN-γ ನ ಇಳಿಕೆಯು T ಕೋಶಗಳ ಆಂಟಿ-ಟ್ಯೂಮರ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುವಲ್ಲಿ MNA ಪಾತ್ರವಹಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. T ಕೋಶ-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ಸೈಟೊಟಾಕ್ಸಿಸಿಟಿಯ ಮೇಲೆ MNA ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಅನುಕರಿಸಲು, ಫೋಲೇಟ್ ಗ್ರಾಹಕ α ಮತ್ತು ಹಸಿರು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪ್ರೋಟೀನ್ (GFP) -CAR-T) ಜೀವಕೋಶಗಳಿಂದ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲ್ಪಡುವ CAR-T (GFP) ಅನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸುವ ಚಿಮೆರಿಕ್ ಪ್ರತಿಜನಕ ಗ್ರಾಹಕ T (FRα-CAR-T) ಕೋಶಗಳನ್ನು ಆರೋಗ್ಯಕರ ದಾನಿ ಬಾಹ್ಯ ರಕ್ತ ಮಾನೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ಕೋಶಗಳು (PBMC) ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತವೆ. CAR-T ಕೋಶಗಳನ್ನು MNA ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕಲ್ಚರ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ 10:1 ರ ಗುರಿ ಅನುಪಾತಕ್ಕೆ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಲ್ಲಿ ಫೋಲೇಟ್ ಗ್ರಾಹಕ α ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಮಾನವ SK-OV-3 ಅಂಡಾಶಯದ ಗೆಡ್ಡೆ ಕೋಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಹ-ಕಲ್ಚರ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. MNA ಚಿಕಿತ್ಸೆಯು FRα-CAR-T ಕೋಶಗಳ ಕೊಲ್ಲುವ ಚಟುವಟಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಇಳಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಯಿತು, ಇದು ಅಡೆನೊಸಿನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಪಡೆದ FRα-CAR-T ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಹೋಲುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 4H).
(A) 7 ನೇ ದಿನದಂದು ಸಂಸ್ಕೃತಿಯಿಂದ ನೇರವಾಗಿ ಒಟ್ಟು ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯವಾದ ಜೀವಕೋಶ ಎಣಿಕೆ ಮತ್ತು ಜನಸಂಖ್ಯಾ ದ್ವಿಗುಣಗೊಳಿಸುವಿಕೆ (PD). ಬಾರ್ ಗ್ರಾಫ್ ಆರು ಆರೋಗ್ಯವಂತ ದಾನಿಗಳ ಸರಾಸರಿ + SEM ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. ಕನಿಷ್ಠ n = 3 ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಂದ ಡೇಟಾವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. (B ನಿಂದ D) CD3/CD28 ಮತ್ತು IL-2 ಅನ್ನು 7 ದಿನಗಳವರೆಗೆ ಅವುಗಳ ಆಯಾ MNA ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ T ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತಿತ್ತು. ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಮೊದಲು, ಕೋಶಗಳನ್ನು 4 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ GolgiStop ನೊಂದಿಗೆ PMA/ionomycin ನೊಂದಿಗೆ ಉತ್ತೇಜಿಸಲಾಯಿತು. T ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ TNFα (B) ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ. ಜೀವಂತ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ TNFα ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಉದಾಹರಣೆ ಚಿತ್ರ (ಎಡ) ಮತ್ತು ಕೋಷ್ಟಕ ಡೇಟಾ (ಬಲ). T ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ IFN-γ (C) ಮತ್ತು IL-2 (D) ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ. ಸೈಟೊಕಿನ್‌ಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಹರಿವಿನ ಸೈಟೊಮೆಟ್ರಿಯಿಂದ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ಬಾರ್ ಗ್ರಾಫ್ ಸರಾಸರಿ (n = 6 ಆರೋಗ್ಯವಂತ ದಾನಿಗಳು) + SEM ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. P ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ವ್ಯತ್ಯಾಸ ಮತ್ತು ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಅಳತೆಗಳ (*P<0.05 ಮತ್ತು **P<0.01) ಏಕಮುಖ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಳಸಿ. ಕನಿಷ್ಠ n = 3 ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಂದ ಡೇಟಾವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. (E ನಿಂದ G) CD3/CD28 ಮತ್ತು IL-2 ಅನ್ನು 7 ದಿನಗಳವರೆಗೆ ಅವುಗಳ ಆಯಾ MNA ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ T ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲು ಬಳಸಲಾಯಿತು. PMA/ionomycin ಪ್ರಚೋದನೆಯ 4 ಗಂಟೆಗಳ ಮೊದಲು ಮತ್ತು ನಂತರ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು. TNFα (E), IFN-γ (F) ಮತ್ತು IL-2 (G) ಸಾಂದ್ರತೆಗಳನ್ನು ELISA ಮೂಲಕ ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. ಬಾರ್ ಗ್ರಾಫ್ ಸರಾಸರಿ (n = 5 ಆರೋಗ್ಯಕರ ದಾನಿಗಳು) + SEM ಅನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಏಕಮುಖ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಅಳತೆಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು P ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (*P<0.05). ಚುಕ್ಕೆಗಳ ರೇಖೆಯು ಪತ್ತೆಯ ಪತ್ತೆ ಮಿತಿಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. (H) ಜೀವಕೋಶದ ಲೈಸಿಸ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. FRα-CAR-T ಅಥವಾ GFP-CAR-T ಕೋಶಗಳನ್ನು ಅಡೆನೊಸಿನ್ (250μM) ಅಥವಾ MNA (10 mM) ನೊಂದಿಗೆ 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ ಅಥವಾ ಸಂಸ್ಕರಿಸದೆ ಬಿಡಲಾಗಿದೆ (Ctrl). SK-OV-3 ಕೋಶಗಳ ಶೇಕಡಾವಾರು ಕೊಲ್ಲುವಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. P ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ವೆಲ್ಚ್ t ಪರೀಕ್ಷೆಯಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (*P<0.5 ಮತ್ತು **P<0.01).
MNA-ಅವಲಂಬಿತ TNFα ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ನಿಯಂತ್ರಣದ ಯಾಂತ್ರಿಕ ತಿಳುವಳಿಕೆಯನ್ನು ಪಡೆಯಲು, MNA-ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಪಡೆದ T ಕೋಶಗಳ TNFα mRNA ಯಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲಾಯಿತು (ಚಿತ್ರ 5A). MNA ಯೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಪಡೆದ ಆರೋಗ್ಯಕರ ದಾನಿ T ಕೋಶಗಳು TNFα ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ಎರಡು ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ತೋರಿಸಿದವು, ಇದು MNA TNFα ಪ್ರತಿಲೇಖನ ನಿಯಂತ್ರಣದ ಮೇಲೆ ಅವಲಂಬಿತವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ಸಂಭವನೀಯ ನಿಯಂತ್ರಕ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲು, TNFα ಅನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಎರಡು ತಿಳಿದಿರುವ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಅಂಶಗಳು, ಅವುಗಳೆಂದರೆ ಸಕ್ರಿಯ T ಕೋಶ ಪರಮಾಣು ಅಂಶ (NFAT) ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೋಟೀನ್ 1 (Sp1), MNA ಅನ್ನು ಪ್ರಾಕ್ಸಿಮಲ್ TNFα ಪ್ರವರ್ತಕಕ್ಕೆ ಬಂಧಿಸುವುದಕ್ಕೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲಾಯಿತು (30). TNFα ಪ್ರವರ್ತಕವು 6 ಗುರುತಿಸಲಾದ NFAT ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು 2 Sp1 ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದು, ಒಂದು ಸೈಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಅತಿಕ್ರಮಿಸುತ್ತದೆ [-55 ಬೇಸ್ ಜೋಡಿಗಳು (bp) 5'cap] (30). ಕ್ರೊಮಾಟಿನ್ ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಶನ್ (ChIP) MNA ಯೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಿದಾಗ, TNFα ಪ್ರವರ್ತಕಕ್ಕೆ Sp1 ನ ಬಂಧನವು ಮೂರು ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ. NFAT ನ ಸಂಯೋಜನೆಯು ಸಹ ಹೆಚ್ಚಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ಸಮೀಪಿಸಿತು (ಚಿತ್ರ 5B). ಈ ದತ್ತಾಂಶಗಳು MNA, Sp1 ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ಮೂಲಕ TNFα ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸ್ವಲ್ಪ ಮಟ್ಟಿಗೆ NFAT ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
(A) MNA ಇಲ್ಲದೆ ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ T ಕೋಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, MNA ಯೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಪಡೆದ T ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ TNFα ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಪಟ್ಟು ಬದಲಾವಣೆ. SEM ನೊಂದಿಗೆ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಾದರಿಯನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ (n = 5 ಆರೋಗ್ಯಕರ ದಾನಿಗಳು). ಕನಿಷ್ಠ n = 3 ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಂದ ಡೇಟಾವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. (B) NFAT ಮತ್ತು Sp1 ನಂತರ 8 mM MNA ಯೊಂದಿಗೆ ಅಥವಾ ಇಲ್ಲದೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಪಡೆದ T ಕೋಶಗಳ TNFα ಪ್ರವರ್ತಕವನ್ನು 4 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ (Ctrl) ಮತ್ತು PMA/ionomycin ಪ್ರಚೋದನೆಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಯಿತು. ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಶನ್‌ಗಾಗಿ ಇಮ್ಯುನೊಗ್ಲಾಬ್ಯುಲಿನ್ G (IgG) ಮತ್ತು H3 ಗಳನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ ಋಣಾತ್ಮಕ ಮತ್ತು ಧನಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣಗಳಾಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು. ChIP ಯ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವು MNA-ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಪಡೆದ ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ TNFα ಪ್ರವರ್ತಕಕ್ಕೆ Sp1 ಮತ್ತು NFAT ನ ಬಂಧನವು ನಿಯಂತ್ರಣದೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಹಲವಾರು ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ. ಕನಿಷ್ಠ n = 3 ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಂದ ಡೇಟಾವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. ಬಹು t-ಪರೀಕ್ಷೆಗಳಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಲ್ಪಟ್ಟ P ಮೌಲ್ಯ (*** P <0.01). (C) HGSC ಯ ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, T ಜೀವಕೋಶಗಳು (ಸೈಟೊಟಾಕ್ಸಿಕ್ ಅಲ್ಲದ) ಗೆಡ್ಡೆಯಲ್ಲಿ TNF ನ ಹೆಚ್ಚಿದ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ. ಬಣ್ಣಗಳು ವಿಭಿನ್ನ ರೋಗಿಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ. ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾದ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕವಾಗಿ 300 ಕ್ಕೆ ಮಾದರಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಓವರ್‌ಡ್ರಾವಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಮಿತಿಗೊಳಿಸಲು ನಡುಗಿಸಲಾಗಿದೆ (** ಪ್ಯಾಡ್ಜ್ = 0.0076). (D) ಅಂಡಾಶಯದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ಗೆ MNA ಯ ಪ್ರಸ್ತಾವಿತ ಮಾದರಿ. TME ಯಲ್ಲಿನ ಗೆಡ್ಡೆ ಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು ಫೈಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ MNA ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು T ಜೀವಕೋಶಗಳಿಂದ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಲ್ಪಡುತ್ತದೆ. MNA TNFα ಪ್ರವರ್ತಕಕ್ಕೆ Sp1 ನ ಬಂಧವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು TNFα ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಮತ್ತು TNFα ಸೈಟೊಕಿನ್ ಉತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ. MNA IFN-γ ನಲ್ಲಿ ಇಳಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. T ಕೋಶ ಕಾರ್ಯದ ಪ್ರತಿಬಂಧವು ಕೊಲ್ಲುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ವೇಗಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ.
ವರದಿಗಳ ಪ್ರಕಾರ, TNFα ಮುಂಭಾಗ ಮತ್ತು ಹಿಂಭಾಗ-ಅವಲಂಬಿತ ಆಂಟಿ-ಟ್ಯೂಮರ್ ಮತ್ತು ಆಂಟಿ-ಟ್ಯೂಮರ್ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಆದರೆ ಇದು ಅಂಡಾಶಯದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ನ ಬೆಳವಣಿಗೆ ಮತ್ತು ಮೆಟಾಸ್ಟಾಸಿಸ್ ಅನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುವಲ್ಲಿ ಪ್ರಸಿದ್ಧ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ (31-33). ವರದಿಗಳ ಪ್ರಕಾರ, ಅಂಡಾಶಯದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಇರುವ ರೋಗಿಗಳಲ್ಲಿ ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿ TNFα ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಸೌಮ್ಯ ಅಂಗಾಂಶಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ (34-36). ಕಾರ್ಯವಿಧಾನದ ವಿಷಯದಲ್ಲಿ, TNFα ಬಿಳಿ ರಕ್ತ ಕಣಗಳ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆ, ಕಾರ್ಯ ಮತ್ತು ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳ ಫಿನೋಟೈಪ್ ಅನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಬಹುದು (37, 38). ಈ ಸಂಶೋಧನೆಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, ಭೇದಾತ್ಮಕ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಗೆಡ್ಡೆಯ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿನ T ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ TNF ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಅಪ್-ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 5C). TNF ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಲ್ಲಿನ ಹೆಚ್ಚಳವು ಸೈಟೋಟಾಕ್ಸಿಕ್ ಅಲ್ಲದ ಫಿನೋಟೈಪ್ ಹೊಂದಿರುವ T ಜೀವಕೋಶ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿ ಮಾತ್ರ ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿತ್ತು (ಚಿತ್ರ S5A). ಸಾರಾಂಶದಲ್ಲಿ, ಈ ಡೇಟಾವು HGSC ಯಲ್ಲಿ MNA ಡ್ಯುಯಲ್ ಇಮ್ಯುನೊಸಪ್ರೆಸಿವ್ ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುವ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಎಂಬ ದೃಷ್ಟಿಕೋನವನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತದೆ.
ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿಯನ್ನು ಆಧರಿಸಿದ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಲೇಬಲಿಂಗ್ TIL ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಮುಖ್ಯ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ. ಈ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಬಾಹ್ಯ ರಕ್ತದ ಲಿಂಫೋಸೈಟ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ದ್ವಿತೀಯ ಲಿಂಫಾಯಿಡ್ ಅಂಗಗಳಿಂದ ಬರುವ T ಜೀವಕೋಶಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ಮುರೈನ್ ಮತ್ತು ಮಾನವ TIL ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಅನ್ನು ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿವೆ (4, 39) ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಕ್ರಿಯೆಯ ಕ್ರಮೇಣ ನಷ್ಟ (19, 40). ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ನಾವು ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಗಮನಿಸಿದ್ದರೂ, ಪ್ರಮುಖ ಬೆಳವಣಿಗೆಯೆಂದರೆ ಗೆಡ್ಡೆಯ ಕೋಶಗಳ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆ ಮತ್ತು ಅದೇ ಕತ್ತರಿಸಿದ ಗೆಡ್ಡೆಯ ಅಂಗಾಂಶದಿಂದ TIL ಅನ್ನು ಹೋಲಿಸುವುದು. ಈ ಹಿಂದಿನ ಕೆಲವು ವರದಿಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಗಳಿಂದ ಬರುವ ಗೆಡ್ಡೆ (CD45-EpCAM +) ಜೀವಕೋಶಗಳು CD8 + ಮತ್ತು CD4 + T ಜೀವಕೋಶಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ, ಇದು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಕೋಶಗಳ ಹೆಚ್ಚಿನ ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು T ಜೀವಕೋಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತದೆ. T ಕೋಶ ಸ್ಪರ್ಧೆಯ ಪರಿಕಲ್ಪನೆ. TME. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಗೆಡ್ಡೆಯ ಕೋಶಗಳ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯು CD8 + T ಜೀವಕೋಶಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯು CD4 + T ಜೀವಕೋಶಗಳಂತೆಯೇ ಇರುತ್ತದೆ. ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಆಕ್ಸಿಡೇಟಿವ್ ಚಯಾಪಚಯವು ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ ಎಂಬ ಉದಯೋನ್ಮುಖ ಥೀಮ್ ಅನ್ನು ಬಲಪಡಿಸುತ್ತದೆ (41, 42). CD8 + T ಜೀವಕೋಶಗಳು CD4 + T ಕೋಶಗಳಿಗಿಂತ ಆಕ್ಸಿಡೇಟಿವ್ ಅಪಸಾಮಾನ್ಯ ಕ್ರಿಯೆಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಒಳಗಾಗಬಹುದು ಅಥವಾ CD4 + T ಕೋಶಗಳು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಹೊರತುಪಡಿಸಿ ಇತರ ಇಂಗಾಲದ ಮೂಲಗಳನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು ಎಂದು ಅವರು ಸೂಚಿಸುತ್ತಾರೆ (43, 44). CD4 + T ಎಫೆಕ್ಟರ್‌ಗಳು, T ಎಫೆಕ್ಟರ್ ಮೆಮೊರಿ ಮತ್ತು ಅಸೈಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿನ T ಸೆಂಟ್ರಲ್ ಮೆಮೊರಿ ಕೋಶಗಳ ನಡುವೆ ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಸೇವನೆ ಅಥವಾ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯಲ್ಲಿ ನಾವು ಯಾವುದೇ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ಗಮನಿಸಿಲ್ಲ ಎಂಬುದನ್ನು ಗಮನಿಸಬೇಕು. ಅದೇ ರೀತಿ, ಗೆಡ್ಡೆಗಳಲ್ಲಿನ CD8 + T ಕೋಶಗಳ ವಿಭಿನ್ನ ಸ್ಥಿತಿಯು ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಸೇವನೆಯಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳೊಂದಿಗೆ ಯಾವುದೇ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಹೊಂದಿಲ್ಲ, ಇದು ಇನ್ ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ ಬೆಳೆಸಿದ T ಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು ಇನ್ ವಿವೊದಲ್ಲಿ ಮಾನವ TIL ನಡುವಿನ ಗಮನಾರ್ಹ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ಎತ್ತಿ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ (22). ಈ ಅವಲೋಕನಗಳನ್ನು ಪಕ್ಷಪಾತವಿಲ್ಲದ ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಕೋಶ ಜನಸಂಖ್ಯಾ ಹಂಚಿಕೆಯ ಬಳಕೆಯಿಂದ ದೃಢಪಡಿಸಲಾಯಿತು, ಇದು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಕೋಶಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಸೇವನೆ ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + ಕೋಶಗಳು ಪ್ರಚಲಿತವಾಗಿದೆ ಆದರೆ ಚಯಾಪಚಯ ಸಕ್ರಿಯ ಕೋಶ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ಮತ್ತಷ್ಟು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು. ಈ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯು scRNA-seq ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಮೈಲೋಯ್ಡ್ ಸಪ್ರೆಸರ್ ಕೋಶಗಳು ಅಥವಾ ಪ್ಲಾಸ್ಮಾಸೈಟಾಯ್ಡ್ ಡೆಂಡ್ರಿಟಿಕ್ ಕೋಶಗಳ ಸಂಭಾವ್ಯ ಉಪ-ಜನಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸಬಹುದು. ಇವೆರಡೂ ಮಾನವ ಅಂಡಾಶಯದ ಗೆಡ್ಡೆಗಳಲ್ಲಿ [45] ವರದಿಯಾಗಿದ್ದರೂ, ಅವುಗಳಿಗೆ ಇನ್ನೂ ಹೆಚ್ಚಿನ ಕೆಲಸ ಬೇಕಾಗಿದೆ ಈ ಮೈಲೋಯ್ಡ್ ಉಪ-ಜನಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ವಿವರಿಸುವುದು.
ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿ-ಆಧಾರಿತ ವಿಧಾನಗಳು ಜೀವಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳ ನಡುವಿನ ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಮತ್ತು ಆಕ್ಸಿಡೇಟಿವ್ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿನ ಸಾಮಾನ್ಯ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಸ್ಪಷ್ಟಪಡಿಸಬಹುದಾದರೂ, TME ನಲ್ಲಿ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಗಾಗಿ ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಅಥವಾ ಇತರ ಇಂಗಾಲದ ಮೂಲಗಳಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ನಿಖರವಾದ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಇನ್ನೂ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ. ನಿರ್ದಿಷ್ಟ TIL ಉಪವಿಭಾಗಕ್ಕೆ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿ ಅಥವಾ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ನಿಯೋಜಿಸಲು ಹೊರಹಾಕಿದ ಅಂಗಾಂಶದಿಂದ ಜೀವಕೋಶದ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯ ಶುದ್ಧೀಕರಣದ ಅಗತ್ಯವಿದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ನಮ್ಮ ಕೋಶ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ವಿಧಾನವು ರೋಗಿಯ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿಸುವಲ್ಲಿ T ಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಕೋಶ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿ ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಗಳ ಒಳನೋಟಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ವಿಧಾನವು ಪ್ರತಿದೀಪಕ-ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿದ ಕೋಶ ವಿಂಗಡಣೆಗಿಂತ ಪ್ರಯೋಜನಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದರೂ, ಅಂತರ್ಗತ ಸ್ಥಿರತೆ ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ತ್ವರಿತ ವಹಿವಾಟು ದರದಿಂದಾಗಿ ಕೆಲವು ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ಗ್ರಂಥಾಲಯಗಳು ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಬಹುದು (22). ಅದೇನೇ ಇದ್ದರೂ, ನಮ್ಮ ವಿಧಾನವು ಎರಡು ಗುರುತಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಇಮ್ಯುನೊಸಪ್ರೆಸಿವ್ ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್‌ಗಳಾದ ಅಡೆನೊಸಿನ್ ಮತ್ತು ಕೈನುರೆನಿನ್ ಅನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಯಿತು, ಏಕೆಂದರೆ ಅವು ಮಾದರಿ ಪ್ರಕಾರಗಳ ನಡುವೆ ಬಹಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗೊಳ್ಳುತ್ತವೆ.
ಗೆಡ್ಡೆಗಳು ಮತ್ತು TIL ಉಪವಿಭಾಗಗಳ ನಮ್ಮ ಮೆಟಾಬೊನೊಮಿಕ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಅಂಡಾಶಯದ TME ನಲ್ಲಿ ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್‌ಗಳ ಪಾತ್ರದ ಕುರಿತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಒಳನೋಟಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ. ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, ಗೆಡ್ಡೆಗಳು ಮತ್ತು CD4 + T ಕೋಶಗಳ ನಡುವೆ ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ವ್ಯತ್ಯಾಸವಿಲ್ಲ ಎಂದು ನಾವು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, LC-MS/MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಈ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿ ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್‌ಗಳ ಸಮೃದ್ಧಿಯಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು, TIL ಚಯಾಪಚಯ ಮತ್ತು ಅದರ ಒಟ್ಟಾರೆ ಮೆಟಾಬಾಲಿಕ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಬಗ್ಗೆ ತೀರ್ಮಾನಗಳಿಗೆ ಎಚ್ಚರಿಕೆಯಿಂದ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನದ ಅಗತ್ಯವಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಎರಡನೆಯದಾಗಿ, MNA ಗೆಡ್ಡೆಗಳಲ್ಲ, ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿನ CD45-ಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು T ಕೋಶಗಳ ನಡುವೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್ ಆಗಿದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ವಿಭಾಗೀಕರಣ ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಸ್ಥಳವು TIL ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಮೇಲೆ ವಿಭಿನ್ನ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಬೀರಬಹುದು, ಇದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಪರಿಸರದಲ್ಲಿ ಸಂಭವನೀಯ ವೈವಿಧ್ಯತೆಯನ್ನು ಎತ್ತಿ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಮೂರನೆಯದಾಗಿ, MNA-ಉತ್ಪಾದಿಸುವ ಕಿಣ್ವ NNMT ಯ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮುಖ್ಯವಾಗಿ CAF ಗೆ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ, ಇದು ಸ್ವಲ್ಪ ಮಟ್ಟಿಗೆ ಗೆಡ್ಡೆ ಕೋಶಗಳು, ಆದರೆ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಬಹುದಾದ MNA ಮಟ್ಟಗಳು ಗೆಡ್ಡೆಯಿಂದ ಪಡೆದ T ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುತ್ತವೆ. ಅಂಡಾಶಯದ CAF ನಲ್ಲಿ NNMT ಯ ಅತಿಯಾದ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್-ಉತ್ತೇಜಿಸುವ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಭಾಗಶಃ CAF ಚಯಾಪಚಯ, ಗೆಡ್ಡೆಯ ಆಕ್ರಮಣ ಮತ್ತು ಮೆಟಾಸ್ಟಾಸಿಸ್‌ನ ಪ್ರಚಾರದಿಂದಾಗಿ (27). ಒಟ್ಟಾರೆ TIL ಮಟ್ಟವು ಮಧ್ಯಮವಾಗಿದ್ದರೂ, CAF ನಲ್ಲಿ NNMT ಯ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಜೀನೋಮ್ ಅಟ್ಲಾಸ್ (TCGA) ಮೆಸೆಂಕಿಮಲ್ ಉಪವಿಭಾಗಕ್ಕೆ ನಿಕಟ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿದೆ, ಇದು ಕಳಪೆ ಮುನ್ನರಿವಿನೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ (27, 46, 47). ಅಂತಿಮವಾಗಿ, MNA ಅವನತಿಗೆ ಕಾರಣವಾದ ಕಿಣ್ವ AOX1 ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು CAF ಜನಸಂಖ್ಯೆಗೆ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ, ಇದು T ಜೀವಕೋಶಗಳು MNA ಅನ್ನು ಚಯಾಪಚಯಗೊಳಿಸುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ಸಂಶೋಧನೆಯನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಲು ಹೆಚ್ಚಿನ ಕೆಲಸದ ಅಗತ್ಯವಿದ್ದರೂ, T ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟದ MNA ರೋಗನಿರೋಧಕ CAF ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಪರಿಸರದ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬ ಕಲ್ಪನೆಯನ್ನು ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತವೆ.
MNA ಸಾಗಣೆದಾರರ ಕಡಿಮೆ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಟ್ಟ ಮತ್ತು MNA ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಪ್ರಮುಖ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗದ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಗಮನಿಸಿದರೆ, T ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ MNA ಇರುವಿಕೆಯು ಅನಿರೀಕ್ಷಿತವಾಗಿದೆ. NNMT ಅಥವಾ AOX1 ಅನ್ನು scRNA-seq ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು ಎರಡು ಸ್ವತಂತ್ರ ಸಮೂಹಗಳ ಗುರಿ qPCR ಮೂಲಕ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗಲಿಲ್ಲ. ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು MNA ಅನ್ನು T ಜೀವಕೋಶಗಳಿಂದ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ, ಆದರೆ ಸುತ್ತಮುತ್ತಲಿನ TME ನಿಂದ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳಲಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಪ್ರಯೋಗಗಳು T ಜೀವಕೋಶಗಳು ಬಾಹ್ಯ MNA ಅನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ.
ನಮ್ಮ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಅಧ್ಯಯನಗಳು, ಬಾಹ್ಯ MNA T ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ TNFα ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು TNFα ಪ್ರವರ್ತಕಕ್ಕೆ Sp1 ನ ಬಂಧನವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿವೆ. TNFα ಆಂಟಿ-ಟ್ಯೂಮರ್ ಮತ್ತು ಆಂಟಿ-ಟ್ಯೂಮರ್ ಕಾರ್ಯಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದರೂ, ಅಂಡಾಶಯದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ನಲ್ಲಿ, TNFα ಅಂಡಾಶಯದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ನ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ (31-33). ಅಂಡಾಶಯದ ಗೆಡ್ಡೆ ಕೋಶ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯಲ್ಲಿ TNFα ನ ತಟಸ್ಥೀಕರಣ ಅಥವಾ ಮೌಸ್ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ TNFα ಸಿಗ್ನಲ್‌ನ ನಿರ್ಮೂಲನೆಯು TNFα-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ಉರಿಯೂತದ ಸೈಟೊಕಿನ್ ಉತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ (32, 35). ಆದ್ದರಿಂದ, ಈ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, TME-ಪಡೆದ MNA ಆಟೋಕ್ರೈನ್ ಲೂಪ್ ಮೂಲಕ TNFα-ಅವಲಂಬಿತ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನದ ಮೂಲಕ ಉರಿಯೂತದ ಪರ ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ಆಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಅಂಡಾಶಯದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಸಂಭವಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಹರಡುವಿಕೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ (31). ಈ ಸಾಧ್ಯತೆಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ, TNFα ದಿಗ್ಬಂಧನವನ್ನು ಅಂಡಾಶಯದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ಗೆ ಸಂಭಾವ್ಯ ಚಿಕಿತ್ಸಕ ಏಜೆಂಟ್ ಆಗಿ ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತಿದೆ (37, 48, 49). ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, MNA ಅಂಡಾಶಯದ ಗೆಡ್ಡೆಯ ಕೋಶಗಳಿಗೆ CAR-T ಕೋಶಗಳ ಸೈಟೊಟಾಕ್ಸಿಸಿಟಿಯನ್ನು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು MNA-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ನಿಗ್ರಹಕ್ಕೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ. ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಗೆಡ್ಡೆಗಳು ಮತ್ತು CAF ಕೋಶಗಳು MNA ಅನ್ನು ಬಾಹ್ಯಕೋಶೀಯ TME ಆಗಿ ಸ್ರವಿಸುವ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ. (i) TNF-ಪ್ರೇರಿತ ಅಂಡಾಶಯದ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಪ್ರಚೋದನೆ ಮತ್ತು (ii) MNA-ಪ್ರೇರಿತ T ಕೋಶ ಸೈಟೋಟಾಕ್ಸಿಕ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಪ್ರತಿಬಂಧದ ಮೂಲಕ, ಇದು ಡ್ಯುಯಲ್ ಟ್ಯೂಮರ್ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಹೊಂದಿರಬಹುದು (ಚಿತ್ರ 5D).
ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ, ಕ್ಷಿಪ್ರ ಕೋಶ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ, ಏಕ-ಕೋಶ ಅನುಕ್ರಮ ಮತ್ತು ಚಯಾಪಚಯ ಪ್ರೊಫೈಲಿಂಗ್‌ನ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸುವ ಮೂಲಕ, ಈ ಅಧ್ಯಯನವು HGSC ರೋಗಿಗಳಲ್ಲಿ ಗೆಡ್ಡೆಗಳು ಮತ್ತು ಅಸ್ಸೈಟ್ಸ್ ಕೋಶಗಳ ನಡುವಿನ ಬೃಹತ್ ಇಮ್ಯುನೊಮೆಟಾಬಾಲೋಮಿಕ್ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು. ಈ ಸಮಗ್ರ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಟಿ ಕೋಶಗಳ ನಡುವೆ ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಸೇವನೆ ಮತ್ತು ಮೈಟೊಕಾಂಡ್ರಿಯಲ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯಲ್ಲಿ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳಿವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ ಮತ್ತು MNA ಅನ್ನು ಕೋಶೇತರ ಸ್ವಾಯತ್ತ ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ನಿಯಂತ್ರಕ ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ಎಂದು ಗುರುತಿಸಿದೆ. ಈ ಡೇಟಾವು ಮಾನವ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಟಿ ಕೋಶ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಯ ಮೇಲೆ ಟಿಎಂಇ ಹೇಗೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ ಎಂಬುದರ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ. ಟಿ ಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಕೋಶಗಳ ನಡುವಿನ ಪೋಷಕಾಂಶಗಳಿಗೆ ನೇರ ಸ್ಪರ್ಧೆಯನ್ನು ವರದಿ ಮಾಡಲಾಗಿದ್ದರೂ, ಗೆಡ್ಡೆಯ ಪ್ರಗತಿಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಲು ಮತ್ತು ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ನಿಗ್ರಹಿಸಲು ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್‌ಗಳು ಪರೋಕ್ಷ ನಿಯಂತ್ರಕಗಳಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಬಹುದು. ಈ ನಿಯಂತ್ರಕ ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್‌ಗಳ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಪಾತ್ರದ ಮತ್ತಷ್ಟು ವಿವರಣೆಯು ಆಂಟಿ-ಟ್ಯೂಮರ್ ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಪರ್ಯಾಯ ತಂತ್ರಗಳನ್ನು ತೆರೆಯಬಹುದು.
ಕೆನಡಿಯನ್ ಟಿಶ್ಯೂ ರೆಪೊಸಿಟರಿ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಿದ BC ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಟ್ಯೂಮರ್ ಟಿಶ್ಯೂ ರೆಪೊಸಿಟರಿಯ ಮೂಲಕ ರೋಗಿಯ ಮಾದರಿಗಳು ಮತ್ತು ಕ್ಲಿನಿಕಲ್ ಡೇಟಾವನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ. BC ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ರಿಸರ್ಚ್ ಎಥಿಕ್ಸ್ ಕಮಿಟಿ ಮತ್ತು ಬ್ರಿಟಿಷ್ ಕೊಲಂಬಿಯಾ ವಿಶ್ವವಿದ್ಯಾಲಯ (H07-00463) ಅನುಮೋದಿಸಿದ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಪ್ರಕಾರ, ಎಲ್ಲಾ ರೋಗಿಗಳ ಮಾದರಿಗಳು ಮತ್ತು ಕ್ಲಿನಿಕಲ್ ಡೇಟಾವನ್ನು ಮಾಹಿತಿಯುಕ್ತ ಲಿಖಿತ ಒಪ್ಪಿಗೆಯನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ ಅಥವಾ ಔಪಚಾರಿಕವಾಗಿ ಅವರ ಒಪ್ಪಿಗೆಯನ್ನು ಮನ್ನಾ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕೃತ ಬಯೋಬ್ಯಾಂಕ್ (BRC-00290) ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ. ವಿವರವಾದ ರೋಗಿಯ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಕೋಷ್ಟಕಗಳು S1 ಮತ್ತು S5 ನಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಕ್ರಯೋಪ್ರೆಸರ್ವೇಶನ್‌ಗಾಗಿ, ರೋಗಿಯ ಗೆಡ್ಡೆಯ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಯಾಂತ್ರಿಕವಾಗಿ ಕೊಳೆಯಲು ಮತ್ತು ನಂತರ ಒಂದೇ ಕೋಶ ಅಮಾನತು ಪಡೆಯಲು 100-ಮೈಕ್ರಾನ್ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮೂಲಕ ತಳ್ಳಲು ಸ್ಕಾಲ್ಪೆಲ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ಉಂಡೆಗಳಾಗಿ ಮಾಡಲು ಮತ್ತು ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ರೋಗಿಯ ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು 1500 rpm ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಗೆಡ್ಡೆ ಮತ್ತು ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳಿಂದ ಪಡೆದ ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು 50% ಶಾಖ-ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿದ ಮಾನವ AB ಸೀರಮ್ (ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್), 40% RPMI-1640 (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಮತ್ತು 10% ಡೈಮೀಥೈಲ್ ಸಲ್ಫಾಕ್ಸೈಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಕ್ರಯೋಪ್ರಿಜರ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಈ ಸಂರಕ್ಷಿತ ಏಕ ಕೋಶ ಅಮಾನತುಗಳನ್ನು ಕರಗಿಸಿ ಕೆಳಗೆ ವಿವರಿಸಿದ ಚಯಾಪಚಯ ಮತ್ತು ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ನಿರ್ಣಯಕ್ಕಾಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು.
ಸಂಪೂರ್ಣ ಮಾಧ್ಯಮವು 0.22 μm ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಿದ 50:50 ಪೂರಕ RPMI 1640: AimV ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ. RPMI 1640 + 2.05 mM l-ಗ್ಲುಟಾಮಿನ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಅನ್ನು 10% ಶಾಖ-ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸದ ಮಾನವ AB ಸೀರಮ್ (ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್), 12.5 mM ಹೆಪ್ಸ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್), 2 mM l-ಗ್ಲುಟಾಮಿನ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್), 1 x ಪೆನ್ಸಿಲಿನ್ ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟೊಮೈಸಿನ್ (ಪೆನ್‌ಸ್ಟ್ರೆಪ್) ದ್ರಾವಣ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಮತ್ತು 50 μMB-ಮರ್ಕ್ಯಾಪ್ಟೊಇಥೆನಾಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕವಾಗಿದೆ. AimV (ಇನ್ವಿಟ್ರೋಜೆನ್) ಅನ್ನು 20 mM ಹೆಪ್ಸ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಮತ್ತು 2 mM l-ಗ್ಲುಟಾಮಿನ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕವಾಗಿದೆ. ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೀಟರ್ ಸ್ಟೇನಿಂಗ್ ಬಫರ್ 0.22μm ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಿದ ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬಫರ್ಡ್ ಸಲೈನ್ (PBS; ಇನ್ವಿಟ್ರೋಜೆನ್) ಅನ್ನು 3% ಶಾಖ-ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸದ AB ಮಾನವ ಸೀರಮ್ (ಸಿಗ್ಮಾ) ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕವಾಗಿದೆ. ಜೀವಕೋಶ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ಬಫರ್ 0.22μm ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಿದ PBS ನಿಂದ ಕೂಡಿದೆ ಮತ್ತು 0.5% ಶಾಖ-ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸದ ಮಾನವ AB ಸೀರಮ್ (ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕವಾಗಿದೆ.
37°C ಸಂಪೂರ್ಣ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ, ಕೋಶಗಳನ್ನು 10 nM MT DR ಮತ್ತು 100 μM 2-NBDG ಯೊಂದಿಗೆ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಲೆ ಹಾಕಲಾಯಿತು. ಮುಂದೆ, ಕೋಶಗಳನ್ನು 4°C ನಲ್ಲಿ 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ viability dye eF506 ನೊಂದಿಗೆ ಕಲೆ ಹಾಕಲಾಯಿತು. FC ಬ್ಲಾಕ್ (eBioscience) ಮತ್ತು Brillient Stain Buffer (BD Biosciences) ನಲ್ಲಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಮತ್ತೆ ಜೋಡಿಸಿ, ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೀಟರ್ ಸ್ಟೇನಿಂಗ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ (ತಯಾರಕರ ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ) ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿ ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವು ಕೊಡಿ. 4°C ನಲ್ಲಿ ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿ ಸ್ಟೇನಿಂಗ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಗುಂಪಿನೊಂದಿಗೆ (ಟೇಬಲ್ S2) ಕೋಶಗಳನ್ನು ಕಲೆ ಹಾಕಿ. ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಮೊದಲು ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿ ಸ್ಟೇನಿಂಗ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ (ಸೈಟೆಕ್ ಅರೋರಾ; 3L-16V-14B-8R ಕಾನ್ಫಿಗರೇಶನ್) ಕೋಶಗಳನ್ನು ಮತ್ತೆ ಜೋಡಿಸಿ. ಕೋಶ ಎಣಿಕೆ ಡೇಟಾವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫ್ಲೋ ಮತ್ತು ಫ್ಲೋಜೋ V10 ಅನ್ನು ಬಳಸಿ ಮತ್ತು ಡೇಟಾವನ್ನು ರಚಿಸಲು ಗ್ರಾಫ್‌ಪ್ಯಾಡ್ ಪ್ರಿಸಂ 8 ಅನ್ನು ಬಳಸಿ. 2-NBDG ಮತ್ತು MT DR ನ ಸರಾಸರಿ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ತೀವ್ರತೆ (MFI) ಅನ್ನು ಲಾಗ್-ಸಾಮಾನ್ಯಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ ರೋಗಿಗಳನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲು ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಜೋಡಿಯಾದ t ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ 40 ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಘಟನೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಎಲ್ಲಾ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ; ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು ಡೇಟಾ ದೃಶ್ಯೀಕರಣವನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುವ ಮೊದಲು ಯಾವುದೇ ನಕಾರಾತ್ಮಕ ಮೌಲ್ಯಗಳಿಗೆ 1 ರ MFI ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ನಮೂದಿಸಿ.
ಮೇಲಿನ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆ ಫಲಕದ ಹಸ್ತಚಾಲಿತ ಗೇಟಿಂಗ್ ತಂತ್ರವನ್ನು ಪೂರೈಸಲು, FlowJo ನಲ್ಲಿ ಸತ್ತ ಕೋಶಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿದ ನಂತರ ಜನಸಂಖ್ಯೆಗೆ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತವಾಗಿ ನಿಯೋಜಿಸಲು ನಾವು ಆಕಾರ ನಿರ್ಬಂಧ ಮರ (FAUST) (21) ನಿಂದ ಪೂರ್ಣ ಟಿಪ್ಪಣಿಯನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ. ತಪ್ಪಾಗಿ ಹಂಚಿಕೆಯಾಗಿರುವಂತೆ ತೋರುವ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು (PD1+ ಅನ್ನು PD1-ಟ್ಯೂಮರ್ ಕೋಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸುವುದು) ಮತ್ತು ಉಳಿಸಿಕೊಂಡಿರುವ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ವಿಲೀನಗೊಳಿಸಲು ನಾವು ಔಟ್‌ಪುಟ್ ಅನ್ನು ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತೇವೆ. ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಯು ಒಟ್ಟು 11 ಜನಸಂಖ್ಯೆಗೆ ಸರಾಸರಿ 2% ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಕೋಶಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ.
ಫಿಕಾಲ್ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿತ್ವವನ್ನು ಲ್ಯುಕೋಸೈಟ್ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ ಉತ್ಪನ್ನಗಳಿಂದ (STEMCELL ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್) PBMC ಯನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸಲು ಬಳಸಲಾಯಿತು. CD8 + T ಕೋಶಗಳನ್ನು CD8 ಮೈಕ್ರೋಬೀಡ್ಸ್ (ಮಿಲ್ಟೆನಿ) ಬಳಸಿ PBMC ಯಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ತಯಾರಕರ ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ 2 ವಾರಗಳ ಕಾಲ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಆಕ್ಟ್ (ಮಿಲ್ಟೆನಿ) ಬಳಸಿ ಸಂಪೂರ್ಣ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ವಿಸ್ತರಿಸಲಾಯಿತು. IL-7 (10 ng/ml; ಪೆಪ್ರೊಟೆಕ್) ಹೊಂದಿರುವ ಸಂಪೂರ್ಣ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು 5 ದಿನಗಳವರೆಗೆ ನಿಲ್ಲಲು ಅನುಮತಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಆಕ್ಟ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಮರು-ಉತ್ತೇಜಿಸಲಾಯಿತು. 7 ನೇ ದಿನದಂದು, ತಯಾರಕರ ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ, ಮಾನವ CD45 ಮೈಕ್ರೋಬೀಡ್ಸ್ (ಮಿಲ್ಟೆನಿ) ಅನ್ನು ಸತತ ಮೂರು ಸುತ್ತುಗಳಲ್ಲಿ ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ಉತ್ಕೃಷ್ಟಗೊಳಿಸಲು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಕೋಶಗಳನ್ನು ಹರಿವಿನ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ (ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ) ಮತ್ತು LC-MS/MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಒಂದು ಮಿಲಿಯನ್ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಮೂರು ಬಾರಿ ಅಲ್ಟೆನಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಕೆಳಗೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ LC-MS/MS ಮೂಲಕ ಸಂಸ್ಕರಿಸಲಾಯಿತು. ಕಾಣೆಯಾದ ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ಮೌಲ್ಯವನ್ನು 1,000 ಅಯಾನು ಸಂಖ್ಯೆಯೊಂದಿಗೆ ನಾವು ಅಂದಾಜು ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ. ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಮಾದರಿಯನ್ನು ಒಟ್ಟು ಅಯಾನು ಸಂಖ್ಯೆಯಿಂದ (TIC) ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಮೊದಲು ಮೆಟಾಬೊಅನಾಲಿಸ್ಟ್‌ಆರ್‌ನಲ್ಲಿ ಲಾಗರಿಥಮಿಕ್ ಆಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತವಾಗಿ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಪ್ರತಿ ರೋಗಿಯ ಏಕ ಕೋಶ ಅಮಾನತುಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಕರಗಿಸಿ 40 μm ಫಿಲ್ಟರ್ ಮೂಲಕ ಸಂಪೂರ್ಣ ಮಾಧ್ಯಮಕ್ಕೆ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು (ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ). ತಯಾರಕರ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಪ್ರಕಾರ, ಮೈಕ್ರೋಬೀಡ್ಸ್ (ಮಿಲ್ಟೆನಿ) ಬಳಸಿ ಮ್ಯಾಗ್ನೆಟಿಕ್ ಮಣಿ ಬೇರ್ಪಡಿಸುವಿಕೆಯಿಂದ ಸತತ ಮೂರು ಸುತ್ತಿನ ಧನಾತ್ಮಕ ಆಯ್ಕೆಗಳನ್ನು CD8+, CD4+ ಮತ್ತು CD45- ಕೋಶಗಳಿಗೆ (ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ) ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಲು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಕೋಶಗಳನ್ನು ಕೋಶ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ (ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ) ಮತ್ತೆ ಜೋಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಎಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಕೋಶಗಳನ್ನು 4°C ನಲ್ಲಿ 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಮಾನವ CD8 ಮಣಿಗಳು, ಮಾನವ CD4 ಮಣಿಗಳು ಅಥವಾ ಮಾನವ CD45 ಮಣಿಗಳೊಂದಿಗೆ (ಮಿಲ್ಟೆನಿ) ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಕೋಶ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ಬಫರ್‌ನಿಂದ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮಾದರಿಯನ್ನು LS ಕಾಲಮ್ (ಮಿಲ್ಟೆನಿ) ಮೂಲಕ ರವಾನಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಧನಾತ್ಮಕ ಮತ್ತು ಋಣಾತ್ಮಕ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಅವಧಿಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಮತ್ತು ಕೋಶ ಚೇತರಿಕೆಯ ಹಂತವನ್ನು ಗರಿಷ್ಠಗೊಳಿಸಲು, CD8-ಭಾಗವನ್ನು ನಂತರ CD4+ ಪುಷ್ಟೀಕರಣದ ಎರಡನೇ ಸುತ್ತಿಗೆ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು CD4-ಭಾಗವನ್ನು ನಂತರದ CD45-ಪುಷ್ಟೀಕರಣಕ್ಕೆ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಉದ್ದಕ್ಕೂ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ ಇರಿಸಿ.
ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ತಯಾರಿಸಲು, ಕೋಶಗಳನ್ನು ಒಮ್ಮೆ ಐಸ್-ಕೋಲ್ಡ್ ಉಪ್ಪಿನ ದ್ರಾವಣದಿಂದ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಗೆ 1 ಮಿಲಿ 80% ಮೆಥನಾಲ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ನಂತರ ದ್ರವ ಸಾರಜನಕದಲ್ಲಿ ಸುಳಿಯಾಗಿ ಮತ್ತು ಸ್ನ್ಯಾಪ್ ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಮೂರು ಫ್ರೀಜ್-ಲೇಪ ಚಕ್ರಗಳಿಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 14,000 rpm ನಲ್ಲಿ 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 4°C ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಒಣಗುವವರೆಗೆ ಆವಿಯಾಗುತ್ತದೆ. ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್‌ಗಳನ್ನು 0.03% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲದ 50 μl ನಲ್ಲಿ ಮತ್ತೆ ಕರಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಲು ಸುಳಿಯಾಗಿ ಮತ್ತು ನಂತರ ಶಿಲಾಖಂಡರಾಶಿಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಿರಿ. ಮೆಟಾಬಾಲೊಮಿಕ್ಸ್ ಸಂಶೋಧನೆಗಾಗಿ ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿನ ಕಾರ್ಯಕ್ಷಮತೆಯ ಲಿಕ್ವಿಡ್ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿ ಬಾಟಲಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ. ಬ್ಯಾಚ್ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟಲು ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಒಂದೇ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಕೋಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಲು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಚಿಕಿತ್ಸಾ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ. AB SCIEX QTRAP 5500 ಟ್ರಿಪಲ್ ಕ್ವಾಡ್ರುಪೋಲ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ (50) ನಲ್ಲಿ ಈ ಹಿಂದೆ ಪ್ರಕಟಿಸಲಾದ ಜಾಗತಿಕ ಮೆಟಾಬಾಲೈಟ್‌ಗಳ ಗುಣಾತ್ಮಕ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನವನ್ನು ನಾವು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ. ಮಲ್ಟಿಕ್ವಾಂಟ್ ಆವೃತ್ತಿ 2.1 ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ (ಅಪ್ಲೈಡ್ ಬಯೋಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್ SCIEX) ಬಳಸಿ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಾಫಿಕ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು ಪೀಕ್ ಏರಿಯಾ ಏಕೀಕರಣವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
ಕಾಣೆಯಾದ ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಅಂದಾಜು ಮಾಡಲು 1000 ಅಯಾನು ಎಣಿಕೆಯನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಮಾದರಿ ಸಂಸ್ಕರಣೆಯಿಂದ ವಾದ್ಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ಪರಿಚಯಿಸಲಾದ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಸರಿಪಡಿಸಲು ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಯ TIC ಅನ್ನು ಪತ್ತೆಯಾದ ಪ್ರತಿ ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್‌ನ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಿದ ಗರಿಷ್ಠ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲು ಬಳಸಲಾಯಿತು. TIC ಅನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯಗೊಳಿಸಿದ ನಂತರ, ಮೆಟಾಬೊಅನಾಲಿಸ್ಟ್‌ಆರ್ (51) (ಡೀಫಾಲ್ಟ್ ಪ್ಯಾರಾಮೀಟರ್) ಅನ್ನು ಲಾಗರಿಥಮಿಕ್ ಪರಿವರ್ತನೆ ಮತ್ತು ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ನಾರ್ಮ್ ಲೈನ್ ಸ್ಕೇಲಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮಾದರಿ ಪ್ರಕಾರಗಳ ನಡುವಿನ ಚಯಾಪಚಯ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳ ಪರಿಶೋಧನಾತ್ಮಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಮಾಡಲು ನಾವು ಸಸ್ಯಾಹಾರಿ ಆರ್ ಪ್ಯಾಕೇಜ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಪಿಸಿಎ ಅನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ರೋಗಿಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಭಾಗಶಃ ಪುನರುಕ್ತಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ. ಮಾದರಿಗಳ ನಡುವಿನ ಯೂಕ್ಲಿಡಿಯನ್ ಅಂತರವನ್ನು ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಮಾಡಲು ಶಾಖ ನಕ್ಷೆ ಡೆಂಡ್ರೋಗ್ರಾಮ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ಮಿಸಲು ವಾರ್ಡ್ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿ. ಸಂಪೂರ್ಣ ಜೀವಕೋಶ ಪ್ರಕಾರ ಮತ್ತು ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಪರಿಸರದಲ್ಲಿ ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿ ಹೇರಳವಾಗಿರುವ ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ನಾವು ಪ್ರಮಾಣೀಕೃತ ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್ ಸಮೃದ್ಧಿಯ ಮೇಲೆ ಲಿಮ್ಮಾ (52) ಅನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ. ವಿವರಣೆಯನ್ನು ಸರಳೀಕರಿಸಲು, ಮಾದರಿಯನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟಪಡಿಸಲು ನಾವು ಗುಂಪು ಸರಾಸರಿ ನಿಯತಾಂಕವನ್ನು ಬಳಸುತ್ತೇವೆ ಮತ್ತು ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಪರಿಸರದಲ್ಲಿನ ಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿ ಗುಂಪಾಗಿ ಪರಿಗಣಿಸುತ್ತೇವೆ (n = 6 ಗುಂಪುಗಳು); ಮಹತ್ವ ಪರೀಕ್ಷೆಗಾಗಿ, ನಾವು ಪ್ರತಿ ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್‌ಗೆ ಮೂರು ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಅಳತೆಗಳನ್ನು ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ. ತಪ್ಪು ಪ್ರತಿಕೃತಿಯನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು, ರೋಗಿಯನ್ನು ಲಿಮ್ಮಾ ವಿನ್ಯಾಸದಲ್ಲಿ ಅಡಚಣೆಯಾಗಿ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ವಿಭಿನ್ನ ರೋಗಿಗಳ ನಡುವಿನ ಮೆಟಾಬೊಲೈಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಲು, ನಾವು ರೋಗಿಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಂತೆ ಲಿಮ್ಮಾ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸ್ಥಿರ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಸರಿಹೊಂದಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಪ್ಯಾಡ್ಜ್ <0.05 (ಬೆಂಜಮಿನಿ-ಹಾಚ್‌ಬರ್ಗ್ ತಿದ್ದುಪಡಿ) ನ ಜೀವಕೋಶದ ಪ್ರಕಾರ ಮತ್ತು ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಪರಿಸರದ ನಡುವಿನ ಪೂರ್ವ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟಪಡಿಸಿದ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತತೆಯ ಮಹತ್ವವನ್ನು ನಾವು ವರದಿ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ.
ಮಿಲ್ಟೆನ್ಯಿ ಡೆಡ್ ಸೆಲ್ ರಿಮೂವಲ್ ಕಿಟ್ (> 80% ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯತೆ) ಬಳಸಿ ಚೈತನ್ಯ ಪುಷ್ಟೀಕರಣದ ನಂತರ, 10x 5′ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಬಳಸಿ ಒಟ್ಟು ಲೈವ್ ಫ್ರೋಜನ್ ಅಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಏಕ-ಕೋಶ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ ಗೆಡ್ಡೆಗಳು ಮತ್ತು ಅಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಐದು ಪ್ರಕರಣಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು, ಆದಾಗ್ಯೂ ಒಂದು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಮಾದರಿಯಿಂದ ಕಡಿಮೆ ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯತೆಯು ಅದರ ಸೇರ್ಪಡೆಯನ್ನು ತಡೆಯಿತು. ರೋಗಿಗಳ ಬಹು ಆಯ್ಕೆಗಳನ್ನು ಸಾಧಿಸಲು, ನಾವು 10x ಕ್ರೋಮಿಯಂ ನಿಯಂತ್ರಕದ ಲೇನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿ ರೋಗಿಯ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಅಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಸ್ಥಳಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಿದ ನಂತರ [ಇಲ್ಯುಮಿನಾ ಹೈಸೆಕ್ 4000 28×98 ಬಿಪಿ ಜೋಡಿ ತುದಿ (PE), ಕ್ವಿಬೆಕ್ ಜೀನೋಮ್; ಗೆಡ್ಡೆ ಮತ್ತು ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಕ್ರಮವಾಗಿ ಪ್ರತಿ ಕೋಶಕ್ಕೆ ಸರಾಸರಿ 73,488 ಮತ್ತು 41,378 ಓದುವಿಕೆಗಳು]], ನಾವು CellSNP ಮತ್ತು Vireo (53) ಅನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ (CellSNP ಆಧರಿಸಿ GRCh38 ಒದಗಿಸಿದ ಸಾಮಾನ್ಯ ಮಾನವ SNP (VCF) ದಾನಿ ಗುರುತನ್ನು ನಿಗದಿಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ. ರೋಗಿಯ ಜೀನೋಟೈಪ್ ಸ್ಥಿತಿಯ (IBS) ಹತ್ತಿರದ ಗುರುತನ್ನು (IBS) ಊಹಿಸಲು ನಾವು SNPRelate ಅನ್ನು ಬಳಸುತ್ತೇವೆ, ಡ್ಯುಪ್ಲೆಕ್ಸ್‌ಗಳಾಗಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ನಿಯೋಜಿಸದ ಜೀವಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು ಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯ ಮಾದರಿಗಳ ನಡುವೆ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ ದಾನಿಗಳನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸಿ (54). ಈ ಕಾರ್ಯದ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ, ನಾವು ಡೌನ್‌ಸ್ಟ್ರೀಮ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಗೆಡ್ಡೆ ಮತ್ತು ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಹೇರಳವಾದ ಕೋಶ ಪ್ರಾತಿನಿಧ್ಯದೊಂದಿಗೆ ಮೂರು ಪ್ರಕರಣಗಳನ್ನು ಉಳಿಸಿಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ. ಸ್ಕ್ಯಾಟರ್ (55) ಮತ್ತು ಸ್ಕ್ರಾನ್ (56) ಬಯೋಕಂಡಕ್ಟರ್ ಪ್ಯಾಕೇಜಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಾಮೂಹಿಕ ಶೋಧನೆ ಹಂತವನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿದ ನಂತರ, ಇದು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ 6975 ಕೋಶಗಳನ್ನು (ಕ್ರಮವಾಗಿ ಗೆಡ್ಡೆ ಮತ್ತು ಅಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳಿಂದ 2792 ಮತ್ತು 4183 ಕೋಶಗಳು) ನೀಡಿತು. ನಾವು ಹಂಚಿಕೆಯ ಹತ್ತಿರದ ನೆರೆಹೊರೆಯ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್ (SNN) ನ ಐಗ್ರಾಫ್‌ನ (57) ಲೌವೈನ್ ಕ್ಲಸ್ಟರಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುತ್ತೇವೆ. ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಮೂಲಕ ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಜಾಕಾರ್ಡ್ ಅಂತರವನ್ನು ಆಧರಿಸಿದೆ. ಮಾರ್ಕರ್ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗಳನ್ನು ಊಹಾತ್ಮಕ ಕೋಶ ಪ್ರಕಾರಗಳಿಗೆ ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ಟಿಪ್ಪಣಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು t-SNE ನೊಂದಿಗೆ ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸೈಟೊಟಾಕ್ಸಿಕ್ ಟಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು CD8A ಮತ್ತು GZMA ಯ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಿಂದ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲಾಗಿದೆ, ಕಡಿಮೆ ರೈಬೋಸೋಮಲ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯೊಂದಿಗೆ ಸಬ್‌ಕ್ಲಸ್ಟರ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸಿ. ಇಜರ್ ಮತ್ತು ಇತರರ (16) ಪ್ರಕಟಿತ ಡೇಟಾವನ್ನು ನಾವು ಪ್ರವೇಶಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಅವುಗಳ t-SNE ಎಂಬೆಡಿಂಗ್ ಸೇರಿದಂತೆ, ರೋಗನಿರೋಧಕ ಕೋಶ ಗುರುತುಗಳು ಮತ್ತು NNMT ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ನಡುವಿನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಅತಿಕ್ರಮಣವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಬಹುದು.
ಫಿಕಾಲ್ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಡೆನ್ಸಿಟಿ ಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಗೇಶನ್ ಮೂಲಕ ಲ್ಯುಕೋಸೈಟ್ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ ಉತ್ಪನ್ನಗಳಿಂದ (ಸ್ಟೆಮ್ಸೆಲ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್) PBMC ಅನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು. CD3 ಮಣಿಗಳನ್ನು (ಮಿಲ್ಟೆನ್ಯಿ) ಬಳಸಿಕೊಂಡು CD3 + ಕೋಶಗಳನ್ನು PBMC ಯಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಯಿತು. MNA ಇರುವಿಕೆ ಅಥವಾ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ, CD3+ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಪ್ಲೇಟ್-ಬೌಂಡ್ CD3 (5μg/ml), ಕರಗುವ CD28 (3μg/ml) ಮತ್ತು IL-2 (300 U/ml; ಪ್ರೊಲ್ಯುಕಿನ್) ನೊಂದಿಗೆ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. ವಿಸ್ತರಣೆಯ ಕೊನೆಯ ದಿನದಂದು, ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯತೆ (ಫಿಕ್ಸಬಲ್ ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯತೆ ಡೈ eFluor450, eBioscience) ಮತ್ತು ಪ್ರಸರಣ (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) ಅನ್ನು ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿ ಮೂಲಕ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಗಾಲ್ಗಿಸ್ಟಾಪ್‌ನೊಂದಿಗೆ PMA (20 ng/ml) ಮತ್ತು ಅಯಾನೊಮೈಸಿನ್ (1μg/ml) ಹೊಂದಿರುವ ಕೋಶಗಳನ್ನು 4 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಉತ್ತೇಜಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) ಮತ್ತು TNFα-ಫ್ಲೋರೊಸೆಸಿನ್ ಐಸೊಥಿಯೊಸೈನೇಟ್ (FITC) (MAb11, BD) ಗಳನ್ನು ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಎಫೆಕ್ಟರ್ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಿ. 4 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ PMA (20 ng/ml) ಮತ್ತು ಅಯಾನೊಮೈಸಿನ್ (1μg/ml) ನೊಂದಿಗೆ qPCR ಮತ್ತು ChIP ಕೋಶಗಳನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಿ. PMA (20 ng/ml) ಮತ್ತು ಅಯಾನೊಮೈಸಿನ್ (1 μg/ml) ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ಮೊದಲು ಮತ್ತು ನಂತರ ELISA ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು 4 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ಬಳಸಿಕೊಂಡು RNA ಅನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ತಯಾರಕರ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಅನ್ನು ಅನುಸರಿಸಿ. ಮಾದರಿಯನ್ನು ಏಕರೂಪಗೊಳಿಸಲು QIAshredder (QIAGEN) ಬಳಸಿ. ಪೂರಕ DNA (cDNA) ಅನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಮರ್ಥ್ಯದ RNA ನಿಂದ cDNA ಕಿಟ್ (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಬಳಸಿ. ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು (ತಯಾರಕರ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಪ್ರಕಾರ) ಈ ಕೆಳಗಿನ ಪ್ರೋಬ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲು TaqMan Rapid Advanced Master Mix (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಬಳಸಿ: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [ಗ್ಲೈಸೆರಾಲ್ಡಿಹೈಡ್-3-ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಆಫ್ ಹೈಡ್ರೋಜನ್ (GAPDH)] ಮತ್ತು Hs01010726_m1 (SLC22A2). ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಮೈಕ್ರೋಆಂಪ್ ಆಪ್ಟಿಕಲ್ ಫಿಲ್ಮ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಮೈಕ್ರೋಆಂಪ್ ಫಾಸ್ಟ್ ಆಪ್ಟಿಕಲ್ 96-ವೆಲ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್ ಪ್ಲೇಟ್ (ಅಪ್ಲೈಡ್ ಬಯೋಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್) ನಲ್ಲಿ ಸ್ಟೆಪ್‌ಒನ್‌ಪ್ಲಸ್ ರಿಯಲ್-ಟೈಮ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ (ಅಪ್ಲೈಡ್ ಬಯೋಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್) (ಅಪ್ಲೈಡ್ ಬಯೋಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್) ನಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು. 35 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ Ct ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಪತ್ತೆ ಮಿತಿಗಿಂತ ಮೇಲಿರುವಂತೆ ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅದನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗದು ಎಂದು ಗುರುತಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ChIP ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿ (58). ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಕೋಶಗಳನ್ನು ಫಾರ್ಮಾಲ್ಡಿಹೈಡ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಲಾಯಿತು (ಅಂತಿಮ ಸಾಂದ್ರತೆ 1.42%) ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಐಸ್ ಮೇಲೆ ಪೂರಕವಾದ ಊತ ಬಫರ್ (25 mM ಹೆಪ್ಸ್, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl ಮತ್ತು 0.1% NP-40) ಅನ್ನು ಬಳಸಿ, ನಂತರ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಶನ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಮರುಹೊಂದಿಸಿ (58). ನಂತರ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಈ ಕೆಳಗಿನ ಚಕ್ರಗಳೊಂದಿಗೆ ಸೋನಿಕೇಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು: 10 ಚಕ್ರಗಳು (20 1-ಸೆಕೆಂಡ್ ಪಲ್ಸ್‌ಗಳು) ಮತ್ತು 40 ಸೆಕೆಂಡುಗಳ ಸ್ಥಿರ ಸಮಯ. ChIP-ಗ್ರೇಡ್ ಇಮ್ಯುನೊಗ್ಲಾಬ್ಯುಲಿನ್ G (ಸೆಲ್ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನ; 1μl), ಹಿಸ್ಟೋನ್ H3 (ಸೆಲ್ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನ; 3μl), NFAT (ಇನ್ವಿಟ್ರೋಜನ್; 3μl) ಮತ್ತು SP1 (ಸೆಲ್ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನ; 3μl) ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ 4°CC ಶೇಕ್‌ನಲ್ಲಿ ಮಾದರಿಯೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಿರಿ. ಪ್ರೋಟೀನ್ ಎ ಮಣಿಗಳನ್ನು (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಮಾದರಿಯೊಂದಿಗೆ 4°C ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ ನಿಧಾನವಾಗಿ ಅಲುಗಾಡಿಸಿ, ನಂತರ DNA ಯನ್ನು ಉತ್ಕೃಷ್ಟಗೊಳಿಸಲು ಚೆಲೆಕ್ಸ್ ಮಣಿಗಳನ್ನು (ಬಯೋ-ರಾಡ್) ಬಳಸಿ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಜೀರ್ಣಕ್ರಿಯೆಗಾಗಿ ಪ್ರೋಟೀನೇಸ್ K (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್) ಬಳಸಿ. TNFα ಪ್ರವರ್ತಕವನ್ನು PCR ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಿದೆ: ಫಾರ್ವರ್ಡ್, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; ಇದಕ್ಕೆ ವಿರುದ್ಧವಾಗಿ, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp ಉತ್ಪನ್ನ). ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಇಮೇಜ್ ಲ್ಯಾಬ್ (ಬಯೋ-ರಾಡ್) ನಿರ್ಮಿಸಿದೆ ಮತ್ತು ಇಮೇಜ್‌ಜೆ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಬಳಸಿ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಿದೆ.
ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಕೋಶ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯ ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮಾನವ TNFα ELISA ಕಿಟ್ (ಇನ್ವಿಟ್ರೋಜೆನ್), ಮಾನವ IL-2 ELISA ಕಿಟ್ (ಇನ್ವಿಟ್ರೋಜೆನ್) ಮತ್ತು ಮಾನವ IFN-γ ELISA ಕಿಟ್ (Abcam) ತಯಾರಕರ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ಪ್ರಕಾರ ನಿರ್ಣಯವನ್ನು ಕೈಗೊಳ್ಳಲಾಯಿತು. ತಯಾರಕರ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಪ್ರಕಾರ, ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು TNFα ಮತ್ತು IL-2 ಅನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು 1:100 ಮತ್ತು IFN-γ ಅನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು 1:3 ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ. 450 nm ನಲ್ಲಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯಲು EnVision 2104 ಮಲ್ಟಿಲೇಬಲ್ ರೀಡರ್ (ಪರ್ಕಿನ್ಎಲ್ಮರ್) ಬಳಸಿ.
ಫಿಕಾಲ್ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಡೆನ್ಸಿಟಿ ಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಗೇಶನ್ ಮೂಲಕ ಲ್ಯುಕೋಸೈಟ್ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ ಉತ್ಪನ್ನಗಳಿಂದ (ಸ್ಟೆಮ್ಸೆಲ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್) PBMC ಅನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು. CD3 ಮಣಿಗಳನ್ನು (ಮಿಲ್ಟೆನ್ಯಿ) ಬಳಸಿಕೊಂಡು CD3 + ಕೋಶಗಳನ್ನು PBMC ಯಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಯಿತು. MNA ಇರುವಿಕೆ ಅಥವಾ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ, CD3+ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಪ್ಲೇಟ್-ಬೌಂಡ್ CD3 (5μg/ml), ಕರಗುವ CD28 (3μg/ml) ಮತ್ತು IL-2 (300 U/ml; ಪ್ರೊಲ್ಯುಕಿನ್) ನೊಂದಿಗೆ 3 ದಿನಗಳವರೆಗೆ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. 3 ದಿನಗಳ ನಂತರ, ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ 0.9% ಲವಣಯುಕ್ತದಿಂದ ತೊಳೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪೆಲೆಟ್ ಅನ್ನು ಸ್ನ್ಯಾಪ್ ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. 123 ಕೌಂಟ್ eBeads ಬಳಸಿ ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿ (ಸೈಟೆಕ್ ಅರೋರಾ; 3L-16V-14B-8R ಕಾನ್ಫಿಗರೇಶನ್) ಮೂಲಕ ಜೀವಕೋಶದ ಎಣಿಕೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಚಯಾಪಚಯ ಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಿರಿ. ಒಣಗಿದ ಸಾರವನ್ನು 4000 ಕೋಶ ಸಮಾನ/μl ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಪುನರ್ರಚಿಸಲಾಯಿತು. ರಿವರ್ಸ್ಡ್-ಫೇಸ್ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿ (1290 ಇನ್ಫಿನಿಟಿ II, ಅಜಿಲೆಂಟ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್, ಸಾಂತಾ ಕ್ಲಾರಾ, CA) ಮತ್ತು CORTECS T3 ಕಾಲಮ್ (2.1×150 ಮಿಮೀ, ಕಣ ಗಾತ್ರ 1.6-μm, ರಂಧ್ರದ ಗಾತ್ರ 120-Å; #186008500, ವಾಟರ್ಸ್) ಮೂಲಕ ಮಾದರಿಯನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿ. ಪೋಲಾರ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ (6470, ಅಜಿಲೆಂಟ್), ಇದರಲ್ಲಿ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಪ್ರೇ ಅಯಾನೀಕರಣವು ಧನಾತ್ಮಕ ಕ್ರಮದಲ್ಲಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ. ಮೊಬೈಲ್ ಹಂತ A 0.1% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲ (H2O ನಲ್ಲಿ), ಮೊಬೈಲ್ ಹಂತ B 90% ಅಸಿಟೋನಿಟ್ರೈಲ್, 0.1% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲ. LC ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ 100% A ಗೆ 0 ರಿಂದ 2 ನಿಮಿಷಗಳು, 99% B ಗೆ 2 ರಿಂದ 7.1 ನಿಮಿಷಗಳು ಮತ್ತು 99% B ಗೆ 7.1 ರಿಂದ 8 ನಿಮಿಷಗಳು. ನಂತರ 3 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 0.6 ಮಿಲಿ/ನಿಮಿಷದ ಹರಿವಿನ ದರದಲ್ಲಿ ಮೊಬೈಲ್ ಹಂತ A ಯೊಂದಿಗೆ ಕಾಲಮ್ ಅನ್ನು ಮರು-ಸಮಗೊಳಿಸಿ. ಹರಿವಿನ ಪ್ರಮಾಣ 0.4 ಮಿಲಿ/ನಿಮಿಷ, ಮತ್ತು ಕಾಲಮ್ ಕೊಠಡಿಯನ್ನು 50°C ಗೆ ಬಿಸಿಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಧಾರಣ ಸಮಯ (RT) ಮತ್ತು ರೂಪಾಂತರವನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಲು MNA ಯ ಶುದ್ಧ ರಾಸಾಯನಿಕ ಮಾನದಂಡವನ್ನು (M320995, ಟೊರೊಂಟೊ ಸಂಶೋಧನಾ ರಾಸಾಯನಿಕ ಕಂಪನಿ, ನಾರ್ತ್ ಯಾರ್ಕ್, ಒಂಟಾರಿಯೊ, ಕೆನಡಾ) ಬಳಸಿ (RT = 0.882 ನಿಮಿಷಗಳು, ರೂಪಾಂತರ 1 = 137→94.1, ರೂಪಾಂತರ 2 = 137→92, ಪರಿವರ್ತನೆ 3 = 137→78). ಎಲ್ಲಾ ಮೂರು ಪರಿವರ್ತನೆಗಳು ಸರಿಯಾದ ಧಾರಣ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಸಂಭವಿಸಿದಾಗ, ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಪರಿಮಾಣೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ ಪರಿವರ್ತನೆ 1 ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. MNA (ಟೊರೊಂಟೊ ರಿಸರ್ಚ್ ಕೆಮಿಕಲ್ ಕಂಪನಿ) ಯ ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರರೇಖೆಯನ್ನು ಸ್ಟಾಕ್ ದ್ರಾವಣದ (1 mg/ml) ಆರು ಸರಣಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆಗಳಿಂದ ಉತ್ಪಾದಿಸಲಾಯಿತು, ಇದು ಕ್ರಮವಾಗಿ 0.1, 1.0, 10 ಮತ್ತು 100 ng/ml ಮತ್ತು 1.0 ಮತ್ತು 10μg/ml ದ್ರವದ ಮಾನದಂಡಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಿತು. ಪತ್ತೆ ಮಿತಿ 1 ng/ml, ಮತ್ತು ರೇಖೀಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು 10 ng/ml ಮತ್ತು 10μg/ml ನಡುವೆ ಇರುತ್ತದೆ. ಮಾದರಿ ಮತ್ತು ಮಾನದಂಡದ ಎರಡು ಮೈಕ್ರೋಲೀಟರ್‌ಗಳ ಪ್ರತಿ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಅನ್ನು LC/MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ವಿಶ್ಲೇಷಣಾ ವೇದಿಕೆಯ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಪ್ರತಿ ಎಂಟು ಇಂಜೆಕ್ಷನ್‌ಗಳಿಗೆ ಮಿಶ್ರ ಗುಣಮಟ್ಟದ ನಿಯಂತ್ರಣ ಮಾದರಿಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಎಲ್ಲಾ MNA-ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಪಡೆದ ಜೀವಕೋಶ ಮಾದರಿಗಳ MNA ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ರೇಖೀಯ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿವೆ. MassHunter ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣಾ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ (v9.0, Agilent) ಬಳಸಿ ಡೇಟಾ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಮಾಡಲಾಯಿತು.
ಎರಡನೇ ತಲೆಮಾರಿನ αFR-CAR ರಚನೆಯನ್ನು ಸಾಂಗ್ ಮತ್ತು ಇತರರು (59) ರಿಂದ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಗಿದೆ. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ರಚನೆಯು ಈ ಕೆಳಗಿನ ವಿಷಯಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ: CD8a ಲೀಡರ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್, ಮಾನವ αFR-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಏಕ-ಸರಪಳಿ ವೇರಿಯಬಲ್ ತುಣುಕು, CD8a ಹಿಂಜ್ ಮತ್ತು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಬ್ರೇನ್ ಪ್ರದೇಶ, CD27 ಅಂತರ್ಜೀವಕೋಶ ಡೊಮೇನ್ ಮತ್ತು CD3z ಅಂತರ್ಜೀವಕೋಶ ಡೊಮೇನ್. ಸಂಪೂರ್ಣ CAR ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಜೆನ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಮೂಲಕ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಡಕ್ಷನ್ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲು ಬಳಸುವ GFP ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಕ್ಯಾಸೆಟ್‌ನ ಅಪ್‌ಸ್ಟ್ರೀಮ್‌ನಲ್ಲಿ ಎರಡನೇ ತಲೆಮಾರಿನ ಲೆಂಟಿವೈರಲ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ವೆಕ್ಟರ್‌ಗೆ ಕ್ಲೋನ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು.
ಲೆಂಟಿವೈರಸ್ ಅನ್ನು HEK293T ಕೋಶಗಳ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫೆಕ್ಷನ್ ಮೂಲಕ ಉತ್ಪಾದಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ [ಅಮೇರಿಕನ್ ಟೈಪ್ ಕಲ್ಚರ್ ಕಲೆಕ್ಷನ್ (ATCC); 10% ಭ್ರೂಣದ ಗೋವಿನ ಸೀರಮ್ (FBS) ಮತ್ತು 1% ಪೆನ್‌ಸ್ಟ್ರೆಪ್ ಹೊಂದಿರುವ ಡಲ್ಬೆಕೊದ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಈಗಲ್ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಬೆಳೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು CAR-GFP ವೆಕ್ಟರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ಯಾಕೇಜಿಂಗ್ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ಗಳು (psPAX2 ಮತ್ತು pMD2.G, ಆಡ್‌ಜೀನ್) ಲಿಪೊಫೆಕ್ಷನ್ ಅಮೈನ್ (ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) ಅನ್ನು ಬಳಸುತ್ತವೆ. ವೈರಸ್-ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫೆಕ್ಷನ್ ನಂತರ 48 ಮತ್ತು 72 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅಲ್ಟ್ರಾಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಗೇಶನ್ ಮೂಲಕ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಡಕ್ಷನ್ ತನಕ -80 ° C ನಲ್ಲಿ ಸಾಂದ್ರೀಕೃತ ವೈರಲ್ ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ.
ಫಿಕಾಲ್ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿತ್ವದ ಮೂಲಕ ಆರೋಗ್ಯಕರ ದಾನಿ ಲ್ಯುಕೋಸೈಟ್ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ ಉತ್ಪನ್ನಗಳಿಂದ (STEMCELL ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್) PBMC ಅನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. PBMC ಯಿಂದ CD8+ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ಧನಾತ್ಮಕ ಆಯ್ಕೆ CD8 ಮೈಕ್ರೋಬೀಡ್‌ಗಳನ್ನು (ಮಿಲ್ಟೆನಿ) ಬಳಸಿ. ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಆಕ್ಟ್ (ಮಿಲ್ಟೆನಿ) ಮತ್ತು ಟೆಕ್ಸ್‌ಮ್ಯಾಕ್ಸ್ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಟಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸಿ [ಮಿಲ್ಟೆನಿ; 3% ಶಾಖ-ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿದ ಮಾನವ ಸೀರಮ್, 1% ಪೆನ್‌ಸ್ಟ್ರೆಪ್ ಮತ್ತು IL-2 (300 U/ml)]. ಪ್ರಚೋದನೆಯ ಇಪ್ಪತ್ನಾಲ್ಕು ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ, ಟಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಲೆಂಟಿವೈರಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಡ್ಯೂಸ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು (ಪ್ರತಿ 106 ಕೋಶಗಳಿಗೆ 10 μl ಕೇಂದ್ರೀಕೃತ ವೈರಸ್ ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್). ಸೈಟೆಕ್ ಅರೋರಾದಲ್ಲಿ (FSC (ಫಾರ್ವರ್ಡ್ ಸ್ಕ್ಯಾಟರ್)/SSC (ಸೈಡ್ ಸ್ಕ್ಯಾಟರ್), ಸಿಂಗಲೆಟ್, GFP+ ನಲ್ಲಿ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಡಕ್ಷನ್ ನಂತರ 1 ರಿಂದ 3 ದಿನಗಳ ನಂತರ, ಕನಿಷ್ಠ 30% ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಡಕ್ಷನ್ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲು ಜೀವಕೋಶಗಳ GFP ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಿ.
CAR-T ಕೋಶಗಳನ್ನು ಇಮ್ಯುನೊಕಲ್ಟ್ (STEMCELL ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್; 1% ಪೆನ್‌ಸ್ಟ್ರೆಪ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕ) ನಲ್ಲಿ 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಈ ಕೆಳಗಿನ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಕಲ್ಚರ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು: ಸಂಸ್ಕರಿಸದ, 250 μM ಅಡೆನೊಸಿನ್ ಅಥವಾ 10 mM MNA ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಲಾಯಿತು. ಪೂರ್ವ-ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ನಂತರ, CAR-T ಕೋಶಗಳನ್ನು PBS ನೊಂದಿಗೆ ತೊಳೆದು 20,000 SK-OV-3 ಕೋಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಯಿತು [ATCC; ಮೆಕಾಯ್ 5A ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ (ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) 10% FBS ಮತ್ತು 1% ಪೆನ್‌ಸ್ಟ್ರೆಪ್‌ನೊಂದಿಗೆ 10 ನಲ್ಲಿ ಪೂರಕವಾಗಿದೆ: 1 ರ ಗುರಿ ಅನುಪಾತಕ್ಕೆ ಪರಿಣಾಮಕಾರಕವನ್ನು ಪೂರಕ ಇಮ್ಯುನೊಕಲ್ಟ್ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ತ್ರಿವಳಿಗಳಲ್ಲಿ ವರ್ಧಿಸಲಾಗಿದೆ. SK-OV-3 ಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು ಡಿಜಿಟಲಿಸ್ ಸಪೋನಿನ್ (0.5mg/ml; ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) ನೊಂದಿಗೆ ಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾದ SK-OV-3 ಕೋಶಗಳನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ ಋಣಾತ್ಮಕ ಮತ್ತು ಧನಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣಗಳಾಗಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು. 24 ಗಂಟೆಗಳ ಸಹ-ಕೃಷಿಯ ನಂತರ, ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ತಯಾರಕರ ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಲ್ಯಾಕ್ಟೇಟ್ ಡಿಹೈಡ್ರೋಜಿನೇಸ್ (LDH) ಅನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಯಿತು (LDH ಗ್ಲೋ ಸೈಟೋಟಾಕ್ಸಿಸಿಟಿ ಅಸ್ಸೇ ಕಿಟ್, ಪ್ರೊಮೆಗಾ). LDH ಸೂಪರ್‌ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು LDH ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ 1:50 ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. ಕೊಲ್ಲುವಿಕೆಯ ಶೇಕಡಾವಾರು ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಈ ಕೆಳಗಿನ ಸೂತ್ರವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ: ಕೊಲ್ಲುವಿಕೆಯ ಶೇಕಡಾವಾರು = ತಿದ್ದುಪಡಿಯ ಶೇಕಡಾವಾರು / ಗರಿಷ್ಠ ಕೊಲ್ಲುವಿಕೆಯ ದರ x 100%, ಇಲ್ಲಿ ತಿದ್ದುಪಡಿಯ ಶೇಕಡಾವಾರು = ಸಹ-ಸಂಸ್ಕೃತಿ-T ಕೋಶಗಳು ಮಾತ್ರ, ಮತ್ತು ಗರಿಷ್ಠ ಕೊಲ್ಲುವಿಕೆಯ ದರ = ಧನಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣ-ಋಣಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣ.
ಪಠ್ಯ ಅಥವಾ ಸಾಮಗ್ರಿಗಳು ಮತ್ತು ವಿಧಾನಗಳಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ, ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಗ್ರಾಫ್‌ಪ್ಯಾಡ್ ಪ್ರಿಸಮ್ 8, ಮೈಕ್ರೋಸಾಫ್ಟ್ ಎಕ್ಸೆಲ್ ಅಥವಾ ಆರ್ v3.6.0 ಅನ್ನು ಬಳಸಿ. ಒಂದೇ ರೋಗಿಯಿಂದ (ಆಸ್ಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಗೆಡ್ಡೆಯಂತಹ) ಬಹು ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿದರೆ, ನಾವು ಜೋಡಿಯಾಗಿರುವ ಟಿ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸುತ್ತೇವೆ ಅಥವಾ ಸೂಕ್ತವಾದಂತೆ ರೇಖೀಯ ಅಥವಾ ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಿದ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ರೋಗಿಯನ್ನು ಸೇರಿಸುತ್ತೇವೆ. ಚಯಾಪಚಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಮೂರು ಬಾರಿ ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಈ ಲೇಖನಕ್ಕೆ ಪೂರಕ ಸಾಮಗ್ರಿಗಳಿಗಾಗಿ, ದಯವಿಟ್ಟು http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 ನೋಡಿ.
ಇದು ಕ್ರಿಯೇಟಿವ್ ಕಾಮನ್ಸ್ ಅಟ್ರಿಬ್ಯೂಷನ್-ವಾಣಿಜ್ಯೇತರ ಪರವಾನಗಿಯ ನಿಯಮಗಳ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ವಿತರಿಸಲಾದ ಮುಕ್ತ ಪ್ರವೇಶ ಲೇಖನವಾಗಿದ್ದು, ಅಂತಿಮ ಬಳಕೆಯು ವಾಣಿಜ್ಯ ಲಾಭಕ್ಕಾಗಿ ಅಲ್ಲದಿರುವವರೆಗೆ ಮತ್ತು ಮೂಲ ಕೃತಿ ಸರಿಯಾಗಿದೆ ಎಂಬ ಪ್ರಮೇಯವಿರುವವರೆಗೆ ಯಾವುದೇ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಬಳಕೆ, ವಿತರಣೆ ಮತ್ತು ಪುನರುತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ. ಉಲ್ಲೇಖ.
ಗಮನಿಸಿ: ನೀವು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಿದ ವ್ಯಕ್ತಿಗೆ ನೀವು ಇಮೇಲ್ ಅನ್ನು ನೋಡಬೇಕೆಂದು ಬಯಸುತ್ತೀರಿ ಮತ್ತು ಅದು ಸ್ಪ್ಯಾಮ್ ಅಲ್ಲ ಎಂದು ತಿಳಿಯುವಂತೆ ನಿಮ್ಮ ಇಮೇಲ್ ವಿಳಾಸವನ್ನು ಒದಗಿಸುವಂತೆ ಮಾತ್ರ ನಾವು ಕೇಳುತ್ತೇವೆ. ನಾವು ಯಾವುದೇ ಇಮೇಲ್ ವಿಳಾಸಗಳನ್ನು ಸೆರೆಹಿಡಿಯುವುದಿಲ್ಲ.
ನೀವು ಸಂದರ್ಶಕರೇ ಎಂಬುದನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ಮತ್ತು ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಸ್ಪ್ಯಾಮ್ ಸಲ್ಲಿಕೆಯನ್ನು ತಡೆಯಲು ಈ ಪ್ರಶ್ನೆಯನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಮಾರಿಸಾ ಕೆ. ಕಿಲ್ಗೌರ್ (ಮಾರಿಸಾ ಕೆ. ಕಿಲ್ಗೌರ್), ಸಾರಾ ಮ್ಯಾಕ್‌ಫೆರ್ಸನ್ (ಸಾರಾ ಮ್ಯಾಕ್‌ಫರ್ಸನ್), ಲಾರೆನ್ ಜಿ. ಜಕಾರಿಯಾಸ್ (ಲಾರೆನ್ ಜಿ. ಜಕಾರಿಯಾಸ್), ಅಬಿಗೈಲ್ ಎಲಿ ಅರಿಸ್ ಜಿ. ವ್ಯಾಟ್ಸನ್ (ಎಚ್. ವ್ಯಾಟ್ಸನ್), ಜಾನ್ ಸ್ಟಾಗ್ (ಜಾನ್ ಸ್ಟಾಗ್), ಬ್ರಾಡ್ ಎಚ್. ನೆಲ್ಸನ್ (ಜಾನ್ ಸ್ಟಾಗ್), ಆರ್. (ರಾಲ್ಫ್ ಜೆ. ಡಿಬೆರಾರ್ಡಿನಿಸ್), ರಸ್ಸೆಲ್ ಜಿ. ಜೋನ್ಸ್ (ರಸ್ಸೆಲ್ ಜಿ. ಜೋನ್ಸ್), ಫಿನೇಸ್ ಟಿ. ಹ್ಯಾಮಿಲ್ಟನ್ (ಫಿನೇಸ್ ಟಿ.
MNA ಟಿ ಕೋಶಗಳ ರೋಗನಿರೋಧಕ ನಿಗ್ರಹಕ್ಕೆ ಕೊಡುಗೆ ನೀಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮಾನವ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಚಿಕಿತ್ಸೆಗೆ ಸಂಭಾವ್ಯ ಇಮ್ಯುನೊಥೆರಪಿ ಗುರಿಯನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ.
ಮಾರಿಸಾ ಕೆ. ಕಿಲ್ಗೌರ್ (ಮಾರಿಸಾ ಕೆ. ಕಿಲ್ಗೌರ್), ಸಾರಾ ಮ್ಯಾಕ್‌ಫೆರ್ಸನ್ (ಸಾರಾ ಮ್ಯಾಕ್‌ಫರ್ಸನ್), ಲಾರೆನ್ ಜಿ. ಜಕಾರಿಯಾಸ್ (ಲಾರೆನ್ ಜಿ. ಜಕಾರಿಯಾಸ್), ಅಬಿಗೈಲ್ ಎಲಿ ಅರಿಸ್ ಜಿ. ವ್ಯಾಟ್ಸನ್ (ಎಚ್. ವ್ಯಾಟ್ಸನ್), ಜಾನ್ ಸ್ಟಾಗ್ (ಜಾನ್ ಸ್ಟಾಗ್), ಬ್ರಾಡ್ ಎಚ್. ನೆಲ್ಸನ್ (ಜಾನ್ ಸ್ಟಾಗ್), ಆರ್. (ರಾಲ್ಫ್ ಜೆ. ಡಿಬೆರಾರ್ಡಿನಿಸ್), ರಸ್ಸೆಲ್ ಜಿ. ಜೋನ್ಸ್ (ರಸ್ಸೆಲ್ ಜಿ. ಜೋನ್ಸ್), ಫಿನೇಸ್ ಟಿ. ಹ್ಯಾಮಿಲ್ಟನ್ (ಫಿನೇಸ್ ಟಿ.
MNA ಟಿ ಕೋಶಗಳ ರೋಗನಿರೋಧಕ ನಿಗ್ರಹಕ್ಕೆ ಕೊಡುಗೆ ನೀಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮಾನವ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ ಚಿಕಿತ್ಸೆಗೆ ಸಂಭಾವ್ಯ ಇಮ್ಯುನೊಥೆರಪಿ ಗುರಿಯನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ.
©2021 ಅಮೇರಿಕನ್ ಅಸೋಸಿಯೇಷನ್ ​​ಫಾರ್ ದಿ ಅಡ್ವಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಟ್ ಆಫ್ ಸೈನ್ಸ್. ಎಲ್ಲಾ ಹಕ್ಕುಗಳನ್ನು ಕಾಯ್ದಿರಿಸಲಾಗಿದೆ. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ಮತ್ತು COUNTER ನ ಪಾಲುದಾರ. ಸೈನ್ಸ್ ಅಡ್ವಾನ್ಸ್ ISSN 2375-2548.